JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.

Abstract

تعد دراسة الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) مجالا معقدا وأساسيا ، والذي أصبح أكثر أهمية فقط بسبب استخدام الأدوية التي تستهدف DDR لعلاج السرطان. هذه الأهداف هي البوليميراز البولي (ADP-ribose) (PARPs) ، والتي تبدأ أشكالا مختلفة من إصلاح الحمض النووي. إن تثبيط هذه الإنزيمات باستخدام مثبطات PARP (PARPi) يحقق الفتك الاصطناعي من خلال منح ضعف علاجي في الخلايا التي تعاني من نقص في إعادة التركيب المتماثل (HR) بسبب الطفرات في سرطان الثدي من النوع 1 (BRCA1) أو BRCA2 أو شريك وتوطين BRCA2 (PALB2).

الخلايا المعالجة ب PARPi تتراكم فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط (DSBs). تتم معالجة هذه الفواصل بواسطة آلية استئصال نهاية الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تكوين الحمض النووي الأحادي (SS) وإصلاح الحمض النووي اللاحق. في سياق BRCA1 الناقص ، يؤدي تنشيط استئصال الحمض النووي من خلال الطفرات في مثبطات استئصال الحمض النووي ، مثل 53BP1 و DYNLL1 ، إلى مقاومة PARPi. لذلك ، فإن القدرة على مراقبة استئصال الحمض النووي في السيلولو أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي وتطوير استراتيجيات جديدة للتغلب على مقاومة PARPi. تسمح التقنيات القائمة على التألق المناعي (IF) بمراقبة استئصال الحمض النووي العالمي بعد تلف الحمض النووي. تتطلب هذه الاستراتيجية وضع علامات الحمض النووي الجينومي طويل النبض باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). بعد تلف الحمض النووي واستئصال نهاية الحمض النووي ، يتم الكشف عن الحمض النووي الناتج الذي تقطعت به السبل على وجه التحديد بواسطة جسم مضاد مضاد ل BrdU في ظل ظروف أصلية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا دراسة استئصال الحمض النووي باستخدام علامات دورة الخلية للتمييز بين المراحل المختلفة لدورة الخلية. تسمح الخلايا في مرحلة S / G2 بدراسة الاستئصال النهائي داخل HR ، في حين يمكن استخدام خلايا G1 لدراسة الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). يتم وصف بروتوكول مفصل لطريقة IF هذه إلى جانب التمييز في دورة الخلية في هذه الورقة.

Introduction

يعد تعديل عوامل إصلاح الحمض النووي طريقة دائمة التطور لعلاج السرطان ، خاصة في بيئات الأورام التي تعاني من نقص في إصلاح الحمض النووي. يعد تثبيط عوامل إصلاح محددة أحد الاستراتيجيات البارعة المستخدمة لتوعية الخلايا السرطانية بالعوامل الضارة بالحمض النووي. أدت عقود من الأبحاث إلى تحديد طفرات مختلفة من جينات إصلاح الحمض النووي كمؤشرات حيوية لخيارات الاستراتيجية العلاجية1. ونتيجة لذلك، أصبح مجال إصلاح الحمض النووي مركزا لتطوير الأدوية لضمان مجموعة واسعة من العلاجات، وتمكين مفهوم الطب الشخصي.

يتم إصلاح DSBs من خلال مسارين رئيسيين: NHEJ و HR2. مسار NHEJ عرضة للخطأ ، حيث يربط بسرعة نهايتين من الحمض النووي مع القليل من المعالجة النهائية للحمض النووي أو لا يوجد على الإطلاق ويتضمن بروتين كيناز (DNA-PKcs) ، ومركب Ku70/80 ، و 53BP1 ، وبروتينات RIF1 3. في المقابل ، الموارد البشرية هي آلية مخلصة بدأتها BRCA14. خطوة أساسية في إصلاح الموارد البشرية هي عملية استئصال نهاية الحمض النووي ، وهي تدهور النهايات المكسورة مما يؤدي إلى الحمض النووي الأحادي (SS) مع نهايات 3'-OH. يسهل BRCA1 توظيف البروتينات النهائية التي تشكل MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 ، والتي تشارك في استئصال الحمض النووي من 5 إلى 3 أقدام5.

يتم إنجاز الاستئصال النهائي الأولي من خلال نشاط endonuclease لل MRE11 ، مما يسمح بمزيد من المعالجة بواسطة nucleases DNA2 و EXO1. يتم طلاء بقايا ssDNA المتولدة بسرعة بواسطة بروتين النسخ المتماثل A (RPA) لحمايتها من المعالجة الإضافية. بعد ذلك ، تشارك BRCA2 و PALB2 و BRCA1 في التوسط في إزاحة RPA وتجميع نواة RAD51 المطلوبة لآلية الإصلاح الموجهة بالتماثل. من الضروري وجود توازن دقيق بين استخدام NHEJ والموارد البشرية للحفاظ الأمثل على السلامة الجينومية. يعتمد اختيار المسار على مرحلة دورة الخلية. يتم استخدام الموارد البشرية بشكل تفضيلي خلال المراحل من S إلى G2 حيث يكون استئصال الحمض النووي على أعلى مستوى ، وتتوفر الكروماتيدات الشقيقة لضمان الإصلاح المناسب.

بوليميراز بولي (ADP-ribose) 1 (PARP-1) هو واحد من أوائل البروتينات التي تم تجنيدها في DSB. وهو ينظم كل من نشاط الاستئصال وتجميع المؤثرات النهائية المشاركة في NHEJ5,6. مطلوب PARP-1 أيضا لإصلاح كسر الحمض النووي أحادي الخيط أثناء النسخ المتماثل7,8. نظرا لدورها المهم في إصلاح الحمض النووي ، يتم استخدام مثبطات PARP (PARPi) كعلاجات للسرطان. في العديد من أنواع السرطان التي تعاني من نقص الموارد البشرية ، يؤدي علاج PARPi إلى استجابة قاتلة اصطناعية بسبب عجز الخلايا التي تعاني من نقص الموارد البشرية عن إصلاح الضرر المتراكم عبر مسار بديل9,10. يوجد حاليا أربعة PARPi معتمدين من إدارة الأغذية والعقاقير: أولاباريب ، روكاباريب ، نيريباريب ، وتالازوباريب (وتسمى أيضا BMN 673) ، والتي تستخدم لمختلف علاجات سرطان الثدي والمبيض11. ومع ذلك ، فإن مقاومة PARPi شائعة ، وينشأ أحد الأسباب المحتملة من خلال استعادة كفاءة الموارد البشرية 12. فقدان أو تثبيط PARP-1 في وجود خلل التشعيع ينظم آلية الاستئصال ، مما يؤدي إلى تراكم مساحات ssDNA أطول13. لذلك ، فإن إجراء دراسة متعمقة لاستئصال الحمض النووي في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي والتطوير اللاحق لاستراتيجيات جديدة لعلاج السرطان والتغلب على مقاومة PARPi.

كانت هناك عدة طرق مستخدمة للكشف عن أحداث استئصال الحمض النووي5. إحدى هذه الطرق هي التقنية الكلاسيكية القائمة على IF التي تسمح بالتلطيخ غير المباشر وتصور الحمض النووي المستأصل بعد DSB الناجم عن الإجهاد باستخدام جسم مضاد مضاد ل RPA. إن وضع العلامات على الحمض النووي الجيني باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) والكشف عن ssDNA فقط هو قياس مباشر لأحداث استئصال الحمض النووي. إنه يتحايل على مراقبة RPA ، التي تشارك في عمليات خلوية متعددة مثل تكرار الحمض النووي. في الطريقة الموضحة هنا ، تسمح الخلايا المحتضنة ب BrdU لدورة خلية واحدة بدمج BrdU في خيط واحد من الحمض النووي الخلوي المكرر. بعد الاستئصال ، يتم إجراء تلطيخ IF في ظل ظروف تسمح باكتشاف BrdU فقط في شكل ssDNA ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل BrdU. يمكن لهذا الجسم المضاد الوصول فقط إلى نيوكليوتيدات BrdU المكشوفة ولن يكتشف تلك المدمجة في الحمض النووي المزدوج العالق. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن تصور الحمض النووي المقطوع في شكل بؤر BrdU / ssDNA مثقوبة. يمكن استخدام الكثافة النووية لهذه البؤر كقراءة لتحديد كمية الاستئصال بعد تلف الحمض النووي. تصف هذه الورقة خطوة بخطوة عمليات هذه الطريقة ، والتي يمكن تطبيقها على معظم خطوط خلايا الثدييات. يجب أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة واسعة كطريقة بسيطة لمراقبة استئصال نهاية الحمض النووي في السليلولو ، كدليل على المفهوم.

Protocol

1. زراعة الخلايا والعلاجات وإعداد الغطاء

ملاحظة: يجب أن تتم جميع عمليات طلاء الخلايا وعمليات النقل والعلاجات، بصرف النظر عن التشعيع، تحت غطاء معقم لزراعة الخلايا.

  1. اليوم 1
    1. في طبق مكون من 6 آبار ، ضع غطاء واحد في كل بئر لأكبر عدد ممكن من الظروف حسب الحاجة. لوحة ~ 150،000 خلايا HeLa لنقل الحمل أو العلاج من تعاطي المخدرات ، حسب الرغبة.
      ملاحظة: في حالة النقل ، يوصى بإجراء نقل عكسي في وقت الطلاء ، أو من الممكن إجراء نقل أمامي بعد عدة ساعات من الطلاء للسماح بالالتصاق. يتم إجراء النقل العكسي عن طريق إضافة مزيج النقل إلى الغطاء قبل إضافة الخلايا ؛ وبالتالي ، يبدأ النقل قبل أن تبدأ الخلايا في الالتصاق. وعلى النقيض من ذلك، فإن النقل الأمامي هو إضافة مزيج النقل بعد الالتصاق بالسطح عادة في اليوم التالي. ومع ذلك ، من الممكن القيام بذلك في نفس اليوم ، شريطة إعطاء وقت كاف للخلايا للالتصاق.
    2. لهذه الطريقة ، استخدم 4 آبار: البئر 1: التحكم في siRNA (يسمى siCTRL) ؛ البئر 2: siRNA ضد PARP-1 (siPARP-1) ؛ حسنا 3: غير معالج. البئر 4: الخلايا المراد معالجتها ب 5 ميكرومتر BMN673 1 ساعة قبل التشعيع.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، أجريت جميع الاختبارات في ظل ظروف مشععة (انظر القسم 1-3).
    3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة 5٪ CO2 بين عشية وضحاها ، على الرغم من أن بروتوكول النقل يسمح لمدة تصل إلى 3 أيام من الحضانة. يعتمد وقت الحضانة قبل علاج BrdU على كفاءة نقل siRNA. إذا لم يكن هناك نقل ، فإن الحضانة لمدة 16 ساعة كافية للسماح بالالتزام بالغطاء وبعض نمو الخلايا.
      ملاحظة: يمكن تغيير ظروف الحاضنة وفقا لخط الخلية المستخدم.
  2. اليوم 2
    1. أضف BrdU بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر في وسائط الاستزراع المناسبة ، واحتضن لمدة 16 ساعة (دورة خلية واحدة).
      ملاحظة: يتم تحضير محلول BrdU في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. محلول المخزون المستخدم هو 10 mM ويتم تخزينه في aliquots عند -20 درجة مئوية.
  3. اليوم 3
    1. تشعيع الألواح بجرعة إجمالية قدرها 5 غراي من تشعيع الأشعة السينية (تختلف جرعة التشعيع اعتمادا على نوع التشعيع ، على سبيل المثال ، أجهزة تشعيع الحيوانات الصغيرة مقابل أجهزة التشعيع على الطاولة). انظر جدول المواد لمعرفة العلامة التجارية وطراز جهاز التشعيع المستخدم.
    2. أعد الألواح إلى الحاضنة ، وحرر الخلايا لمدة 3 ساعات.
    3. خلال فترة الحضانة لمدة 3 ساعات ، قم بإعداد المخزنين المؤقتين ، A و B ، و 4٪ paraformaldehyde (PFA) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      ملاحظة: يجب تحضير المخازن المؤقتة A و B والسكروز طازجة في يوم التثبيت ، باستخدام محلول السكروز الطازج لمنع التلوث.
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت A (المخزن المؤقت قبل الاستخراج) ، وفقا للترتيب (30 مل) الموضح في الجدول 1.
        ملاحظة: يجب تحضير السكروز 1M في يوم الاستخدام لمنع التلوث.
      2. قم بإعداد المخزن المؤقت B (المخزن المؤقت لتجريد الهيكل الخلوي) وفقا للترتيب الموضح في الجدول 1 (30 مل).
        ملاحظة: يجب إعداد المخزن المؤقت B بالترتيب المذكور لمنع هطول الأمطار من Tween-20 ومحلول ديوكسيكولات الصوديوم.
      3. تحضير 4 ٪ PFA ، 2 مل لكل حالة (10 مل) ، تحت غطاء كيميائي (الجدول 1).

2. ما قبل الاستخراج والتثبيت

ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات الاستخراج والتثبيت المسبق مع بقاء الأغطية في صفيحة زراعة الأنسجة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية. يتم رفع الغطاء فقط في الخطوة الأخيرة من التركيب (انظر المناقشة).

  1. ما قبل الاستخراج
    1. استنشاق الوسط ، واغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام 1x PBS ، وقم بإزالة PBS. أضف 2 مل من المخزن المؤقت A قبل الاستخراج واحتضنه على الفور عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: من المهم عدم تمديد وقت الحضانة في المخزن المؤقت A. الحضانة الموسعة في المخازن المؤقتة قبل الاستخراج ستؤدي إلى زيادة عدد الخلايا المنفصلة عن الغطاء الزجاجي. بدلا من ذلك ، بدلا من الحضانة عند 4 درجات مئوية ، يمكن إجراء الحضانة على الجليد.
    2. قم بإزالة المخزن المؤقت A من خلال الطموح.
      ملاحظة: لا تغسل الأغطية بعد إزالة المخزن المؤقت A. انتقل إلى الخطوة التالية.
    3. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لتجريد الهيكل الخلوي B واحتضنه على الفور عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استنشق بعناية المخزن المؤقت B ، واغسل الخلايا بعناية مرة واحدة باستخدام 1x PBS. استنشق بعناية 1x PBS.
  2. تثبيت
    1. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من 4٪ PFA تحت غطاء المحرك الكيميائي.
      ملاحظة: PFA سامة ويجب التلاعب بها تحت غطاء كيميائي.
    2. احتضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الأغطية مرتين باستخدام 1x PBS ، واستنشق الفائض.
    3. قم بتغطية الأغطية بالميثانول البارد بنسبة 100٪ ، واحتضن الأغطية عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يغسل مرتين مع 1x PBS.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين الأغطية عند 4 درجات مئوية في 1x PBS واللوحة ملفوفة برقائق الألومنيوم إذا لزم الأمر. يجب عدم الاحتفاظ بالخلايا أكثر من 5 أيام قبل متابعة بروتوكول IF.

3. النفاذية

  1. احتضان الخلايا مع 2 مل من 1x PBS تحتوي على 0.5٪ Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS.

4. تلطيخ المناعة

  1. خطوة الحظر
    1. قم بإعداد ما يكفي من المخزن المؤقت الطازج (3٪ BSA في 1x PBS) لاستخدام 2 مل لكل غطاء.
      ملاحظة: قم بإعداد 5 مل إضافية من المخزن المؤقت للحجب لصنع محاليل الأجسام المضادة.
    2. أضف 2 مل من المخزن المؤقت المانع إلى كل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  2. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي في مخزن مؤقت جديد للكتل: BrdU RPN202 1:1000 والمستضد النووي الخلوي المنتشر (PCNA) 1:500 ، 100 ميكرولتر لكل غطاء.
      ملاحظة: للحفاظ على الجسم المضاد ، يمكن استخدام حجم أصغر ، 75-100 ميكرولتر لغطاء 22 × 22 مم ، 50-75 ميكرولتر لغطاء 18 × 18 مم.
    2. على كل غطاء ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي. قم بتغطية الأغطية بمربع من البارافيلم باستخدام ملاقط ، ووضع البارافيلم بعناية لعدم إنشاء فقاعات.
    3. قم بتغطية اللوحة بورق الألومنيوم ، واحتضن الجسم المضاد الأساسي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    4. قم بإزالة مربعات البارافيلم ، واغسل الأغطية ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS المعقمة.
  3. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. تحضير ما يكفي من محلول الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت المانع الطازج: مضاد الفأر 488 الفلورسنت الثانوي A11011 (ل BrdU) تخفيف 1: 800 ومكافحة الأرانب 568 الفلورسنت الثانوي A11011 (ل PCNA) تخفيف 1: 800.
      ملاحظة: يمكن تغيير الألوان المستخدمة لتناسب الاحتياجات التجريبية. يمكن العثور على العلامة التجارية المحددة المستخدمة في جدول المواد.
    2. أضف على كل غطاء 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي ، وقم بتغطية الأغطية بمربع من البارافيلم باستخدام ملاقط ، وضع البارافيلم بعناية دون فقاعات.
    3. احتضان الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع لوحة مغطاة بورق الألومنيوم.
    4. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS.
  4. تلطيخ نووي
    1. تحضير حجم 2 مل لكل غطاء من 1x PBS يحتوي على 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل (1:1000).
    2. أضف على كل غطاء 2 مل من محلول DAPI. احتضن الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع تغطية اللوحة بورق الألومنيوم. اغسل الغطاء مرتين باستخدام 1x PBS.
    3. قم بتغطية الأغطية ب 1x PBS ، واستخدم إما إبرة أو ملاقط دقيقة لرفع الغطاء من أسفل البئر. قم بمسح السائل الزائد بعناية عن طريق النقر على حافة واحدة بلطف على منشفة ورقية.
      ملاحظة: احرص على عدم إسقاط الشريحة أو السماح للسطح المستوي مع الخلايا الملتصقة بلمس الورق.
    4. قم بتركيب الأغطية على الشرائح باستخدام 10-20 ميكرولتر من وسائط التركيب الخاصة ب IF.

5. الحصول على الصور وتحليلها

ملاحظة: يمكن الحصول على الصور على عدة أنواع من المجاهر الفلورية. تم استخدام مجهر epifluorescence مع هدف النفط 63x. انظر جدول المواد للعلامة التجارية والطراز. مكدسات Z غير مطلوبة ، على الرغم من أنها قد تكون ذات فائدة اعتمادا على خط الخلية ومستوى تلطيخ الميتوكوندريا.

  1. تحليل الصور
    1. لكل صورة ، قم بإنشاء ملفات TIFF متعددة ؛ دمج جميع الطائرات، ولكن حافظ على قنوات الألوان منفصلة. قم باستيراد هذه الملفات إلى Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) وقم بتحليلها باستخدام خط أنابيب Speckle Count (الفيديو التكميلي 1).
    2. قم بتحميل الصور (الشكل التكميلي S1A).
      1. لبدء إنشاء المشروع ، قم بتحميل خط أنابيب عد البقع في البرنامج والصور المراد تحليلها في المنطقة المتوفرة.
      2. استخدم وحدة NamesAndTypes النمطية لتعيين اسم ذي معنى لكل صورة تشير من خلاله الوحدات الأخرى إليها-C01: تمثيل قناة BrdU ؛ C02: تمثيل قناة PCNA؛ C03: تمثيل قناة DAPI.
        ملاحظة: تعتمد هذه المعرفات على المجهر؛ يجب أن يكون هناك معرف في اسم الملف للتمييز بين القنوات.
    3. حدد الملف الذي سيتم استخدامه لتحديد النوى وتسميتها (قم بتغيير هذا الاسم كما هو مطلوب) (انظر الشكل التكميلي S1B والشكل التكميلي S1C).
      1. حدد قطر الجسم بين 50 و 300 وحدة بكسل، وهو نطاق الحجم المقبول للنواة، ولكن قم بتغيير القيمة لتناسب النوى في الصورة.
        ملاحظة: قد يكون 50 قيمة كبيرة جدا وتمنع تحديد النوى الأصغر؛ وبالمثل ، قد يسمح 300 باحتساب مجموعات كبيرة من النوى على أنها 1.
      2. تخلص من الكائنات خارج نطاق القطر لضمان احتساب الكائنات التي تطابق المعايير فقط.
      3. تجاهل الكائنات التي تلامس الحدود لإزالة الخلايا التي قد تكون موجودة جزئيا فقط في الحقل.
      4. قم بتطبيق العتبة لتناسب الصور المحددة. لاحظ الإعدادات التالية كمثال. تغيير عامل تصحيح العتبة بناء على مدى صرامة استراتيجية العتبة. وتشمل الإعدادات الأخرى استراتيجية العتبة: العالمية. طريقة العتبة: أوتسو. فئتان أو ثلاث فئات عتبة: فئتان ؛ مقياس تجانس العتبة: 1 ؛ عامل تجانس العتبة: 1 ؛ الحدود الدنيا والعليا على العتبة: 0.0 و 1.0 ؛ طريقة لتمييز الكائنات المتكتلة: الشكل ؛ وطريقة رسم الخطوط الفاصلة بين الكائنات المتكتلة: نشر.
        ملاحظة: لكل معلمة، يوفر ملف تعريف الخلية تعريفات تكميلية وإمكانية متاحة لإعداد المتغير.
    4. تحديد الكائن الأساسي لتحديد البؤر (الشكل التكميلي S2A).
      1. استخدم الإعدادات التالية: حدد صورة الإدخال: Maskedgreen; تسمية الكائن الأساسي الذي سيتم تحديده: BrdUFoci ؛ القطر النموذجي للكائن: 1-15 ؛ تجاهل الجسم خارج نطاق القطر: نعم ؛ تجاهل الكائن الذي يلمس حدود الصورة: لا ؛ استراتيجية العتبة: التكيفية؛ طريقة العتبة: أوتسو. فئتان أو ثلاث فئات عتبة: ثلاث فئات ؛ مقياس تجانس العتبة: 1 ؛ عامل تجانس العتبة: 3 ؛ وحجم مرشح التنعيم: 4.
    5. قياس الشدة (الشكل التكميلي S2B).
      1. حدد الصورة المراد قياسها: OrigGreen.
      2. انقر على إضافة صورة أخرى. حدد الصورة المراد قياسها: PCNA. حدد الكائنات المراد قياسها: النوى.
        ملاحظة: سيتم استخدام هذا لقياس كثافة BrdU و PCNA - البيانات النهائية التي سيتم رسمها بيانيا.

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم استخدام الفحص القائم على بروموديوكسي يوريدين (BrdU) لقياس استجابة استئصال خلايا HeLa للضرر الناجم عن الإشعاع كميا. يتم تصور مسارات ssDNA المتولدة كبؤر متميزة بعد تلطيخ التألق المناعي (الشكل 1A). ثم تم تحديد البؤر المحددة كميا والتعبير عنها على أنها الكثافة ا?...

Discussion

تصف هذه الورقة طريقة تستخدم تلطيخ IF لقياس الاختلافات في استئصال الحمض النووي في السليلولو. المعيار الحالي لمراقبة تأثير على استئصال الحمض النووي هو من خلال تلطيخ RPA. ومع ذلك ، هذه طريقة غير مباشرة قد تتأثر بتكرار الحمض النووي. في السابق ، تم وصف تقنية أخرى لاستئصال الحمض النووي القائم ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر ماري كريستين كارون على المشورة الفنية المتميزة. يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. يحمل كرسي أبحاث كندا من المستوى 1 في إصلاح الحمض النووي وعلاجات السرطان. J.O'S هو زميل طالب دكتوراه FRQS ، و S.Y.M هو زميل ما بعد الدكتوراه FRQS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 568 goat anti-rabbitMolecular probesA110111:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouseMolecular probesA110011:800
Anti PARP1 (F1-23)Homemade1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Benchtop X-ray IrradiatorCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Cell profilerBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ftFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM high glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetal Bovine serumGibco12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22Fisher scientific12 541B
Fluorescent microscopeLeicaDMI6000B63x immersion objective
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Needle
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher scientificBP337500
Tweezers

References

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 BrdU PARP 1 PARP PARP BMN673

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved