Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

Abstract

המחקר של תגובת נזק ה- DNA (DDR) הוא תחום מורכב וחיוני, אשר רק הפך חשוב יותר בשל השימוש בתרופות ממוקדות DDR לטיפול בסרטן. מטרות אלה הן פולי (ADP-ריבוז) פולימראזים (PARPs), אשר יוזמים צורות שונות של תיקון DNA. עיכוב אנזימים אלה באמצעות מעכבי PARP (PARPi) משיג קטלניות סינתטית על ידי מתן פגיעות טיפולית בתאים רקומבינציה הומולוגית (HR) לקוי עקב מוטציות בסוג סרטן השד 1 (BRCA1), BRCA2, או שותף ולוקליזר של BRCA2 (PALB2).

תאים שטופלו ב- PARPi צוברים הפסקות דנ"א כפולות גדילים (DSB). הפסקות אלה מעובדות על ידי מכונות כריתת קצה ה- DNA, מה שמוביל להיווצרות DNA חד-גדילי (ss) ותיקון DNA לאחר מכן. בהקשר של מחסור ב-BRCA1, כריתת דנ"א מחודשת באמצעות מוטציות במעכבי כריתת דנ"א, כגון 53BP1 ו-DYNLL1, גורמת להתנגדות PARPi. לכן, היכולת לפקח על כריתת DNA בצלולו היא קריטית להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על התנגדות PARPi. טכניקות מבוססות אימונופלואורסצנטיות (IF) מאפשרות ניטור של כריתת דנ"א גלובלית לאחר נזק לדנ"א. אסטרטגיה זו דורשת תיוג דנ"א גנומי בעל דופק ארוך עם 5-ברומו-2′-deoxyuridine (BrdU). בעקבות נזק לדנ"א וחיתוך קצה דנ"א, הדנ"א החד-גדילי שנוצר מזוהה במיוחד על ידי נוגדן אנטי-BrdU בתנאים מקומיים. יתר על כן, כריתת DNA ניתן גם ללמוד באמצעות סמני מחזור התא כדי להבדיל בין שלבים שונים של מחזור התא. תאים בשלב S/G2 מאפשרים את חקר כריתת הקצה בתוך משאבי אנוש, בעוד שתאי G1 יכולים לשמש לחקר צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ). פרוטוקול מפורט עבור שיטת IF זו בשילוב עם אפליית מחזור תאים מתואר במאמר זה.

Introduction

אפנון של גורמי תיקון DNA היא שיטה המתפתחת ללא הרף לטיפול בסרטן, במיוחד בסביבות גידול לקוי תיקון DSB DNA. עיכוב גורמי תיקון ספציפיים הוא אחת האסטרטגיות הגאוניות המשמשות לרגישות תאים סרטניים לסוכנים מזיקים לדנ"א. עשרות שנים של מחקר הובילו לזיהוי מוטציות שונות של גנים לתיקון DNA כסמנים ביולוגיים לבחירות אסטרטגיה טיפולית1. כתוצאה מכך, תחום תיקון הדנ"א הפך למרכז לפיתוח תרופות כדי להבטיח מגוון רחב של טיפולים, להעצים את מושג הרפואה המותאמת אישית.

DSBs מתוקנים על ידי שני מסלולים עיקריים: NHEJ ו- HR2. מסלול ה- NHEJ נוטה לשגיאות, קושר במהירות את שני קצות הדנ"א עם עיבוד קצה של דנ"א מועט עד אפסי וכולל את קינאז החלבון (DNA-PKcs), קומפלקס Ku70/80, 53BP1 וחלבוני RIF13. לעומת זאת, משאבי אנוש הוא מנגנון נאמן ביוזמת BRCA14. צעד חיוני בתיקון משאבי אנוש הוא תהליך כריתת קצה ה- DNA, שהוא השפלה של הקצוות השבורים המובילים לדנ"א חד-גדילי (ss) עם קצות 3'-OH. BRCA1 מאפשר את גיוס החלבונים במורד הזרם היוצרים את ה- MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, המעורבים בכריתת ה- DNA 5 ' עד 3 '.

כריתת הקצה הראשונית מתבצעת באמצעות פעילות אנדונוקלאז של MRE11, המאפשר עיבוד נוסף על ידי נוקלאזים DNA2 ו- EXO1. ה- ssDNA overhangs שנוצר מצופים במהירות על ידי חלבון שכפול A (RPA) כדי להגן עליהם מפני עיבוד נוסף. לאחר מכן, BRCA2, PALB2 ו- BRCA1 עוסקים כדי לתווך את העקירה של RPA ואת ההרכבה של גרעין RAD51 הנדרש עבור מנגנון תיקון מונחה הומולוגיה. איזון עדין בין השימוש ב- NHEJ למשאבי אנוש נחוץ לשמירה מיטבית על שלמות גנומית. בחירת המסלול תלויה בשלב מחזור התא. משאבי אנוש משמשים באופן מועדף במהלך שלבי S עד G2 שבהם כריתת DNA היא ברמה הגבוהה ביותר, ואת הכרומטידים האחות זמינים כדי להבטיח תיקון נאות.

פולי (ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP-1) הוא אחד החלבונים המוקדמים ביותר שגויסו ל- DSB. זה מסדיר הן את פעילות הכריתה ואת ההרכבה של מפעילי במורד הזרם המעורבים NHEJ5,6. PARP-1 נדרש גם עבור DNA חד גדיל תיקון הפסקה תקוע במהלך שכפול7,8. בשל תפקידו החשוב בתיקון DNA, מעכבי PARP (PARPi) משמשים כטיפולים בסרטן. במספר סוגי סרטן לקויי משאבי אנוש, טיפול PARPi מוביל לתגובה קטלנית סינתטית בשל חוסר היכולת של תאים לקויי משאבי אנוש לתקן את הנזק המצטבר באמצעות מסלול חלופי9,10. ישנם כיום ארבעה PARPi שאושרו על ידי ה-FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib, ו Talazoparib (המכונה גם BMN 673), אשר משמשים לטיפולים שונים בסרטן השד והשחלות11. עם זאת, התנגדות PARPi היא נפוצה, וסיבה פוטנציאלית אחת מתעוררת באמצעות השגת מיומנות משאבי אנוש12. אובדן או עיכוב של PARP-1 בנוכחות dysregulates הקרנה dysregulates המכונות resectosome, המוביל הצטברות של עלונים ssDNA ארוכים יותר13. לכן, מחקר מעמיק של כריתת DNA ב vivo הוא קריטי להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח לאחר מכן של אסטרטגיות חדשות לטיפול בסרטן ולהתגבר על התנגדות PARPi.

היו מספר שיטות שהופעלו כדי לזהות אירועי כריתת דנ"א5. שיטה אחת כזו היא הטכניקה הקלאסית המבוססת על IF המאפשרת כתמים עקיפים והדמיה של ה- DNA החתוך לאחר DSB המושרה בלחץ באמצעות נוגדן אנטי RPA. תיוג דנ"א גנומי עם 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) וגילוי רק ssDNA היא מדידה ישירה של אירועי כריתת DNA. זה עוקף את הניטור של RPA, אשר מעורב בתהליכים תאיים מרובים כגון שכפול DNA. בשיטה המתוארת כאן, תאים המדגרים עם BrdU למחזור תא יחיד מאפשרים ל- BrdU להיות משולב בגדיל אחד של ה- DNA התאי המשכפל. לאחר כריתה, אם כתמים מבוצעים בתנאים המאפשרים שבו גילוי BrdU רק בצורת ssDNA, עם שימוש בנוגדן נגד BrdU. נוגדן זה יכול לגשת רק לנוקלאוטידים חשופים של BrdU ולא יזהה את אלה המשולבים בדנ"א דו-גדילי. באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתן לדמיין את ה- DNA החתוך בצורה של מוקדי BrdU / ssDNA לנקב. העוצמה הגרעינית של מוקדים אלה יכולה לשמש כקריאה לכימות כריתה בעקבות נזק לדנ"א. מאמר זה מתאר צעד אחר צעד את התהליכים של שיטה זו, אשר ניתן להחיל על רוב קווי התאים של היונקים. שיטה זו צריכה להיות של תועלת רחבה כדרך פשוטה של ניטור כריתת קצה DNA בצלולו, כהוכחה של מושג.

Protocol

1. תרבית תאים, טיפולים והכנת כיסויים

הערה: כל ציפוי התאים, הטרנספקטים והטיפולים, מלבד הקרנה, צריכים להתקיים תחת מכסה מנוע סטרילי של תרבית תאים.

  1. יום 1
    1. בצלחת של 6 בארות, מניחים כיסוי יחיד בכל באר לכמה שיותר תנאים לפי הצורך. צלחת ~ 150,000 תאי HeLa עבור transfection או טיפול תרופתי, לפי הצורך.
      הערה: אם transfecting, מומלץ לעשות transfection הפוך בזמן הציפוי, או שניתן לעשות transfection קדימה כמה שעות לאחר ציפוי כדי לאפשר דבקות. העברה הפוכה מתבצעת על ידי הוספת תערובת הטרנספקטיה לכיסוי לפני שהתאים מתווספים; לכן, טרנספקטיה מתחילה לפני שהתאים מתחילים להידבק. טרנספקטיבה קדמית, לעומת זאת, היא תוספת של תערובת טרנספקטיה לאחר הדבקה על פני השטח בדרך כלל ביום שלמחרת. עם זאת, ניתן לעשות זאת באותו יום, בתנאי שניתן מספיק זמן לתאים לדבוק.
    2. עבור שיטה זו, השתמש 4 בארות: ובכן 1: בקרת siRNA (המכונה siCTRL); ובכן 2: siRNA נגד PARP-1 (siPARP-1); ובכן 3: לא מטופל; ובכן 4: תאים לטיפול עם 5 מיקרומטר BMN673 1 h לפני הקרנה.
      הערה: בפרוטוקול זה, כל הבדיקות נערכו בתנאים מוקרן (ראה סעיף 1.3).
    3. לדגור על התאים ב 37 °C (5 ° C) בחממה לחה 5% CO2 לילה, אם כי פרוטוקול transfection מאפשר עד 3 ימים של דגירה. זמן הדגירה לפני הטיפול ב- BrdU יהיה תלוי ביעילות ההעברה של siRNA. אם אין טרנספקטיה, דגירה עבור 16 שעות מספיקה כדי לאפשר דבקות בכיסוי וכמה צמיחת תאים.
      הערה: ניתן לשנות את תנאי החממה בהתאם לקו התא בו נעשה שימוש.
  2. יום 2
    1. הוסף BrdU בריכוז סופי של 10 מיקרומטר במדיה culturing המתאים, ודגר במשך 16 שעות (מחזור תא אחד).
      הערה: הפתרון BrdU מוכן דימתילסולפוקסיד; פתרון המלאי המשמש הוא 10 מ"ר והוא מאוחסן aliquots ב -20 °C (60 °F).
  3. יום 3
    1. להקרין את הצלחות עם מנה כוללת של 5 Gy של הקרנת רנטגן (לשנות את המינון של הקרנה בהתאם לסוג הקרינה, למשל, הקרנת בעלי חיים קטנים לעומת הקרנת ספסל). עיין בטבלת החומרים עבור המותג והמודל של הקרינה המשמשים.
    2. להחזיר את הצלחות לאינקובטור, ולשחרר את התאים במשך 3 שעות.
    3. במהלך תקופת הדגירה של 3 שעות, הכן את שני המאגרים, A ו- B, ו- 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
      הערה: חוצצים A ו- B וסוכרוז צריך להיות מוכן טרי ביום של קיבעון, באמצעות פתרון סוכרוז טרי כדי למנוע זיהום.
      1. הכן מאגר A (מאגר קדם-חילוץ), לפי הסדר (30 מ"ל) המתואר בטבלה 1.
        הערה: סוכרוז 1M צריך להיות מוכן ביום השימוש כדי למנוע זיהום.
      2. הכן מאגר B (מאגר הפשטת Cytoskeleton) בהתאם לסדר המתואר בטבלה 1 (30 מ"ל).
        הערה: מאגר B חייב להיות מוכן בסדר המצוטט כדי למנוע משקעים של Tween-20 ופתרון deoxycholate נתרן.
      3. הכינו 4% PFA, 2 מ"ל לכל תנאי (10 מ"ל), מתחת למכסה המנוע הכימי (טבלה 1).

2. טרום מיצוי וקיבעון

הערה: כל טרום החילוץ וקיבוע מבוצעים עם כיסויים שנותרו צלחת תרבית הרקמות על קרח או ב 4 °C (4 °F); כיסוי הכיסוי מוסר רק בשלב האחרון של ההרכבה (ראה דיון).

  1. טרום חילוץ
    1. לשאוף את המדיום, לשטוף בזהירות את התאים פעמיים עם 1x PBS, ולהסיר את PBS. מוסיפים 2 מ"ל של מאגר טרום מיצוי A ומיד לדגור ב 4 °C (60 °F) במשך 10 דקות.
      הערה: חשוב שזמן הדגירה במאגר A לא יוארך. דגירה ממושכת במאגרי טרום החילוץ תגרום למספר גדל והולך של תאים מנותקים מהכיסוי. לחלופין, במקום דגירה ב 4°C, דגירה יכולה להיעשות על קרח.
    2. הסר את מאגר A באמצעות שאיפה.
      הערה: אין לשטוף את כתמי הכיסוי לאחר הסרת המאגר A. המשך לשלב הבא.
    3. הוסף 2 מ"ל של ציטוסקלטון הפשטת חיץ B ומיד לדגור ב 4 °C (60 °F) במשך 10 דקות. שאפו בזהירות את מאגר B, ושטפו בזהירות את התאים פעם אחת עם 1x PBS. בזהירות לשאוף את 1x PBS.
  2. קיבוע
    1. תקן את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של 4% PFA מתחת למכסה המנוע הכימי.
      הערה: PFA רעיל ויש לתמרן אותו תחת מכסה המנוע הכימי.
    2. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לשטוף את כיסוי פעמיים עם 1x PBS, ושאיפה את עודף.
    3. מכסים את כיסויי הכיסוי עם 100% מתנול קר, ודוללים את כיסויים ב -20 °C (80 °F) במשך 5 דקות. לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כיסויים ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) ב 1x PBS ואת הצלחת עטופה בנייר אלומיניום במידת הצורך. אין לשמור את התאים יותר מ- 5 ימים לפני המשך פרוטוקול IF.

3. פרמביליזציה

  1. לדגור על התאים עם 2 מ"ל של 1x PBS המכיל 0.5% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS.

4. חיסונים

  1. שלב חסימה
    1. הכינו מספיק מאגר חסימה טרי (3% BSA ב-1x PBS) כדי להשתמש ב-2 מ"ל לכל כיסוי.
      הערה: הכן מאגר נוסף של 5 מ"ל לחסימה כדי להפוך את פתרונות הנוגדנים.
    2. מוסיפים 2 מ"ל של חיץ חסימה לכל באר ודגורים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  2. דגירת נוגדנים ראשונית
    1. הכינו את פתרון הנוגדנים העיקרי במאגר חסימה טרי: BrdU RPN202 1:1000 ואנטיגן גרעיני של תאים מתרבים (PCNA) 1:500, 100 μL לכל כיסוי.
      הערה: כדי לשמר את הנוגדן, ניתן להשתמש בנפח קטן יותר, 75-100 μL עבור כיסוי 22 x 22 מ"מ כיסוי, 50-75 μL עבור כיסוי 18 x 18 מ"מ כיסוי.
    2. על כל כיסוי, להוסיף 100 μL של פתרון נוגדנים ראשוני. לכסות את כיסויים עם ריבוע של parafilm באמצעות פינצטה, בזהירות למקם את parafilm כדי לא ליצור בועות.
    3. לכסות את הצלחת בנייר אלומיניום, ולדגור את הנוגדן העיקרי לילה ב 4 °C (50 °F) בתא לח.
    4. הסר את ריבועי parafilm, ולשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם 2 מ"ל של סטרילי 1x PBS.
  3. דגירה משנית של נוגדנים
    1. הכן מספיק פתרון נוגדנים משני במאגר חסימה טרי: אנטי עכבר 488 פלואורסצנטי משני A11011 (עבור BrdU) דילול 1:800 ואנטי ארנב 568 פלואורסצנטי משני A11011 (עבור PCNA) דילול 1:800.
      הערה: ניתן לשנות את הצבעים בהם נעשה שימוש כך שיתאימו לצרכים הניסיוניים. המותג הספציפי המשמש ניתן למצוא בטבלת החומרים.
    2. מוסיפים על כל כיסוי 100 μL של פתרון נוגדנים משני, לכסות את כיסוי עם ריבוע של parafilm באמצעות פינצטה, ולמקם בזהירות את parafilm ללא בועות.
    3. דגרו בנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כשהצלחת מכוסה בנייר אלומיניום.
    4. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS.
  4. כתמים גרעיניים
    1. הכן נפח של 2 מ"ל לכל כיסוי של 1x PBS המכיל 4',6-diamidino-2-פנילינדולה (DAPI) בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל (1:1000).
    2. הוסף על כל כיסוי 2 מ"ל של פתרון DAPI. דגר את כיסויים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם הצלחת מכוסה בנייר אלומיניום. לשטוף את כיסויים פעמיים עם 1x PBS.
    3. מכסים את כיסויי הכיסוי עם 1x PBS, ומשתמשים במחט או בפינצטה עדינה כדי להרים את כיסוי הכיסוי מתחתית הבאר. בזהירות כתם את הנוזל העודף על ידי הקשה על קצה אחד בעדינות על מגבת נייר.
      הערה: היזהר שלא להפיל את השקופית או לאפשר למשטח השטוח עם התאים החסידים לגעת בנייר.
    4. התקן את כתמי הכיסוי בשקופיות באמצעות 10-20 μL של מדיית הרכבה ספציפית ל- IF.

5. רכישה וניתוח של תמונות

הערה: רכישת תמונה יכולה להיעשות על מספר סוגים של מיקרוסקופים פלואורסצנטיים. נעשה שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מטרת שמן פי 63; עיין בטבלת החומרים של המותג והדגם. Z-stacks אינם נדרשים, אם כי הם עשויים להיות שימושיים בהתאם לקו התא ורמת הכתמים המיטוכונדריאליים.

  1. ניתוח תמונה
    1. עבור כל תמונה, צור קבצי tiff מרובים; מזגו את כל המישורים, אך שמרו על ערוצי הצבעים בנפרד. יבא קבצים אלה לתוך מאבחן התא (מכון רחב https://cellprofiler.org/home) וניתח באמצעות צינור ספירת כתמים (וידאו משלים 1).
    2. העלו את התמונות (איור S1A משלים).
      1. כדי להתחיל ליצור את הפרוייקט, טען את צינור ספירת כתמים לתוכנית ואת התמונות שיש לנתח באזור שסופק.
      2. השתמש במודול NamesAndTypes כדי להקצות שם בעל משמעות לכל תמונה שבאמצעותה מודולים אחרים יפנו אליו-C01: ייצוג ערוץ BrdU; C02: מייצג ערוץ PCNA; C03: מייצג את ערוץ DAPI.
        הערה: מזהים אלה יהיו תלויים במיקרוסקופ; צריך להיות מזהה בשם הקובץ כדי להבחין בין הערוצים.
    3. זהה איזה קובץ ישמש לזיהוי הגרעינים ותן לו שם (שנה שם זה כנדרש) (ראה איור S1B משלים ואיור S1C משלים).
      1. בחרו בקוטר העצם שבין 50 ל-300 יחידות פיקסלים, שהוא טווח הגודל המקובל עבור גרעינים, אך שנהו את הערך כך שיתאים לגרעינים בתמונה.
        הערה: ייתכן ש- 50 הוא ערך גדול מדי ומונע זיהוי גרעינים קטנים יותר; כמו כן, 300 עשויים לאפשר לקבוצות גדולות של גרעינים להיספר כ- 1.
      2. בטל אובייקטים מחוץ לטווח הקוטר כדי להבטיח שרק אלה התואמים לקריטריונים ייספרו.
      3. בטל אובייקטים הנוגעים בגבולות כדי להסיר תאים שעשויים להיות חלקיים בלבד בשדה.
      4. החל את הסף כך שיתאים לתמונות הספציפיות. שים לב להגדרות הבאות כדוגמה. שנה את פקטור תיקון הסף בהתבסס על מידת ההחמרה של אסטרטגיית הסף. הגדרות אחרות כוללות אסטרטגיית סף: כללי; שיטת סף: Otsu; סף שתי כיתות או שלוש כיתות: שתי כיתות; סולם החלקת סף: 1; גורם החלקת סף: 1; גבולות תחתון וגבוהים על הסף: 0.0 ו- 1.0; שיטה להבחנה בין עצמים מגושמים: צורה; ושיטה לצייר קווים מפרידים בין אובייקטים מגושמים: הפצה.
        הערה: עבור כל פרמטר, מאבחן התאים מספק הגדרות משלימות ואפשרות זמינה עבור הגדרת המשתנה.
    4. זהה את האובייקט הראשי כדי לזהות את המוקדים (איור S2A משלים).
      1. השתמש בהגדרות הבאות: בחר את תמונת הקלט: מסיכה; שם האובייקט הראשי שיש לזהות: BrdUFoci; קוטר אופייני של האובייקט: 1-15; להשליך את האובייקט מחוץ לטווח הקוטר: כן; בטל את האובייקט הנוגע בגבול התמונה : לא; אסטרטגיית סף: אדפטיבית; שיטת סף: Otsu; סף שתי כיתות או שלוש כיתות: שלוש כיתות; סולם החלקת סף: 1; גורם החלקת סף: 3; וגודל מסנן החלקה: 4.
    5. מדוד עוצמה (איור S2B משלים).
      1. בחר את התמונה שיש למדוד: OrigGreen.
      2. לחץ על הוסף תמונה נוספת. בחר את התמונה שיש למדוד: PCNA. בחר אובייקטים למדידה: גרעינים.
        הערה: זה ישמש למדידת עוצמת BrdU ו- PCNA - הנתונים הסופיים שיגרפו.

תוצאות

בפרוטוקול זה, הבדיקה המבוססת על bromodeoxyuridine (BrdU) שימשה למדידת תגובת כריתה של תאי HeLa לנזק שנגרם על ידי הקרנה. רצועות ה-ssDNA שנוצרו מוצגות באופן חזותי כמוקדיים נפרדים לאחר כתמי אימונופלואורסצנטיות (איור 1A). המוקדים המזוהים כימתו אז ובאו לידי ביטוי כעוצמה המשולבת הכוללת של כתמי BrdU...

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה העושה שימוש בהכתמת IF כדי למדוד וריאציות בכריתת DNA בצלולו. התקן הנוכחי להתבוננות בהשפעה על כריתת DNA הוא באמצעות כתמי RPA; עם זאת, זוהי שיטה עקיפה שעשויה להיות מושפעת משכפול DNA. בעבר תוארה טכניקת IF נוספת המבוססת על התאגדות BrdU לסיווג העוצמות המתקבלות בתאי BrdU-positive ו- BrdU-negative. ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למארי-כריסטין קארון על העצה הטכנית יוצאת הדופן. עבודה זו נתמכת על ידי מימון של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. מחזיקה ב-Tier 1 Canada Research Chair בתיקון דנ"א וטיפול בסרטן. J.O'S הוא עמית דוקטורט FRQS, ו S.Y.M הוא עמית פוסט דוקטורט FRQS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 568 goat anti-rabbitMolecular probesA110111:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouseMolecular probesA110011:800
Anti PARP1 (F1-23)Homemade1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Benchtop X-ray IrradiatorCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Cell profilerBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ftFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM high glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetal Bovine serumGibco12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22Fisher scientific12 541B
Fluorescent microscopeLeicaDMI6000B63x immersion objective
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Needle
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher scientificBP337500
Tweezers

References

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170BrdUDNAPARP 1PARPPARPBMN673

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved