Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica

Riepilogo

Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.

Abstract

Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l'antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L'aumento della concentrazione dell'antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell'antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L'immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.

Introduzione

La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule^1,2,3,le proteine^4,5 e gli oppioidi⁶ basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione^{7,8,9,10,11, 12,13,14.} Quantificare i cambiamenti sottili e transitori nella densità cellulare durante le condizioni di stato stazionario e durante una varietà di processi cellulari, potrebbe offrire una visione senza pari della fisiologia cellulare e della fisiopatologia. I cambiamenti nella densità cellulare sono associatialla differenziazione cellulare^15,16,alla progressione del ciclo cellulare^9,17,^18,19,all'apoptosi^20,21,22,23e alla trasformazione maligna^24,25,26 . Pertanto, la quantificazione di specifici cambiamenti nella densità cellulare, può essere utilizzata per differenziare tra cellule di diversi tipi, nonché discriminare tra lo stesso tipo di cellule sottoposte a vari processi di attivazione. Ciò consente esperimenti che prendono di mira una particolare sotto-popolazione cellulare, in cui i cambiamenti dinamici nella densità fungono da indicatore del metabolismo cellulare alterato²⁷. Poiché è stato stabilito che una cellula può alterare la sua densità in risposta a un ambiente mutevole⁷, è imperativo misurare la cinetica della cellula in relazione alla sua densità per comprenderla pienamente, che i metodi attuali potrebbero non fornire¹². La levitazione magnetica, d'altra parte, consente una valutazione dinamica delle cellule e delle loro proprietà²⁸.

Le cellule sono diamagnetiche, il che significa che non hanno un momento di dipolo magnetico permanente. Tuttavia, quando esposto a un campo magnetico esterno, viene generato un debole momento di dipolo magnetico nelle cellule, nella direzione opposta del campo applicato. Pertanto, se le cellule sono sospese in una soluzione paramagnetica ed esposte a un forte campo magnetico verticale, levitano lontano dalla sorgente magnetica e si fermano ad un'altezza, che dipende principalmente dalla loro densità individuale. La levitazione diamagnetica di un oggetto confinato al minimo di un campo magnetico disomogeneo è possibile quando sono soddisfatti i due seguenti criteri: 1) la suscettibilità magnetica della particella deve essere inferiore a quella del mezzo circostante e 2) la forza magnetica deve essere abbastanza forte da controbilanciare la forza di galleggiamento della particella. Entrambi i criteri possono essere soddisfatti sospendendo i globuli rossi in un buffer magnetico e creando forti gradienti di campo magnetico con magneti permanenti piccoli, economici e disponibili in commercio¹. La posizione di equilibrio di una particella intrappolata magneticamente su un asse lungo la direzione di gravità è determinata dalla sua densità (relativa alla densità del buffer), dalla sua suscettibilità magnetica (relativa alla suscettibilità magnetica del buffer) e dalla firma del campo magnetico applicato. Poiché la densità e le proprietà magnetiche della soluzione sono costanti in tutto il sistema, le proprietà di densità intrinseca delle cellule saranno il fattore principale che determina l'altezza di levitazione delle cellule, con cellule più dense che levitano più in basso rispetto alle cellule meno dense. Questo approccio utilizza una serie di due perle di riferimento di densità (1,05 e 1,2 g/ml) che ci consentono di utilizzare un'analisi puntuale precisa e rapportometrica per le misurazioni della densità. L'alterazione della concentrazione della soluzione magnetica consente di isolare diverse popolazioni cellulari, come i globuli rossi dai globuli bianchi, poiché la densità delle cellule circolanti è specifica della cellula, eliminando la necessità di protocolli di isolamento o altre manipolazioni cellulari.

La maggior parte dei metodi di rilevamento utilizzati nella ricerca in biologia si basano sull'estrapolazione di specifici eventi di legame in segnali lineari facili da quantificare. Questi metodi di lettura sono spesso complessi e coinvolgono attrezzature specializzate e personale scientifico dedicato. Un approccio volto alla rilevazione di antigeni trovati sulla membrana plasmatica delle cellule o delle vescicole extracellulari o che sono solubili nel plasma, utilizzando uno o due perle rivestite di anticorpi, è qui descritto. Le peri devono essere di densità diverse l'una dall'altra e da quelle dei bersagli interrogati. La presenza dell'antigene bersaglio in un dato biofluido si traduce in un cambiamento specifico e misurabile nell'altezza di levitazione di una cellula antigene-positiva che è legata a un perla di rilevamento. Nel caso di antigeni solubili o vescicole extracellulari, sono legati sia alle perle di cattura che a quelle di rilevamento, formando un complesso perle-perle piuttosto che un complesso perle-cellula. La variazione dell'altezza di levitazione dipende dalla nuova densità dei complessi perle-cella o perla-perla. Oltre alla variazione dell'altezza di levitazione dei complessi, che indica la presenza di antigene nel biofluido, il numero di complessi dipende anche dalla quantità di bersaglio, rendendo la levitazione magnetica anche un approccio quantitativo per il rilevamento dell'antigene²⁴.

Protocollo

Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Configurazione dello strumento

NOTA: l'imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all'intensità del campo magnetico e alla densità dei bersagli. In questo caso i magneti sono separati da uno spazio di 1mm sufficiente per l'inserimento di un tubo capillare di vetro quadrato 1x1 mm lungo 50 mm. Il dispositivo è stato stampato in 3D utilizzando un design AutoCAD, disponibile su richiesta.

1. Posare il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale.
   NOTA: Un microscopio posto in posizione verticale standard non è direttamente adatto per l'imaging di oggetti levitanti a causa delle posizioni dei magneti rispetto al condensatore e all'obiettivo. Questa limitazione può essere aggirata posando il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale consentendo al condensatore di focalizzare la luce nel capillare e alla lente dell'obiettivo di immaginare la cellula che levita tra i magneti, pur mantenendo i requisiti di illuminazione di Köhler.
2. Supporta e livella il supporto su un tavolo breadboard usando 2 o 3 jack da laboratorio.
3. Per limitare le vibrazioni, appoggiare il tavolo breadboard con piedini in gomma.
4. Rimuovere il palco e sostituirlo con un jack da laboratorio compatto per regolare l'altezza del dispositivo di levitazione(asse y)e due stadi di traslazione a singolo asse; uno per regolare la messa a fuoco(asse z)e il secondo per la scansione del tubo capillare.
5. Collegare il dispositivo di levitazione magnetica al jack da laboratorio utilizzando due montanti ottici della mini-serie.

2. Legame di Anticorpi a Carbossi-Microparticelle/Perline (Modificato da un protocollo da PolyAn)

NOTA: solo le perle a bassa densità (1,05 g/mL) devono essere rivestite per il rilevamento di Rh(+), ma sia le perle ad alta che a bassa densità sono rivestite per il rilevamento di vescicole extracellulari.

1. Eliminare 1 mg equivalente di sospensione di perline e aggiungere 0,5 mL di tampone di attivazione (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg in 1 mL)) pH 5,0 e 0,001% polisorbato-20).
2. Aggiungere 12 μL di EDC da 1,5 M appena prodotto (MW 191,7, 0,28755 g in 1 mL) e 12 μL di 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g in 1 mL) in acqua ghiacciata.
3. Posizionare i tubi su uno shaker orbitale e agitare vigorosamente per 1 ora a temperatura ambiente per attivare i gruppi carbossilici sulle perle.
4. Interrompere l'attivazione dopo 1 ora aggiungendo 0,5 mL di tampone di accoppiamento (10x PBS o 0,1 M fosfato pH 7-9).
5. Pellet le perline centrifugando a 20.000 x g per 10 min, oppure, se le perline non possono essere pellettizzato, utilizzare un filtro a tubo centrifugo da 0,45 μm. Aspirare il surnatante o flow-through.
6. Lavare le perle con 1 mL di 10x PBS 3 volte come nel passaggio 2.5.
7. Calcolare 25 μg di anticorpi per perle mg e mescolare l'anticorpo desiderato con perle attivate a una concentrazione di anticorpi finali di 0,7-1,0 mg/mL in 10X PBS.
8. Posizionare i tubi su un bilanciere a tubo impostato a bassa velocità. Arrotolare delicatamente i tubi a temperatura ambiente durante la notte per l'accoppiamento.
9. Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle due volte con 1 mL di PBS 10x.
10. Lavare con 0,5 mL di etanolamina 1 M (98% stock = 16,2 M) in tampone pH 8,0 con 0,02% polisorbato-20 per 1 ora a temperatura ambiente mentre si agita delicatamente.
11. Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle una volta ogni 1 ml di DPBS. Le perle possono essere conservate in 200 μL di DPBS a 4 °C fino a quando necessario.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Raccolta e preparazione del sangue per il rilevamento di Rh(+)

1. Utilizzando un dispositivo di lancing con un clic, pungere il dito di un donatore rh (+) e raccogliere 10 μL di sangue in 1 mL di DPBS.
2. Macchiare le cellule Rh+ con una macchia di membrana plasmatica fluorescente. Facoltativamente, aggiungere 1 μL di colorante fluorescente alla sospensione da 1 mL di celle Rh+ (diluizione 1:1000).
3. Incubare le cellule con il colorante fluorescente a 37 °C per 15 min.
4. Pellet le celle ruotando a 5.600 x g per 15 s e lavate 3 volte utilizzando 1 mL di DPBS. Spese in 1 mL di HBSS con calcio e magnesio (HBSS++).
5. Utilizzando il dispositivo di lancing con un clic, pungere il dito di un donatore rh (-) e raccogliere 2 μL di sangue.
   NOTA: Se si preparano più di 2 condizioni, raccogliere abbastanza sangue per aggiungere 1 μL di sangue Rh(-) a ciascun tubo.
6. Preparare le provette sperimentali necessarie: sole pere, controllo IgG, campione.
   1. Perle da sole: aggiungere 174 μL di HBSS++, 1 μL di perle di controllo IgG, 1 μL di perle ad alta densità (1,2 g/mL) e 24 μL di 500 mM Gd³⁺ (60 mM).
   2. Controllo IgG: aggiungere 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle di controllo IgG, 1 μL di perle ad alta densità, 1 μL di sangue Rh,1 μL di sospensione ematica Rh+ colorata e 24 μL di 500 mM Gd³⁺.
   3. La provetta del campione aggiunge 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle rivestite anti-RhD, 1 μL di perle ad alta densità, 1 μL di Sangue Rh-, 1 μL di Sospensione Ematica Rh(+) colorata e 24 μL di 500 mM Gd^3+.
      NOTA: le perle ad alta densità vengono aggiunte ai campioni Rh come riferimento.

4. Isolamento di PMN per la dimostrazione della separazione cellulare

1. Isolamento dei neutrofili
   1. Prelevare 40 mL di sangue venoso in una siringa da 60 mL contenente 6 mL di citrato di sodio/acido citrico (0,15 M, pH 5,5) e 14 mL di Destro-70 al 6%.
   2. Attendere 50 minuti affinché il sangue si sedimenti.
   3. Stratifica lentamente le cellule del buffy coat sopra 20 ml di Ficoll-Paque spingendo i primi 18 mL attraverso il tubo di raccolta del sangue in un tubo da 50 ml, evitando la contaminazione con globuli rossi sedimentati. Si consiglia di utilizzare un set di raccolta di sangue fresco, per ridurre al minimo la contaminazione con globuli rossi residui rimasti nel tubo di raccolta del sangue originale.
   4. Pellet le celle buffy coat mediante centrifugazione per 20 min a 3.000 x g. I neutrofili e i globuli rossi contaminanti si pellettino sul fondo del tubo. PBMC formerà uno strato bianco sopra Ficoll-Paque.
   5. Trasferire i neutrofili in un nuovo tubo da 50 ml.
   6. Lisi di eventuali globuli rossi residui incubando i neutrofili con 20 mL di soluzione fredda di NaCl allo 0,2% per 25 secondi, seguiti da ulteriori 20 mL di NaCl all'1,6%. La concertazione finale di NaCl dovrebbe essere dello 0,9% (isotonico).
   7. Centrifugare la sospensione per 10 min a 3.000 x g.
   8. Rimuovere il surnatante e risospendare i neutrofili alla concentrazione desiderata.
2. Isolamento dei linfociti
   1. Placcare i PBMC in RPMI con siero inattivato al calore al 5% in piastre di coltura a 6 pozzi.
   2. Incubare le piastre per 1 ora a 37 °C. I monociti aderiranno alla piastra, i linfociti fluttueranno liberamente.
   3. Rimuovere il tampone contenente i linfociti e lavarlo due volte con RPMI.
   4. Sospendare i linfociti alla concentrazione desiderata.
3. Etichettare globuli rossi, PMN e linfociti.
   1. Etichettare ogni tipo di cellula con un colorante fluorescente diverso. Assicurarsi che ogni colorante fluoresce in un canale diverso. Seguire le istruzioni del produttore per ciascuno dei coloranti scelti.

5. Generazione di vescicole extracellulari RBC tramite l'attivazione del complemento

1. Ottenere sangue intero attraverso la venipuntura utilizzando tubi EDTA.
2. Passare il sangue attraverso un filtro per globuli bianchi, quindi centrifugare 3 volte a 500 x g per 10 minuti ciascuno per isolare i globuli rossi. Utilizzare HBSS++ come tampone di lavaggio.
3. Crea aliquote di globuli rossi confezionati da 100 μL in tubi da 1,5 mL e aumenta il volume a 1 mL aggiungendo HBSS++.
4. Aggiungere C5b,6 a una concentrazione finale di 0,18 μg/mL in HBSS++, quindi vortex.
5. Mettere su uno shaker lento a temperatura ambiente per 15 minuti.
6. Aggiungere la proteina C7 ad una concentrazione finale di 0,2 μg/ml. Mescolare invertendo delicatamente il tubo un paio di volte. Non vortice da questo punto in avanti.
7. Posizionare il tubo su uno shaker a tubo impostato a bassa velocità per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Aggiungere la proteina C8 a una concentrazione finale di 0,2 μg/mL e la proteina C9 a 0,45 μg/mL. Mescolare invertendo delicatamente i tubi un paio di volte.
9. Incubare a 37 °C per 30 min.
10. Centrifugare il tubo a 10.000 x g per 10 min.
11. Raccogliere il surnatante contenente EV in un nuovo tubo o in un nuovo tubo. Non muovere il surnatante troppo vicino al pellet cellulare.

6. Analisi delle cellule sul dispositivo di levitazione magnetica

1. Eseguire l'avvio dello strumento in base alle istruzioni del produttore.
2. Caricare 50 μL di campione in un tubo capillare fino a quando il tubo non viene riempito. Sigillare le estremità del tubo capillare con sigillante capillare assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
3. Caricare il tubo capillare nel supporto tra i magneti superiore e inferiore. Regola il palco e la messa a fuoco per una visualizzazione ottimale.
   NOTA: Le cellule / perle possono impiegare da 5-20 minuti per raggiungere la loro posizione di equilibrio magnetico in base alla loro densità e alla concentrazione di Gd^3+. Maggiore è la concentrazione di Gd³⁺, più breve è il tempo.

Risultati

La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell'oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l'altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l'illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1

Discussione

La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l'uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L'approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un'indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube