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要約

本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。

要約

DNA損傷応答(DDR)の研究は複雑で不可欠な分野であり、がん治療にDDR標的薬を使用することで重要性が増しています。これらの標的はポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PRP)であり、様々な形態のDNA修復を開始する。PARP阻害剤(PARPi)を用いてこれらの酵素を阻害することは、乳癌1型(BRCA1)、BRCA2、またはBRCA2のパートナーおよび局在化器(PALB2)の変異による相同組換え(HR)欠損細胞に治療上の脆弱性を与えることによって合成致死性を達成する。

PARPiで処理された細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)を蓄積する。これらの切断はDNA末端切除機構によって処理され、一本鎖(ss)DNAの形成およびその後のDNA修復につながる。BRCA1欠損の状況では、53BP1やDYNLL1などのDNA切除阻害剤の変異を介してDNA切除を再活性化すると、PARPi耐性が引き起こされます。したがって、 セルロ のDNA切除をモニターできることは、DNA修復経路のより明確な理解と、PARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要です。免疫蛍光(IF)ベースの技術により、DNA損傷後のグローバルDNA切除のモニタリングが可能になります。この戦略には、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)によるロングパルスゲノムDNA標識が必要です。DNA損傷およびDNA末端切除に続いて、得られた一本鎖DNAは、天然条件下で抗BrdU抗体によって特異的に検出される。さらに、DNA切除は、細胞周期の様々な段階を区別するために細胞周期マーカーを用いて研究することもできる。S/G2期の細胞はHR内の末端切除の研究を可能にするが、G1細胞は非相同末端結合(NHEJ)の研究に使用することができる。細胞周期弁別に結合されたこのIF法の詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。

概要

DNA修復因子の調節は、特にDNA DSB修復不全腫瘍環境において、がん治療のための絶えず進化する方法である。特定の修復因子の阻害は、DNA損傷物質に対して癌細胞を感作するために使用される独創的な戦略の1つである。何十年にもわたる研究の結果、DNA修復遺伝子のさまざまな変異が、治療戦略の選択のためのバイオマーカーとして同定されました1。その結果、DNA修復分野は、幅広い治療を確実にするための医薬品開発のハブとなり、個別化医療の概念を強化しています。

DSBは、NHEJとHR2の2つの主要な経路によって修復されます。NHEJ経路はエラーが発生しやすく、DNAエンドプロセシングをほとんどまたはまったく行わずに2つのDNA末端を迅速にライゲーションし、プロテインキナーゼ(DNA-PKcs)、Ku70/80複合体、53BP1、およびRIF1タンパク質3が関与します。対照的に、HRはBRCA14によって開始された忠実なメカニズムです。HR修復に不可欠なステップはDNA末端切除プロセスであり、これは3'-OH末端を有する一本鎖(ss)DNAにつながる切断末端の分解である。BRCA1は、5'~3'DNA切除に関与する切除体MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1を形成する下流タンパク質のリクルートを促進します5。

初期末端切除は、MRE11のエンドヌクレアーゼ活性を介して達成され、DNA2およびEXO1ヌクレアーゼによるさらなる処理を可能にする。生成されたssDNAオーバーハングは、レプリケーションプロテインA(RPA)によって迅速にコーティングされ、さらなる処理から保護されます。続いて、BRCA2、PALB2、およびBRCA1は、RPAの変位および相同性指向性修復機構に必要なRAD51ヌクレオフィラメントの組み立てを媒介するために関与する。NHEJとHRの使用の微妙なバランスは、ゲノム完全性の最適な維持のために必要である。経路の選択は、細胞周期の段階に依存する。HRは、DNA切除が最高レベルにあるS期からG2期にかけて優先的に使用され、姉妹染色分体が適切な修復を確実にするために利用可能である。

ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP-1)は、DSBにリクルートされた最も初期のタンパク質の1つである。これは、切除活性とNHEJ5,6に関与する下流エフェクターの組み立ての両方を調節する。PARP-1は、複製中のDNA一本鎖切断修復にも必要です7,8。DNA修復におけるその重要な役割のために、PARP阻害剤(PARPi)は癌治療として使用されている。いくつかのHR欠損がんにおいて、PARPi治療は、代替経路を介して蓄積された損傷を修復するHR欠損細胞の能力がないため、合成致死的応答をもたらす9,10。現在、FDAが承認したPARPiは、オラパリブ、ルカパリブ、ニリパリブ、タラゾパリブ(BMN 673とも呼ばれる)の4種類で、乳がんや卵巣がんのさまざまな治療に使用されています11。しかし、PARPi耐性は一般的であり、1つの潜在的な原因は、HR能力の再獲得によって生じる12。照射の存在下でのPARP−1の喪失または阻害は、切除体機構を調節不全にし、より長いssDNA経路の蓄積をもたらす13。したがって、インビボでのDNA切除の詳細な研究は、DNA修復経路のより明確な理解と、その後のがん治療およびPARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要である。

DNA切除イベントを検出するためにいくつかの方法が採用されています5。そのような方法の1つは、抗RPA抗体を使用してストレス誘発DSB後に切除されたDNAの間接染色および可視化を可能にする古典的なIFベースの技術である。ゲノムDNAを5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)で標識し、ssDNAのみを検出することは、DNA切除事象の直接測定です。これは、DNA複製などの複数の細胞プロセスに関与するRPAのモニタリングを回避します。本明細書に記載の方法では、単一細胞周期の間BrdUと共にインキュベートされた細胞は、BrdUが複製細胞DNAの1本の鎖に組み込まれることを可能にする。切除に続いて、IF染色は、抗BrdU抗体の使用により、ssDNA形態においてのみBrdU検出を可能にする条件下で行われる。この抗体は、露出したBrdUヌクレオチドにのみアクセスでき、二本鎖DNAに組み込まれたものは検出しません。蛍光顕微鏡を用いて、切除されたDNAを点状BrdU/ssDNA病巣の形で可視化することができる。これらの病巣の核強度は、DNA損傷後の切除を定量化するための読み出しとして使用することができる。この論文では、ほとんどの哺乳動物細胞株に適用できるこの方法のプロセスを段階的に説明します。この方法は、セル ロのDNA末端切除をモニタリングする簡単な方法として、概念実証として幅広い有用性を持つべきである。

プロトコル

1. 細胞培養、処理、およびカバースリップの準備

注: すべての細胞プレーティング、トランスフェクション、および処理は、照射を除き、滅菌細胞培養フードの下で行う必要があります。

  1. 1日目
    1. 6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処理のための〜150,000個のHeLa細胞をプレート化します。
      注: トランスフェクションを行う場合は、めっき時に逆方向トランスフェクションを行うか、めっきの数時間後に順方向トランスフェクションを実行して付着性を保つことをお勧めします。逆トランスフェクションは、細胞が加えられる前にトランスフェクションミックスをカバースリップに加えることによって達成されます。したがって、トランスフェクションは細胞が接着し始める前に開始されます。対照的に、フォワードトランスフェクションは、通常翌日に表面に付着後のトランスフェクションミックスを添加することです。しかし、細胞が接着するのに十分な時間が与えられれば、これを同じ日に行うことができる。
    2. この方法のために、4つのウェルを使用する:ウェル1:siRNAコントロール(siCTRLと呼ばれる);ウェル2:PARP−1に対するsiRNA(siPARP−1);ウェル3:未処理;ウェル4:照射の1時間前に5 μM BMN673で処理する細胞。
      注:このプロトコルでは、すべてのテストは照射条件下で実施されました(セクション1.3を参照)。
    3. トランスフェクションプロトコルでは最大3日間のインキュベーションが可能ですが、5% CO2加 湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。BrdU処理前のインキュベーション時間は、siRNAトランスフェクション効率に依存する。トランスフェクションがない場合、16時間のインキュベーションでカバースリップへの付着と細胞増殖を可能にするのに十分です。
      注:インキュベーターの条件は、使用する細胞株に応じて変更することができます。
  2. 2日目
    1. 適切な培養培地に終濃度10μMのBrdUを添加し、16時間(1細胞周期)インキュベートする。
      注:BrdU溶液はジメチルスルホキシド中で調製される。使用した原液は10mMであり、-20°Cでアリコートに貯蔵される。
  3. 3日目
    1. プレートに総線量5GyのX線照射(例えば、小動物用照射器とベンチトップ型照射器など、照射器の種類によって照射線量が異なります)を照射します。使用した照射器のブランドとモデルについては、 材料表 を参照してください。
    2. プレートをインキュベーターに戻し、3時間細胞を解放する。
    3. 3時間のインキュベーション期間中、2つの緩衝液、AおよびB、ならびに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に調製する。
      注:緩衝液AおよびBおよびスクロースは、汚染を防ぐために新鮮なスクロース溶液を使用して、固定の日に新鮮に調製する必要があります。
      1. 緩衝液A(抽出前緩衝液)を、 表1に記載の順序(30mL)に従って調製する。
        注:1Mスクロースは、汚染を防ぐために使用日に準備する必要があります。
      2. 表1に記載の順序に従って緩衝液B(細胞骨格剥離緩衝液)(30mL)を調製する。
        注:緩衝液Bは、Tween-20およびデオキシコール酸ナトリウム溶液の沈殿を防ぐために、引用された順序で調製されなければならない。
      3. 4%PFA、1条件あたり2mL(10mL)を、化学フードの下で調製する(表1)。

2. 事前抽出と固定

注:すべての事前抽出および固定は、氷上または4°Cで組織培養プレートに残っているカバースリップで行われます。カバースリップは、取り付けの最後のステップでのみ持ち上げられます(説明を参照)。

  1. 抽出前
    1. 培地を吸引し、細胞を1x PBSで2回注意深く洗浄し、PBSを除去した。2mLの抽出前バッファーAを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。
      注:バッファー A でのインキュベーション時間が延長されないことが重要です。抽出前バッファーでの長時間のインキュベーションは、カバースリップから剥離した細胞の数の増加をもたらすでしょう。あるいは、4°Cでのインキュベーションの代わりに、氷上でインキュベーションを行うこともできます。
    2. 吸引によってバッファAを除去します。
      メモ: バッファ A を取り外した後はカバースリップを洗わないでください。次の手順に進みます。
    3. 2mLの細胞骨格ストリッピングバッファーBを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。バッファーBを注意深く吸引し、1x PBSで細胞を1回慎重に洗浄する。1x PBSを慎重に吸引します。
  2. 固定
    1. 化学フードの下に2mLの4%PFAを加えて細胞を固定する。
      注:PFAは有毒であり、化学的フードの下で操作する必要があります。
    2. 細胞を室温で20分間インキュベートする。カバースリップを1x PBSで2回洗い、余分なものを吸引します。
    3. カバースリップを100%冷メタノールで覆い、-20°Cで5分間インキュベートします。1x PBSで2回洗ってください。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。カバースリップは、1x PBSで4°Cで保存し、必要に応じてプレートをアルミホイルで包むことができます。細胞は、IFプロトコルを継続する前に5日以上保持してはならない。

3. 透過処理

  1. 細胞を、0.5% Triton X-100を含む2 mLの1x PBSと共に室温で15分間インキュベートする。カバースリップを2mLの1x PBSで3回洗ってください。

4. 免疫染色

  1. ブロック手順
    1. カバースリップあたり 2 mL を使用するのに十分な新鮮なブロッキングバッファー (1x PBS 中の 3% BSA) を準備します。
      注: 抗体溶液を作るために、ブロッキングバッファーを 5mL 余分に用意してください。
    2. 各ウェルに2mLのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートする。
  2. 一次抗体インキュベーション
    1. 一次抗体溶液を新鮮なブロッキングバッファーで調製する:BrdU RPN202 1:1000および増殖細胞核抗原(PCNA)1:500、カバースリップあたり100 μL。
      注: 抗体を保存するために、22 x 22 mm カバースリップの場合は 75 ~ 100 μL、18 x 18 mm カバースリップの場合は 50 ~ 75 μL と、より小さな容量を使用できます。
    2. 各カバースリップに、100μLの一次抗体溶液を加える。ピンセットを使用してカバースリップを正方形のパラフィルムで覆い、泡が出ないようにパラフィルムを慎重に配置します。
    3. プレートをアルミ箔で覆い、加湿チャンバー内で一次抗体を4°Cで一晩インキュベートした。
    4. パラフィルムの正方形を取り出し、カバースリップを2mLの滅菌1x PBSで3回洗浄する。
  3. 二次抗体インキュベーション
    1. 新鮮なブロッキングバッファー中に十分な二次抗体溶液を調製する:抗マウス488蛍光二次A11011(BrdU用)希釈1:800および抗ウサギ568蛍光二次A11011(PCNA用)希釈1:800。
      注:使用される色は、実験的なニーズに合わせて変更することができます。使用される特定のブランドは、 材料表に記載されています。
    2. 各カバースリップに100μLの二次抗体溶液を加え、ピンセットを使用して正方形のパラフィルムでカバースリップを覆い、気泡なしでパラフィルムを慎重に配置する。
    3. 二次抗体を、アルミニウム箔で覆われたプレートで室温で1時間インキュベートする。
    4. カバースリップを2mLの1x PBSで3回洗ってください。
  4. 核染色
    1. 終濃度1 μg/mL(1:1000)で4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む1x PBSのカバースリップあたり2mLの容量を調製する。
    2. 各カバースリップに2mLのDAPI溶液を加える。カバースリップを室温で10分間インキュベートし、プレートをアルミホイルで覆った。カバースリップを1x PBSで2回洗ってください。
    3. カバースリップを 1x PBS で覆い、針または細かいピンセットを使用してカバースリップをウェルの底から持ち上げます。余分な液体を拭き取って、片方の端をペーパータオルで軽く叩いて慎重に拭き取ります。
      メモ: スライドを落とさないように、または付着セルのある平らな面が用紙に触れないように注意してください。
    4. 10~20 μLのIF特異的マウント媒体を使用して、カバースリップをスライドに取り付けます。

5. 画像の取得と解析

メモ:画像取得は、いくつかのタイプの蛍光顕微鏡で行うことができます。63倍の油対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡を使用した。ブランドとモデル の材料表 を参照してください。Zスタックは必須ではありませんが、細胞株およびミトコンドリア染色のレベルに応じて使用できます。

  1. 画像解析
    1. 画像ごとに、複数の tiff ファイルを作成します。すべての平面をマージしますが、カラーチャンネルは別々に保ちます。これらのファイルをセルプロファイラ(The Broad Institute https://cellprofiler.org/home)にインポートし、スペックルカウントパイプライン(補足ビデオ1)を使用して分析します。
    2. 画像をアップロードする(補足図S1A)。
      1. プロジェクトの作成を開始するには、スペックルカウントパイプラインをプログラムにロードし、提供された領域で分析する画像をロードします。
      2. NamesAndTypes モジュールを使用して、他のモジュールが参照する意味のある名前を各イメージに割り当てます-C01: BrdU チャンネルの表現;C02: PCNA チャネルを表す;C03: DAPI チャネルを表します。
        注:これらの識別子は顕微鏡によって異なります。ファイル名には、チャネルを区別するための識別子が必要です。
    3. 核を識別するために使用するファイルを特定し、それに名前を付けます (必要に応じてこの名前を変更します) (補足図 S1B および補足図 S1C を参照)。
      1. オブジェクトの直径を 50 ~ 300 ピクセル単位で選択します。これは、核の許容可能なサイズ範囲ですが、画像内の核に合わせて値を変更します。
        注: 50 は値が大きすぎて、より小さい核が識別できない可能性があります。同様に、300は、核の大きなグループを1として数えることを可能にするかもしれない。
      2. 直径範囲外のオブジェクトを破棄して、基準に一致するオブジェクトのみがカウントされるようにします。
      3. 罫線に接触するオブジェクトを破棄して、フィールド内に部分的にしか存在しないセルを削除します。
      4. 特定の画像に合わせてしきい値を適用します。例として、次の設定に注意してください。しきい値設定戦略の厳格さに基づいて、しきい値調整係数を変更します。その他の設定には、しきい値戦略が含まれます: グローバル;閾値化方法:大津;2つのクラスまたは3つのクラスのしきい値:2つのクラス。しきい値平滑化スケール: 1;しきい値平滑化係数: 1;しきい値の下限と上限: 0.0 および 1.0;凝集したオブジェクトを区別する方法:形状;凝集したオブジェクト間に分割線を引く方法:伝播。
        注: 各パラメーターについて、セル・プロファイラーは、変数設定に補完的な定義と使用可能な可能性を提供します。
    4. 病巣を特定する一次対象を特定する(補足図S2A)。
      1. 次の設定を使用します: 入力画像を選択します: マスクドグリーン;識別されるプライマリオブジェクトに名前を付けました: BrdUFoci;オブジェクトの典型的な直径:1-15;直径範囲外のオブジェクトを破棄します:はい。画像の境界線に触れるオブジェクトを破棄します:いいえ。しきい値戦略:適応性;閾値化方法:大津;2つのクラスまたは3つのクラスのしきい値:3つのクラス。しきい値平滑化スケール: 1;しきい値平滑化係数: 3;平滑化フィルターのサイズ:4。
    5. 強度を測定する(補足図S2B)。
      1. 測定する画像を選択します:オリッググリーン。
      2. [ 別の画像を追加]をクリックします。測定する画像(PCNA)を選択します。測定するオブジェクトを選択します: Nuclei。
        注: これは、BrdU および PCNA 強度 (グラフ化される最終データ) を測定するために使用されます。

結果

このプロトコールでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)ベースのアッセイを使用して、放射線誘発損傷に対するHeLa細胞の切除応答を定量的に測定した。生成されたssDNAトラックは、免疫蛍光染色後に別個の病巣として可視化される(図1A)。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるBrdU染色の総積分強度として表した(図1B、補足図S1、補足図

ディスカッション

本稿では、IF染色を用いてセルロのDNA切除の変動を測定する方法について説明する。DNA切除への影響を観察するための現在の標準は、RPA染色によるものです。しかし、これはDNA複製の影響を受ける可能性のある間接的な方法です。以前に、BrdU陽性およびBrdU陰性細胞において生じる強度を分類するための別のBrdU組み込みベースのDNA切除IF技術が記載されていた。この方法により、HRを受?...

開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

マリー=クリスティーヌ・キャロンの卓越した技術的アドバイスに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所J.Y..M(CIHR FDN-388879)からの資金提供によって支えられています。J.-Y..M.は、DNA修復およびがん治療のTier 1カナダ研究委員長を務めています。J.O'SはFRQS博士課程の学生フェローであり、S.Y.MはFRQSポスドクフェローです。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 568 goat anti-rabbitMolecular probesA110111:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouseMolecular probesA110011:800
Anti PARP1 (F1-23)Homemade1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Benchtop X-ray IrradiatorCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Cell profilerBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ftFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM high glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetal Bovine serumGibco12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22Fisher scientific12 541B
Fluorescent microscopeLeicaDMI6000B63x immersion objective
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Needle
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher scientificBP337500
Tweezers

参考文献

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