כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

Summary

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ריחוף מגנטית שיכולה לזהות באופן ספציפי נוכחות של אנטיגנים, מסיסים או קשורים לממברנה, על ידי כימות שינויים בגובה הריחוף של חרוזי לכידה עם צפיפות קבועה.

Abstract

השיטה המתוארת פותחה על בסיס עקרונות הריחוף המגנטי, המפריד בין תאים וחלקיקים על סמך צפיפותם ומאפייניהם המגנטיים. Density הוא מאפיין מזהה סוג תא, הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו, לבידול ולמצב ההפעלה שלו. ריחוף מגנטי מאפשר גישה חד-שלבית כדי להפריד, לדם ולאפיין בהצלחה תאי דם במחזור, ולזהות אנמיה, מחלת חרמשית ותאי גידול במחזור המבוססים על צפיפות ומאפיינים מגנטיים. גישה זו מקובלת גם על זיהוי אנטיגנים מסיסים הנמצאים בפתרון באמצעות סטים של חרוזים בצפיפות נמוכה וגבוהה מצופים בנוגדנים ללכידה וזיהוי, בהתאמה. אם האנטיגן נמצא בתמיסה, הוא יגשר בין שני סטים של חרוזים, יצירת קומפלקס חרוזים חדש, אשר מרחף בין השורות של חרוזים מצופים נוגדנים. ריכוז מוגבר של האנטיגן היעד בפתרון יפיק מספר גדול יותר של מתחמי חרוזים בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר של אנטיגן, ובכך יאפשר מדידות כמותיות של אנטיגן היעד. ריחוף מגנטי הוא יתרון לשיטות אחרות בשל זמן הכנת המדגם הירידה שלה וחוסר תלות בשיטות קריאה קלאסיות. התמונה שנוצרת נלכדת ומנותחת בקלות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי או מכשיר נייד, כגון טלפון חכם או טאבלט.

Introduction

ריחוף מגנטי הוא טכניקה שפותחה כדי להפריד, לנתח ולזהות סוגי תאים^1,2,3, חלבונים^4,5 ואופיואידים⁶ המבוססים אך ורק על הצפיפות הספציפית שלהם ואת המאפיינים paramagnetic. צפיפות תאים היא מאפיין ייחודי ומהותי של כל סוג תא הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו ומצב הבידול^{שלו 7,8,9,10,11,12,13,14}. כימות שינויים עדינים וחולפים בצפיפות התאים בתנאי מצב קבועים, ובמגוון תהליכי תאים, יכול להרשות לעצמו תובנה שאין שני לה על פיזיולוגיה של תאים ופתופיזיולוגיה. שינויים בצפיפות התא קשורים לבידול תאים^15,16, התקדמות מחזור התא^9,17,18,19, אפופטוזיס^20,21,22,23, ושינוי ממאיר^24,25,26 . לכן, כימות של שינויים ספציפיים בצפיפות התא, יכול לשמש כדי להבדיל בין תאים מסוגים שונים, כמו גם להפלות בין אותו סוג של תאים העוברים תהליכי הפעלה שונים. זה מאפשר ניסויים המתמקדים תת-אוכלוסיית תאים מסוימת, שבו שינויים דינמיים בצפיפות משמש אינדיקטור של חילוף החומרים התא שונה²⁷. כפי שנקבע כי תא עשוי לשנות את צפיפותו בתגובה לסביבה משתנה⁷, זה הכרחי למדוד את הקינטיקה של התא ביחס לצפיפותו כדי להבין אותו באופן מלא, אשר השיטות הנוכחיות לא יכול לספק¹². ריחוף מגנטי לעומת זאת, מאפשר הערכה דינמית של תאים ומאפיינים^{שלהם 28}.

תאים הם דיאמגנטיים כלומר אין להם רגע דיפול מגנטי קבוע. עם זאת, כאשר נחשפים לשדה מגנטי חיצוני, נוצר רגע דיפול מגנטי חלש בתאים, בכיוון ההפוך של השדה המיושם. לכן, אם תאים מושעים בתמיסה פרמגנטית ונחשפים לשדה מגנטי אנכי חזק, הם ירחפו הרחק מהמקור המגנטי ויעצרו לגובה, אשר תלוי בעיקר בצפיפות האישית שלהם. ריחוף דימגנטי של עצם המרותק למינימום של שדה מגנטי אינומוגני אפשרי כאשר שני הקריטריונים הבאים מתקיימים: 1) הרגישות המגנטית של החלקיק חייבת להיות קטנה מזו של המדיום שמסביב, ו -2) הכוח המגנטי חייב להיות חזק מספיק כדי לאזן את כוח הציפה של החלקיק. שני הקריטריונים יכולים להתממש על ידי השעיית RBCs במאגר מגנטי ועל ידי יצירת שיפועי שדה מגנטי חזקים עם מגנטים קבועים קטנים, זולים וזמינים מסחרית¹. מיקום שיווי המשקל של חלקיק לכוד מגנטית על ציר לאורך כיוון הכבידה נקבע על ידי צפיפותו (ביחס לצפיפות המאגר), הרגישות המגנטית שלו (ביחס לרגישות המגנטית של המאגר) וחתימת השדה המגנטי המיושם. מכיוון שהצפיפות והמאפיינים המגנטיים של הפתרון קבועים בכל המערכת, תכונות הצפיפות המהותיות של התאים יהיו הגורם העיקרי הקובע את גובה הריחוף של התאים, כאשר תאים צפופים יותר מרחפים נמוך יותר בהשוואה לתאים צפופים פחות. גישה זו משתמשת בערכה של שני חרוזי התייחסות בצפיפות (1.05 ו- 1.2 גרם/מ"ל) המאפשרים לנו להשתמש בניתוח מדויק ויחסי למדידות צפיפות. שינוי הריכוז של הפתרון המגנטי מאפשר לבודד אוכלוסיות תאיות שונות, כגון RBCs מ- WBCs, שכן צפיפות התאים במחזור היא ספציפית לתא, הסרת הצורך בפרוטוקולי בידוד או מניפולציה אחרת של תאים.

רוב שיטות הזיהוי המשמשות במחקר ביולוגי מסתמכות על אקסטרפולציה של אירועים מחייבים ספציפיים לאותות ליניאריים קלים לכימות. שיטות קריאה אלה הן לעתים קרובות מורכבות וכוללות ציוד מיוחד ואנשי צוות מדעיים ייעודיים. גישה שמטרתה זיהוי של אנטיגנים שנמצאו על קרום הפלזמה של תאים או שלל חוץ תאי או כי הם מסיסים בפלזמה, באמצעות אחד או שניים חרוזים מצופים נוגדן, מתואר בזאת. החרוזים חייבים להיות בצפיפות שונה זה מזה וממטרות שנחקרו. נוכחותו של אנטיגן היעד בכל ביופלואיד נתון מתורגמת לשינוי ספציפי, מדיד בגובה הריחוף של תא אנטיגן חיובי כי הוא קשור חרוז זיהוי. במקרה של אנטיגנים מסיסים או שלל חוץ-תאי, הם קשורים הן לחרוזים ללכוד ולזיהוי, ויוצרות קומפלקס חרוזים ולא קומפלקס של תאי חרוזים. השינוי בגובה הריחוף תלוי בצפיפות החדשה של מתחמי חרוזים או חרוזים. בנוסף לשינוי בגובה הריחוף של המתחמים, המציין את נוכחות האנטיגן בביופלואיד, מספר המתחמים תלוי גם בכמות היעד, מה שהופך את הריחוף המגנטי גם לגישה כמותית לזיהוי אנטיגן²⁴.

Protocol

הפרוטוקול הניסיוני המשמש במחקר זה אושר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס (IRB).

1. התקנת מכשיר

הערה: הדמיה של תאים מרחפים דורשת שני מגנטים נדירים של ניאודימיום אדמה הממוגנטים על ציר z כדי להיות ממוקמים עם אותו מוט אחד מול השני כדי ליצור שדה מגנטי. המרחק בין המגנטים יכול להיות מותאם אישית בהתאם לעוצמת השדה המגנטי וצפיפות המטרות. במקרה זה המגנטים מופרדים על ידי שטח 1 מ"מ מספיק להחדרה של צינור נימי זכוכית מרובע באורך 50 מ"מ 1x1 מ"מ. ההתקן הודפס בתלת-ממד באמצעות עיצוב AutoCAD, הזמין על פי בקשה.

1. הנח מיקרוסקופ על צידו, אופקי לחלוטין.
   הערה: מיקרוסקופ הממוקם בתנוחה זקופה סטנדרטית אינו מתאים ישירות להדמיית עצמים מרחפים בשל מיקומי המגנטים ביחס למחזק ולמטרה. מגבלה זו יכולה להיות עקף על ידי הנחת המיקרוסקופ על צדו, אופקי לחלוטין המאפשר הממקד למקד את האור לתוך נימי, ואת העדשה האובייקטיבית כדי לדמיין את התא מרחף בין המגנטים, תוך שמירה על דרישות תאורת Köhler.
2. תמיכה וחלוקת המעמד על שולחן לוח לחם באמצעות 2 או 3 שקעי מעבדה.
3. כדי להגביל את התנודות, תמוך בשולחן לוח הלחם עם רגלי שיכוך גומי.
4. הסר את הבמה והחלף אותו בשקע מעבדה קומפקטי להתאמת גובה התקן הריחוף (ציר y)ושני שלבי תרגום חד-ציריים; אחד להתאמת המוקד (z-ציר), והשני לסריקת צינור נימי.
5. חבר את מכשיר הריחוף המגנטי לשקע המעבדה באמצעות שני עמודים אופטיים מסדרה קטנה.

2. קשירת נוגדנים למיקרו-חלקיקים/חרוזים קרבוקסיים (שונה מפרוטוקול על ידי PolyAn)

הערה: רק חרוזים בצפיפות נמוכה (1.05 גרם/מ"ל) צריכים להיות מצופים לגילוי Rh(+), אך חרוזי צפיפות גבוהה ונמוכה מצופים לגילוי שלשלות חוץ-תאיות.

1. מוציאים מ"ג אחד שווה ערך להשעיית חרוזים ומוסיפים ל-0.5 מ"ל של מאגר הפעלה (50 מ"מ MES (MW195.2, 9.72 מ"ג ב-1 מ"ל)) pH 5.0 ו-0.001% פוליסורבט-20).
2. הוסף 12 μL של 1.5 M EDC טרי (MW 191.7, 0.28755 גרם ב 1 מ"ל) ו 12 μL של 0.3 M סולפו-NHS (MW 217.14, 0.0651 גרם ב 1 מ"ל) במים קרים כקרח.
3. מניחים צינורות על שייקר מסלולי ומנערים במרץ במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להפעיל את קבוצות הקרוקסיל על חרוזים.
4. הפסק את ההפעלה לאחר שעה אחת על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של מאגר צימוד (10x PBS, או 0.1 M פוספט pH 7-9).
5. גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 10 דקות, או, אם החרוזים לא ניתן לכדור, להשתמש במסנן צינור צנטריפוגה 0.45 מיקרומטר. שאפו את סופר-טבעי או זרימה דרך.
6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של 10x PBS פי 3 כמו בשלב 2.5.
7. חשב 25 מיקרוגרם של נוגדן לכל חרוזים מ"ג ולערבב נוגדן הרצוי עם חרוזים מופעלים 0.7-1.0 מ"ג / מ"ל ריכוז נוגדנים סופי ב 10X PBS.
8. מניחים צינורות על נדנדת צינור להגדיר על מהירות נמוכה. גלגלו צינורות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך הלילה לצימוד.
9. חזור על שלב 2.5 ושטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של 10x PBS.
10. לשטוף עם 0.5 מ"ל של 1 M אתנולמין (98% מלאי = 16.2 M) ב- pH 8.0 חיץ עם 0.02% פוליסורבט-20 עבור שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי רעדה עדינה.
11. חזור על שלב 2.5 ולשטוף את החרוזים פעם אחת ב 1 מ"ל של DPBS. החרוזים ניתן לאחסן ב 200 μL של DPBS ב 4 °C (55 °F) עד הצורך.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. איסוף והכנת דם לגילוי Rh(+)

1. באמצעות התקן lancing בלחיצה אחת, לדקור את האצבע של תורם Rh(+) ולאסוף 10 μL של דם לתוך 1 מ"ל של DPBS.
2. הכתימו את תאי ה-Rh+ בכתם קרום פלזמה פלואורסצנטי. לחלופין, להוסיף 1 μL של צבע פלואורסצנטי השעיה 1 מ"ל של תאי Rh + (1:1000 דילול).
3. לדגור על התאים עם צבע פלואורסצנטי ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות.
4. גלולה את התאים על ידי ספינינג ב 5,600 x g עבור 15 s לשטוף 3 פעמים באמצעות 1 מ"ל של DPBS. Resuspend ב 1 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום (HBSS++).
5. באמצעות מכשיר lancing בלחיצה אחת, לדקור את האצבע של תורם Rh(-) ולאסוף 2 μL של דם.
   הערה: אם מכינים יותר מ 2 תנאים, לאסוף מספיק דם כדי להוסיף 1 μL של Rh (-) דם לכל צינור.
6. הכן את הצינורות הניסיוניים הדרושים: חרוזים לבד, בקרת IgG, מדגם.
   1. חרוזים בלבד: להוסיף 174 μL של HBSS ++, 1 μL של חרוזי בקרה IgG, 1 μL של חרוזים בצפיפות גבוהה (1.2 גרם / מ"ל), ו 24 μL של 500 mM Gd^{3 +} (60 mM).
   2. בקרת IgG: להוסיף 172 μL של HBSS ++, 1 μL של חרוזי בקרה IgG, 1 μL של חרוזים בצפיפות גבוהה, 1 μL של דם Rh, 1 μL של השעיית דם מוכתמת Rh + , ו 24 μL של 500 mM Gd^{3 +}.
   3. צינור מדגם להוסיף 172 μL של HBSS ++, 1 μL של חרוזים מצופים נגד RhD, 1 μL של חרוזים בצפיפות גבוהה, 1 μL של Rh- דם, 1 μL של השעיית דם מוכתמת Rh(+) ו 24 μL של 500 mM Gd^{3 +}.
      הערה: חרוזי צפיפות גבוהה מתווספים דגימות Rh לעיון.

4. בידוד PMNs להדגמת הפרדה סלולרית

1. בידוד של נויטרופילים
   1. צייר 40 מ"ל של דם ורידי לתוך מזרק 60 מ"ל המכיל 6 מ"ל של נתרן ציטראט / חומצת לימון (0.15 M, pH 5.5) ו 14 מ"ל של 6% Dextran-70.
   2. המתן 50 דקות עד שהדם יהיה מ משקעים.
   3. שכב לאט את תאי מעיל באפי על גבי 20 מ"ל של Ficoll-Paque על ידי דחיפת העליון 18 מ"ל דרך צינורות איסוף הדם לתוך צינור 50 mL, הימנעות זיהום עם RBCs מ משקעים. מומלץ להשתמש בערכת איסוף דם טרי, כדי למזער את הזיהום עם שאריות RBCs שנותרו בצינור איסוף הדם המקורי.
   4. גלולה את תאי מעיל באפי על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 3,000 x גרם. נויטרופילים ו-RBCs מזהמים יזרקו בתחתית הצינור. PBMC תיצור שכבה לבנה על גבי פיקול-פאק.
   5. העבר את הנויטרופילים לצינור חדש של 50 מ"ל.
   6. Lyse כל שאריות RBCs על ידי דגירה נויטרופילים עם 20 מ"ל של 0.2% פתרון NaCl קר במשך 25 שניות, ואחריו 20 מ"ל נוספים של 1.6% NaCl. הקונצרט הסופי של NaCl צריך להיות 0.9% (איזוטוני).
   7. צנטריפוגה ההשעיה למשך 10 דקות ב 3,000 x g.
   8. הסר את supernatant ו resuspend הנויטרופילים לריכוז הרצוי.
2. בידוד לימפוציטים
   1. צלחת PBMCs ב RPMI עם סרום מומת בחום 5% ב 6 טוב צלחות תרבות.
   2. לדגור את הצלחות במשך 1 שעה ב 37 °C (50 °F). מונוציטים ידבקו בצלחת, לימפוציטים יצופו בחופשיות.
   3. הסר את המאגר המכיל את הלימפוציטים ולשטוף אותו פעמיים עם RPMI.
   4. resuspend הלימפוציטים בריכוז הרצוי.
3. תווית RBCs, PMN, ולימפוציטים.
   1. סמן כל סוג תא בצבע פלואורסצנטי שונה. ודא שכל צבע פלואורסצ'ים בערוץ אחר. בצע את הוראות היצרן עבור כל אחד מהצבעים שנבחרו.

5. יצירת שלשלות חוץ-תאיות RBC באמצעות ההפעלה המשלימה

1. להשיג דם שלם באמצעות venipuncture באמצעות צינורות EDTA.
2. להעביר דם דרך מסנן תא דם לבן, ולאחר מכן צנטריפוגה 3 פעמים ב 500 x g במשך 10 דקות כל אחד כדי לבודד תאי דם אדומים. השתמש ב- HBSS+ כמאגר כביסה.
3. הפוך aliquots של 100 μL ארוז RBCs ב 1.5 mL צינורות לפצות את הנפח ל 1 מ"ל על ידי הוספת HBSS ++.
4. הוסף C5b,6 לריכוז הסופי של 0.18 מיקרוגרם/מ"ל ב- HBSS++, ולאחר מכן מערבולת.
5. שמים על שייקר איטי בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
6. הוסיפו חלבון C7 לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים על ידי היפוך הצינור בעדינות כמה פעמים. אל תמערבולת מנקודה זו ואילך.
7. מניחים את הצינור על שייקר צינור להגדיר במהירות נמוכה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הוסיפו חלבון C8 לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, וחלבון C9 ל-0.45 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים על ידי היפוך הצינורות בעדינות כמה פעמים.
9. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
10. צנטריפוגה הצינור ב 10,000 x g במשך 10 דקות.
11. לאסוף את EV המכיל supernatant בצינור חדש(ים). אין לטרפד את הסופר-טבעי קרוב מדי לכדור התא.

6. ניתוח תאים במכשיר הריחוף המגנטי

1. בצע אתחול מכשיר בהתאם להוראות היצרן.
2. לטעון 50 μL של מדגם לתוך צינור נימי עד הצינור מתמלא. לאטום את הקצוות של הצינור נימי עם איטום נימי לוודא שאין בועות אוויר נוכחים.
3. טען את צינור נימי לתוך המחזיק בין המגנטים העליונים והתחתונים. התאם את הבמה ואת המוקד לצפייה מיטבית.
   הערה: תאים / חרוזים יכולים לקחת בכל מקום בין 5-20 דקות כדי להגיע למיקום שיווי המשקל המגנטי שלהם בהתבסס על הצפיפות שלהם ואת הריכוז של Gd^{3 +}. ככל שריכוז GD³⁺גבוה יותר, כך הזמן קצר יותר.

תוצאות

ריחוף מגנטי ממקד עצמים בצפיפות שונה בגבהי ריחוף שונים בהתאם לצפיפות האובייקט, החתימה המגנטית שלו, ריכוז התמיסה הפרמגנטית וכוח השדה המגנטי שנוצר על ידי שני מגנטים חזקים ונדירים של כדור הארץ. כששני המגנטים מונחים זה על גבי זה, ניתן לצפות רק בדגימות מרחפות, תוך שמירה על תאורת קולר, באמצעות מי?...

Discussion

צנטריפוגה הדרגתית היא כיום הטכניקה הסטנדרטית לבידוד רכיבים תת-תאיים בהתבסס על הצפיפות הייחודית שלהם. גישה זו, לעומת זאת, דורשת שימוש במדיה הדרגתית מיוחדת, כמו גם ציוד צנטריפוגות. גישת הריחוף המגנטי המוצגת כאן מאפשרת חקירה מפורטת של התכונות המורפולוגיות והתפקודיות של תאים במחזור, עם מינימ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube