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Resumo

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Resumo

O estudo da resposta a danos no DNA (DDR) é um campo complexo e essencial, que só se tornou mais importante devido ao uso de medicamentos direcionados ao DDR para o tratamento do câncer. Estes alvos são poli (ADP-ribose) polimerases (PARPs), que iniciam várias formas de reparação de DNA. Inibir essas enzimas utilizando inibidores parp (PARPi) atinge a letalidade sintética conferindo uma vulnerabilidade terapêutica em células deficientes de recombinação homólogo (RH) devido a mutações no câncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2 ou parceiro e localizador do BRCA2 (PALB2).

As células tratadas com PARPi acumulam quebras de duplo fio de DNA (DSBs). Essas quebras são processadas pelo maquinário de ressecção final de DNA, levando à formação de DNA mono-encalhado (ss) e posterior reparação de DNA. Em um contexto deficiente brca1, revigorar a ressecção do DNA através de mutações em inibidores de ressecção de DNA, como 53BP1 e DYNLL1, causa resistência parpi. Portanto, ser capaz de monitorar a ressecção de DNA em celulose é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento de novas estratégias para superar a resistência do PARPi. As técnicas baseadas em imunofluorescência (IF) permitem o monitoramento da ressecção global de DNA após danos no DNA. Esta estratégia requer rotulagem de DNA genômico de pulso longo com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU). Após danos no DNA e ressecção da extremidade do DNA, o DNA de uma única cadeia resultante é especificamente detectado por um anticorpo anti-BrdU em condições nativas. Além disso, a ressecção de DNA também pode ser estudada usando marcadores de ciclo celular para diferenciar entre várias fases do ciclo celular. As células da fase S/G2 permitem o estudo da ressecção final dentro do RH, enquanto as células G1 podem ser usadas para estudar a junção final não homólogo (NHEJ). Um protocolo detalhado para este método IF acoplado à discriminação do ciclo celular é descrito neste artigo.

Introdução

Modulação de fatores de reparação de DNA é um método em constante evolução para a terapia do câncer, particularmente em ambientes tumorais deficientes de reparação de DNA DSB. A inibição de fatores de reparação específicos é uma das estratégias engenhosas usadas para sensibilizar as células cancerígenas para agentes prejudiciais ao DNA. Décadas de pesquisa levaram à identificação de várias mutações de genes de reparação de DNA como biomarcadores para escolhas de estratégia terapêutica1. Consequentemente, o campo de reparação de DNA tornou-se um centro de desenvolvimento de medicamentos para garantir uma ampla gama de tratamentos, capacitando o conceito de medicina personalizada.

Os DSBs são reparados por duas vias principais: NHEJ e HR2. A via NHEJ é propensa a erros, ligando rapidamente as duas extremidades de DNA com pouco ou nenhum processamento final de DNA e envolvendo a quinase proteica (DNA-PKcs), o complexo Ku70/80, 53BP1 e RIF1 proteins3. Em contrapartida, o RH é um mecanismo fiel iniciado pelo BRCA14. Um passo essencial na reparação do RH é o processo de ressecção do DNA-end, que é a degradação das extremidades quebradas levando ao DNA de um único fio (ss) com extremidades de 3'-OH. O BRCA1 facilita o recrutamento das proteínas a jusante que formam o resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que estão envolvidos na ressecção de DNA de 5' a 3'5.

A ressecção final inicial é realizada através da atividade endonuclease do MRE11, permitindo um processamento adicional pelos núcleos DNA2 e EXO1. As ssDNA ssDNA geradas são rapidamente revestidas por Proteína de Replicação A (RPA) para protegê-los de mais processamento. Posteriormente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 se engajam para mediar o deslocamento do RPA e a montagem do nucleofilamento RAD51 necessário para o mecanismo de reparação direcionado à ímologia. Um bom equilíbrio entre o uso de NHEJ e RH é necessário para a manutenção ideal da integridade genômica. A escolha do caminho depende da fase do ciclo celular. O RH é usado preferencialmente durante as fases S e G2, onde a ressecção de DNA está no mais alto nível, e as cromátides irmãs estão disponíveis para garantir o reparo adequado.

Poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1) é uma das primeiras proteínas recrutadas para o DSB. Regula tanto a atividade de ressecção quanto a montagem de efeitos a jusante envolvidos no NHEJ5,6. PARP-1 também é necessário para o reparo de quebra de um único fio de DNA durante a replicação7,8. Devido ao seu importante papel na reparação do DNA, os inibidores PARP (PARPi) são usados como terapias contra o câncer. Em vários cânceres deficientes de RH, o tratamento PARPi leva a uma resposta letal sintética devido à incapacidade das células deficientes de RH para reparar o dano acumulado através de uma via alternativa9,10. Atualmente existem quatro PARPi aprovados pela FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (também chamado de BMN 673), que são usados para vários tratamentos de câncer de mama e ovário11. No entanto, a resistência parpi é comum, e uma causa potencial surge através da reaquisição da proficiência em RH12. A perda ou inibição do PARP-1 na presença de irradiação desregula o maquinário resectoso, levando ao acúmulo de tratos SSDNA mais longos13. Portanto, um estudo aprofundado da ressecção de DNA in vivo é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento subsequente de novas estratégias para tratar o câncer e superar a resistência do PARPi.

Existem vários métodos empregados para detectar eventos de ressecção de DNA5. Um desses métodos é a técnica clássica baseada em IF que permite a coloração indireta e visualização do DNA ressecado após dSB induzido pelo estresse usando um anticorpo anti-RPA. Rotular DNA genômico com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU) e detectar apenas ssDNA é uma medição direta de eventos de ressecção de DNA. Contorna o monitoramento do RPA, que está envolvido em múltiplos processos celulares, como a replicação de DNA. No método descrito aqui, as células incubadas com BrdU para um único ciclo celular permitem que BrdU seja incorporada em um fio do DNA celular replicante. Após a ressecção, a coloração if é realizada em condições que permitem a detecção de BrdU apenas na forma ssDNA, com o uso de um anticorpo anti-BrdU. Este anticorpo só pode acessar nucleotídeos brdu expostos e não detectará aqueles integrados em DNA de dupla cadeia. Utilizando microscopia de fluorescência, o DNA ressecado pode ser visualizado na forma de focos de BrdU/ssDNA pontuados. A intensidade nuclear desses focos pode ser usada como leitura para quantificar a ressecção após danos no DNA. Este artigo descreve passo a passo os processos deste método, que podem ser aplicados à maioria das linhas celulares de mamíferos. Este método deve ser de ampla utilidade como uma forma simples de monitorar a ressecção final do DNA no celulose, como prova de conceito.

Protocolo

1. Cultura celular, tratamentos e preparação de clipes

NOTA: Todos os revestimentos celulares, transfecções e tratamentos, além da irradiação, devem ocorrer sob uma capa de cultura celular estéril.

  1. Dia 1º
    1. Em uma placa de 6 poços, coloque uma única mancha de cobertura em cada poço para quantas condições for necessário. Placa ~150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso, conforme desejado.
      NOTA: Se transfetar, recomenda-se fazer uma transfecção reversa no momento do revestimento, ou é possível fazer uma transfecção para a frente várias horas após o revestimento para permitir a adesão. Uma transfecção reversa é realizada adicionando a mistura de transfecção ao deslizamento antes que as células sejam adicionadas; assim, a transfecção começa antes que as células comecem a aderir. Uma transfecção para a frente, em contraste, é a adição da mistura de transfecção pós-adesão à superfície geralmente no dia seguinte. No entanto, é possível fazer isso no mesmo dia, desde que seja dado tempo suficiente para as células aderirem.
    2. Para este método, utilize 4 poços: Bem 1: controle siRNA (denominado siCTRL); Bem 2: siRNA contra PARP-1 (siPARP-1); Bem 3: não tratado; Bem 4: Células a serem tratadas com 5 μM BMN673 1 h antes da irradiação.
      NOTA: Neste protocolo, todos os testes foram realizados em condições irradiadas (ver seção 1.3).
    3. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 de 5% durante a noite, embora o protocolo de transfecção permita até 3 dias de incubação. O tempo de incubação antes do tratamento da BrdU dependerá da eficiência de transfecção do siRNA. Se não houver transfecção, a incubação por 16 h é suficiente para permitir a adesão ao deslizamento de cobertura e algum crescimento celular.
      NOTA: As condições da incubadora podem ser alteradas de acordo com a linha celular utilizada.
  2. Dia 2.
    1. Adicione BrdU em uma concentração final de 10 μM na mídia de cultivo apropriada, e incubar por 16 h (um ciclo celular).
      NOTA: A solução brdU é preparada em dimetilsulfoxida; a solução de estoque utilizada é de 10 mM e é armazenada em alíquotas a -20 °C.
  3. Dia 3.
    1. Irradie as placas com uma dose total de 5 Giros de irradiação de raios-X (varie a dose de irradiação dependendo do tipo irradiador, por exemplo, pequenos irradiadores animais vs. irradiadores benchtop). Veja a Tabela de Materiais para a marca e modelo de irradiador utilizado.
    2. Devolva as placas à incubadora e solte as células por 3h.
    3. Durante o período de incubação de 3 h, prepare os dois buffers, A e B, e 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x salina tamponada com fosfato (PBS).
      NOTA: Os buffers A e B e a sacarose devem ser preparados frescos no dia da fixação, utilizando solução de sacarose fresca para evitar contaminação.
      1. Prepare o buffer A (Buffer pré-extração), de acordo com a ordem (30 mL) descrita na Tabela 1.
        NOTA: A sacarose 1M deve ser preparada no dia do uso para evitar contaminação.
      2. Prepare o buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) de acordo com a ordem descrita na Tabela 1 (30 mL).
        NOTA: O buffer B deve ser preparado na ordem citada para evitar a precipitação da solução de desoxicolato de Tween-20 e desoxicolato de sódio.
      3. Prepare 4% PFA, 2 mL por condição (10 mL), sob uma capa química (Tabela 1).

2. Pré-extração e fixação

NOTA: Toda a pré-extração e fixação são realizadas com as tampas remanescentes na placa de cultura tecidual no gelo ou a 4 °C; o deslizamento de cobertura só é levantado na última etapa de montagem (ver discussão).

  1. Pré-extração
    1. Aspire o meio, lave cuidadosamente as células duas vezes com 1x PBS e remova o PBS. Adicione 2 mL de Tampão A pré-extração e incuba imediatamente a 4 °C por 10 min.
      NOTA: É importante que o tempo de incubação no buffer A não seja estendido. A incubação estendida nos buffers de pré-extração resultará em um aumento do número de células separadas do deslizamento de cobertura. Alternativamente, em vez de incubação a 4°C, a incubação pode ser feita no gelo.
    2. Remova o Buffer A através da aspiração.
      NOTA: Não lave as tampas após a remoção do buffer A. Vá para a próxima etapa.
    3. Adicione 2 mL de Citoesqueleto Descascando tampão B e incubar imediatamente a 4 °C por 10 min. Aspire cuidadosamente o Buffer B e lave cuidadosamente as células uma vez com 1x PBS. Aspire cuidadosamente o 1x PBS.
  2. Fixação
    1. Conserte as células adicionando 2 mL de 4% pfa sob a capa química.
      NOTA: O PFA é tóxico e deve ser manipulado sob uma capa química.
    2. Incubar as células à temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as tampas duas vezes com 1x PBS e aspire o excesso.
    3. Cubra as tampas com metanol 100% frio e incubar as tampas a -20 °C por 5 min. Lave duas vezes com 1x PBS.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As tampas podem ser armazenadas a 4 °C em 1x PBS e a placa envolta em papel alumínio, se necessário. As células não devem ser mantidas mais de 5 dias antes de continuar o protocolo IF.

3. Permeabilização

  1. Incubar as células com 2 mL de 1x PBS contendo Triton X-100 de 0,5% à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave as tampas três vezes com 2 mL de 1x PBS.

4. Imunostaining

  1. Etapa de bloqueio
    1. Prepare um buffer de bloqueio fresco suficiente (3% BSA em 1x PBS) para usar 2 mL por tampa.
      NOTA: Prepare um buffer extra de 5mL para fazer as soluções de anticorpos.
    2. Adicione 2 mL de tampão de bloqueio a cada poço e incubar à temperatura ambiente por 1h.
  2. Incubação primária de anticorpos
    1. Prepare a solução primária de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: BrdU RPN202 1:1000 e proliferante de antígeno nuclear celular (PCNA) 1:500, 100 μL por deslizamento de cobertura.
      NOTA: Para preservar o anticorpo, pode-se utilizar um volume menor, 75-100 μL para um deslizamento de cobertura de 22 x 22 mm, 50-75 μL para uma mancha de cobertura de 18 x 18 mm.
    2. Em cada deslizamento de cobertura, adicione 100 μL de solução de anticorpos primários. Cubra as tampas com um quadrado de parafilm usando pinças, e posicione cuidadosamente o parafilm para não criar bolhas.
    3. Cubra a placa em papel alumínio e incuba o anticorpo primário durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
    4. Remova os quadrados de parafilm e lave as tampas três vezes com 2 mL de PBS 1x estéril.
  3. Incubação secundária de anticorpos
    1. Prepare solução secundária suficiente de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: diluição secundária anti-mouse 488 fluorescente A11011 (para BrdU) 1:800 e diluição anti-coelho 568 fluorescente secundária A11011 (para PCNA) diluição 1:800.
      NOTA: As cores utilizadas podem ser alteradas para atender às necessidades experimentais. A marca específica utilizada pode ser encontrada na Tabela de Materiais.
    2. Adicione em cada tampalip 100 μL de solução de anticorpos secundários, cubra as tampas com um quadrado de parafilm usando pinças e posicione cuidadosamente o parafilm sem bolhas.
    3. Incubar o anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1h com a placa coberta de papel alumínio.
    4. Lave as tampas três vezes com 2 mL de 1x PBS.
  4. Coloração nuclear
    1. Prepare um volume de 2 mL por deslizamento de cobertura de 1x PBS contendo 4',6-diamidino-2-fenilômicos (DAPI) em uma concentração final de 1 μg/mL (1:1000).
    2. Adicione em cada tampalip 2 mL da solução DAPI. Incubar as tampas à temperatura ambiente por 10 minutos com a placa coberta de papel alumínio. Lave as tampas duas vezes com 1x PBS.
    3. Cubra as tampas com 1x PBS e use uma agulha ou uma pinça fina para levantar a tampa da parte inferior do poço. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido tocando uma borda suavemente em uma toalha de papel.
      NOTA: Tenha cuidado para não soltar o slide ou permitir que a superfície plana com as células aderentes toque no papel.
    4. Monte as tampas em slides usando 10-20 μL de mídia de montagem específica if.

5. Aquisição e análise de imagens

NOTA: A aquisição de imagens pode ser feita em vários tipos de microscópios fluorescentes. Utilizou-se um microscópio de epifluorescência com um objetivo de óleo de 63x; ver a Tabela de Materiais para a marca e modelo. Pilhas Z não são necessárias, embora possam ser de uso dependendo da linha celular e nível de coloração mitocondrial.

  1. Análise de imagem
    1. Para cada imagem, crie vários arquivos de tiff; mesclar todos os planos, mas mantenha os canais de cores separados. Importe esses arquivos para o Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) e analise usando o pipeline de contagem de manchas (Vídeo Suplementar 1).
    2. Upload das imagens (Figura Suplementar S1A).
      1. Para começar a criar o projeto, carregue o pipeline de contagem de manchas para dentro do programa e as imagens a serem analisadas na área fornecida.
      2. Use o módulo NamesAndTypes para atribuir um nome significativo a cada imagem pela qual outros módulos se referirão a ela-C01: Representando canal brdU; C02: Representando o Canal PCNA; C03: Representando o Canal DAPI.
        NOTA: Estes identificadores dependerão do microscópio; deve haver um identificador no nome do arquivo para distinguir entre os canais.
    3. Identifique qual arquivo será usado para identificar os núcleos e nomeá-lo (altere este nome conforme necessário) (ver Figura Suplementar S1B e Figura Suplementar S1C).
      1. Selecione o diâmetro do objeto entre unidades de 50 a 300 pixels, que é a faixa de tamanho aceitável para núcleos, mas altere o valor para se encaixar nos núcleos da imagem.
        NOTA: Pode ser que 50 seja um valor muito grande e impeça a identificação de núcleos menores; da mesma forma, 300 podem permitir que grandes agrupamentos de núcleos sejam contados como 1.
      2. Descarte objetos fora da faixa de diâmetro para garantir que apenas aqueles que correspondem aos critérios serão contados.
      3. Descarte objetos que toquem bordas para remover células que podem estar apenas parcialmente no campo.
      4. Aplique o limiar para se encaixar nas imagens específicas. Observe as seguintes configurações como exemplo. Alterar o fator de correção de limiar com base no quão rigorosa será a estratégia de limiar. Outras configurações incluem estratégia limiar: Global; método de limiar: Otsu; duas classes ou três classe limiar: Duas classes; escala de alisamento de limiares: 1; fator de alisamento do limiar: 1; limites inferiores e superiores no limiar: 0,0 e 1,0; método para distinguir objetos desajeitados: Forma; e método para desenhar linhas divisórias entre objetos agrupados: Propagar.
        NOTA: Para cada parâmetro, o profiler de células fornece definições complementares e possibilidade disponível para a configuração variável.
    4. Identificar o objeto primário para identificar os focos (Figura Suplementar S2A).
      1. Use as seguintes configurações: selecione a imagem de entrada: Maskedgreen; chamado de objeto primário a ser identificado: BrdUFoci; diâmetro típico do objeto: 1-15; descartar o objeto fora da faixa de diâmetro: Sim; descartar o objeto tocando a borda da imagem: Não; estratégia limiar: Adaptativo; método de limiar: Otsu; duas classes ou três de classe limiar: três classes; escala de alisamento de limiares: 1; fator de alisamento do limiar: 3; e tamanho do filtro de alisamento: 4.
    5. Intensidade de medida (Figura Suplementar S2B).
      1. Selecione a imagem a ser medida: OrigGreen.
      2. Clique em Adicionar outra imagem. Selecione a imagem a ser medida: PCNA. Selecione objetos para medir: Núcleos.
        NOTA: Este será usado para medir a intensidade de BrdU e PCNA - os dados finais que serão gráficos.

Resultados

Neste protocolo, o ensaio baseado em bromodeoxyuridina (BrdU) foi usado para medir quantitativamente a resposta de ressecção das células HeLa para danos induzidos por irradiação. As faixas de SSDNA geradas são visualizadas como focos distintos após a coloração da imunofluorescência (Figura 1A). Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração da BRDU nos núcleos (Figura 1B, Figura ...

Discussão

Este artigo descreve um método que faz uso da coloração IF para medir variações na ressecção de DNA no celulose. O padrão atual para observar um efeito na ressecção do DNA é através da coloração de RPA; no entanto, este é um método indireto que pode ser influenciado pela replicação do DNA. Anteriormente, outra técnica de SEC baseada em incorporação de DNA baseada em BrdU foi descrita para classificar as intensidades resultantes em células brdU-positivas e brdU-negativos. Esse método permit...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Marie-Christine Caron por um excelente conselho técnico. Este trabalho é apoiado por financiamento do Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. possui uma cadeira de pesquisa nível 1 no Canadá em reparação de DNA e terapêutica do câncer. J.O'S é um estudante de doutorado da FRQS, e S.Y.M é um pós-doutorando da FRQS.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 568 goat anti-rabbitMolecular probesA110111:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouseMolecular probesA110011:800
Anti PARP1 (F1-23)Homemade1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Benchtop X-ray IrradiatorCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Cell profilerBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ftFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM high glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetal Bovine serumGibco12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22Fisher scientific12 541B
Fluorescent microscopeLeicaDMI6000B63x immersion objective
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Needle
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher scientificBP337500
Tweezers

Referências

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