Quantifizierung zellulärer Dichten und antigener Eigenschaften mittels Magnetschwebebahn

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine auf Magnetschwebenutzung basierende Methode, die spezifisch das Vorhandensein von Antigenen, entweder löslich oder membrangebunden, nachweisen kann, indem Änderungen der Levitationshöhe von Auffangperlen mit festen Dichten quantifiziert werden.

Zusammenfassung

Die beschriebene Methode wurde basierend auf den Prinzipien der Magnetschwebebahn entwickelt, die Zellen und Partikel anhand ihrer Dichte und magnetischen Eigenschaften trennt. Dichte ist eine Zelltyp-identifizierende Eigenschaft, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate, Differenzierung und seinem Aktivierungsstatus steht. Die Magnetschwebebahn ermöglicht einen einstufigen Ansatz zur erfolgreichen Trennung, Abbildung und Charakterisierung zirkulierender Blutzellen sowie zur Erkennung von Anämie, Sichelzellenanämie und zirkulierenden Tumorzellen basierend auf Dichte und magnetischen Eigenschaften. Dieser Ansatz ist auch für den Nachweis löslicher Antigene in einer Lösung geeignet, indem Sätze von Perlen niedriger und hoher Dichte verwendet werden, die mit Einfang- bzw. Nachweisantikörpern beschichtet sind. Wenn das Antigen in Lösung vorhanden ist, überbrückt es die beiden Sätze von Perlen und erzeugt einen neuen Perlen-Perlen-Komplex, der zwischen den Reihen der antikörperbeschichteten Perlen schwebt. Eine erhöhte Konzentration des Zielantigens in Lösung erzeugt im Vergleich zu niedrigeren Antigenkonzentrationen eine größere Anzahl von Perlen-Perlen-Komplexen, wodurch quantitative Messungen des Zielantigens ermöglicht werden. Die Magnetschwebebahn ist für andere Methoden aufgrund ihrer verkürzten Probenvorbereitungszeit und der fehlenden Abhängigkeit von klassischen Auslesemethoden vorteilhaft. Das erzeugte Bild kann einfach mit einem Standardmikroskop oder einem mobilen Gerät wie einem Smartphone oder einem Tablet erfasst und analysiert werden.

Einleitung

Die Magnetschwebebahn ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Zelltypen^1,2,3,Proteine^4,5 und Opioide⁶ ausschließlich auf der Grundlage ihrer spezifischen Dichte und paramagnetischen Eigenschaften zu trennen, zu analysieren und zu identifizieren. Die Zelldichte ist eine einzigartige, intrinsische Eigenschaft jedes Zelltyps, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate und seinem Differenzierungsstatus steht^7,8

Protokoll

Das in dieser Studie verwendete experimentelle Protokoll wurde vom Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB) genehmigt.

1. Geräteeinrichtung

HINWEIS: Für die Abbildung schwebender Zellen müssen zwei seltenere Neodym-Magnete, die auf der z-Achse magnetisiert sind, mit demselben Pol zueinander platziert werden, um ein Magnetfeld zu erzeugen. Der Abstand zwischen den Magneten kann in Abhängigkeit von der Intensität des Magnetfeldes und der Dichte der Ziele angepasst werden. In diesem Fall sind die Magnete durch einen 1mm Raum getrennt, der für das Einsetzen eines 50 mm langen 1x1 mm quadrat....

Ergebnisse

Die Magnetschwebebahn fokussiert Objekte unterschiedlicher Dichte bei unterschiedlichen Levitationshöhen, abhängig von der Dichte des Objekts, seiner magnetischen Signatur, der Konzentration der paramagnetischen Lösung und der Stärke des Magnetfeldes, das von zwei starken Seltenerdmagneten erzeugt wird. Da die beiden Magnete übereinander angeordnet sind, können schwebende Proben unter Beibehaltung der Köhler-Beleuchtung nur mit einem zur Seite gedrehten Mikroskop betrachtet werden (Abbildung 1.......

Diskussion

Die Gradientenzentrifugation ist derzeit die Standardtechnik zur Isolierung subzellulärer Komponenten aufgrund ihrer einzigartigen Dichten. Dieser Ansatz erfordert jedoch den Einsatz spezialisierter Gradientenmedien sowie Zentrifugenanlagen. Der hier vorgestellte Magnetschwebeansatz ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften zirkulierender Zellen mit minimaler, wenn überhaupt, Manipulation der Zellen, was einen nahezu in vivo-Zugang zu zirkulierenden Zellen e.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube