JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقل الطاقة الفلوري جزيء واحد هو الأسلوب الذي يتتبع ديناميات الحمض النووي الريبي أثناء تخليق البروتين ريبوسومات. من خلال تتبع الريبوسومات الفردية ، يتم تحديد السكان غير المتجانسين ، مما يلقي الضوء على الآليات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع التغيرات البيولوجية تشكيلية بشكل عام للكشف عن العلاقات الحيوية وظيفة في العديد من النظم الحيوية المعقدة الأخرى. يمكن لطرق جزيء واحد مراقبة الخطوات المقيدة غير المعدلة والمتوسطات الرئيسية منخفضة السكان ، والتي لا يمكن الوصول إليها عن طريق طرق الفرقة التقليدية بسبب متوسط التأثير.

Abstract

الريبوسوم هو مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يجمع البروتينات بشكل عملي على طول قوالب الحمض النووي الريبي. قطر الريبوسوم هو ما يقرب من 20 نانومتر لاستيعاب ركائز الحمض النووي الريبي كبيرة في A-, P- و E-المواقع. وبالتالي، فإن ديناميات الريبوسوم هي بطبيعة الحال دي التدريجي بسرعة. يمكن لطريقة جزيء واحد الكشف عن كل ريبوسوم بشكل منفصل وتمييز المجموعات السكانية غير الذاتية ، وهو أمر ضروري للكشف عن الآليات المعقدة للأنظمة متعددة المكونات. نحن تقرير تفاصيل طريقة smFRET على أساس المجهر نيكون Ti2 مقلوب للتحقيق في ديناميات ريبوسوم بين البروتين الريبوسوم L27 وTRNAs. وصفت L27 في موقفها الفريد Cys 53 وإعادة تشكيلها في ريبوسوم التي تم تصميمها لعدم وجود L27. وتوصف TRNA في منطقة الكوع. كما ينتقل tRNA إلى مواقع مختلفة داخل ريبوسوم خلال دورة الاستطالة، مثل ما قبل وبعد النقل، والكفاءة FRET وديناميات تظهر الاختلافات، والتي اقترحت عدد السكان الفرعي متعددة. هذه الخلايا الفرعية غير قابلة للكشف عن طريق أساليب الفرقة. تم بناء مجهر SMFRET القائم على TIRF على مجهر مقلوب يدوي أو آلي ، مع إضاءة ليزر منزلية الصنع. يتم تنقية عينات الريبوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ، وتحميلها في خلية عينة متعددة القنوات منزلية الصنع ثم تضيء عبر حقل ليزر مبشر. يمكن استخدام بقعة الليزر انعكاس لتحقيق التحكم في ردود الفعل من التركيز المثالي. يتم فصل إشارات الفلورسينس بواسطة برج فلتر مزود بمحرك ويتم جمعها بواسطة كاميرتين رقميتين من CMOS. يتم استرداد الكثافات عبر برنامج NIS-Elements.

Introduction

الريبوسوم هو ø 20 نانومتر مجمع ريبونوكليوبروتين كبير من وحدة فرعية كبيرة (50S) وصغيرة (30S). فإنه يجمع الببتيدات طويلة على طول قالب مرنا بشكل عملي وتعاوني. يرتبط ريبوسوم 30S إلى fMet-tRNAfMet و mRNA لبدء تخليق البروتين ، ثم ينضم 50S لتشكيل مجمع بدء 70S. الأحماض الأمينية جلب الحمض النووي الريبي إلى ريبوسوم في موقع A (أمينواسيل- TRNA موقع ملزم), في حين يتم عقد سلسلة بيبتيديل ممدود في موقع P (peptidyl- tRNA موقع ملزم). في مجمع ما قبل النقل ، يتم نقل سلسلة بيبتيديل إلى الحمض النووي الريبي في الموقع A مع إضافة حمض أميني واحد. وفي الوقت نفسه، فإن موقع P TRNA هو deacylated. ثم تنتقل ال A-، P-tRNAs إلى مواقع P-، E- لتشكيل مجمع ما بعد النقل، حيث يمثل الموقع الإلكتروني موقع خروج الحمض النووي الريبي. في هذه الحالة، ينتقل peptidyl-tRNA مرة أخرى إلى موقع P. تستمر دورة الاستطالة بين ما قبل وبعد الامتثال في حين أن الريبوسوم translocates على مرنا، codon واحد في وقتواحد 1. ريبوسوم هو تنسيقية للغاية من مواقع وظيفية مختلفة لجعل هذه العملية فعالة ودقيقة، مثل بين وحدة فرعية ratcheting2، tRNA تقلبات التهجين3،GTPase التنشيط4،L1 ساق فتح إغلاق5،الخ. وبالتالي، ريبوسومات بسرعة دي المرحلة لأن كل جزيء يتحرك في وتيرتها الخاصة. يمكن للأساليب التقليدية أن تستنتج فقط متوسط المعلمات الواضحة ، ولكن سيتم إخفاء الأنواع منخفضة السكان أو قصيرة الأجل في متوسط التأثير6. يمكن أن تؤدي طريقة جزيء واحد إلى كسر هذا القيد عن طريق الكشف عن كل ريبوسوم على حدة ، ثم تحديد أنواع مختلفة عن طريق إعادة الإعمارالإحصائية 7. وقد تم تنفيذ مواقع وضع العلامات المختلفة للتحقيق ديناميات ريبوسوم، مثل التفاعلات بين tRNA-tRNA8،EF-G-L119،L1-tRNA10،الخ. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال وضع العلامات على الوحدات الفرعية الكبيرة والصغيرة ، على التوالي ، لوحظت الحركيات التسعيدية بين الوحدات والتنسيق مع العوامل11،12. وفي الوقت نفسه، فإن أسلوب smFRET له تطبيقات واسعة في العمليات البيولوجية المركزية الأخرى، وأساليب FRET متعددة الألوان آخذة في الظهور13.

سابقا تم تطوير زوج فريت ريبوسوم رواية14,15. وقد أعرب عن البروتين الريبوسومي المؤتلف L27، وتنقيته، ووصفت، وأدرجت مرة أخرى في الريبوسوم. تفاعل هذا البروتين مع الحمض النووي الريبي على مسافة قريبة وساعد على استقرار الحمض النووي الريبي P-الموقع في مجمع ما بعد النقل. عندما انتقل TRNA من A- إلى P-الموقع، يتم تقصير المسافة بين هذا البروتين والجيش الملكي النيبالي، والتي يمكن تمييزها من قبل إشارة smFRET. وقد تم تحديد التجمعات السكانية الفرعية الريبوسوم متعددة باستخدام الأساليب الإحصائية و mutagenesis، وتبادل عفوية من هذه المجموعات السكانية في مجمع ما قبل ولكن ليس بعد نقل يوحي ريبوسوم هو أكثر مرونة قبل التحرك على مرنا، وأكثر صلابة خلال فك16،17،18. هذه الاختلافات ضرورية لوظيفة ريبوسوم. هنا ، يصف البروتوكول تفاصيل الريبوسوم / tRNA - وضع العلامات ، ودمجها في إعداد عينة ريبوسوم ، smFRET ، والحصول على البيانات / تحليل19.

Protocol

1. إعداد الريبوسوم المسمى و TRNA للكشف عن FRET

  1. عزل الريبوسوم دون L27 من E. القولونية سلالة IW312 وفقا للبروتوكولات القياسية20،21. استخراج الريبوسوم العادية من سلالة الإشريكية القولونية MRE600.
  2. استنساخ الجين L27 دورة في الدقيقة مع C-المحطة له الوسم في pET-21b (+) البلازميد، والتي يتم تحويلها وأعرب عنها في BL21 (DE3) خلايا pLysS15. تنقية البروتين عن طريق عمود سيفاروز معبأة مسبقا.
  3. وضع العلامات على L27
    1. احتضان 20-100 ميكرومتر من L27 المنقى في 100 ميكرولتر مع 2-10 أضعاف الزائدة من TCEP (تريس-2-كاربوكسيثيل-فوسفين) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة. المخزن المؤقت تبادل الحل في المخزن المؤقت PBS (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 2.7 m M KCl; 0.137 M NaCl), باستخدام عمود nap-5. إضافة 10 أضعاف الزائدة Cy5-maleimide أحادية التفاعلية صبغة في DMSO في الحل واحتضان في RT في الظلام لمدة 2 ساعة.
    2. تحميل محلول البروتين المسمى (500 ميكرولتر) المذكور أعلاه على عمود Nap-5 لإزالة الصبغة الزائدة. تأكد من أن البروتين elutes في الفرقة الملونة الأولى، تليها elute صبغة الحرة في الفرقة الثانية، على التوالي. جمع البروتين eluted في 1 مل من تام10 العازلة (20 mM تريس-HCl (pH 7.5), 10 mM ملغ (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 M M KCl, 0.5 mM EDTA, و 7 M BME (2-mercaptoethanol)).
  4. إعادة تشكيل الريبوسوم مع L27. اخلطي بروتين L27 المسمى مع كمية متساوية من الريبوسوم IW312 في مخزن TAM10 المؤقت واحتضنيه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إزالة البروتين الحر عن طريق وسادة السكروز الطرد الفائق (100،000 × ز، بين عشية وضحاها) للسماح للريبوسوم لتشكيل بيليه زرقاء اللون في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. تسميةTRNA Phe وفقا لتقرير نشر سابقا22. أولا، احتضان tRNA (10 A260 في 1 مل من الماء) مع 100 ميكرولتر من NaBH4 (100 متر مخزون، إضافة دروبوايز) في 0 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تحرير tRNAs من NaBH4 غير منقحة عن طريق هطول الأمطار الإيثانول ثلاث مرات بإضافة حجم 1/10 من 3 M KAc (pH 5.0) وحجم 2.5x من الإيثانول. احتضان انخفاض الحمض النووي الريبي مع 1 ميكرولتر من محلول صبغ Cy3-NHS (1 ملغ في 10 ميكرولتر من DMSO) في الحد الأدنى لحجم (~ 20 ميكرولتر) من 0.1 م الصوديوم formate (درجة الحموضة 3.7). بعد 2 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، افصل الحمض النووي الريبي عن الصبغة غير المتفاعلة عبر عمود G25 Sephadex صغير، ثم قم بإزالة الصبغة الحرة عن طريق هطول الأمطار للإيثانول مرتين.

2. إعداد المجمعات الريبوسومية

  1. التعبير عن وتنقية البروتينات له الموسومة من IF1، IF2، IF3، EF-G، EF-Tu، EF-TS، وsyntases TRNA باستخدام الأساليب القياسية15.
  2. إعداد مزيج بدء بإضافة المكونات التالية في المخزن المؤقت TAM10 في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة: 1 ميكرومتر من ريبوسوم المسمى; 1.5 ميكرومتر لكل من IF1 و IF2 و IF3؛ 2 ميكرومتر من الحمض النووي الريبي البيوتيني (ترميز MF لأول اثنين من الأحماض الأمينية)؛ 4 ميكرومتر من fMet-tRNAfMetالمشحونة؛ و 1 م م جيجابايت.
  3. إعداد مزيج EF-Tu_G عن طريق خلط المكونات التالية في المخزن المؤقت TAM10 في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة: 4 ميكرومتر EF-Tu، 0.4 ميكرومتر EF-Ts، 2 ميكرومتر EF-G، 4 MM GTP، 4 MM PEP، و 0.02 ملغم / مل من بيروفات كيناز.
  4. قم بإعداد مزيج TU_NOG EF مشابه للخطوة 2.3 بدون EF-G.
  5. إعداد مزيج Phe عن طريق خلط المكونات التالية في المياه الخالية من النيوكليز في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة: 100 متر ثلاثي (درجة الحموضة 7.5)، 20 mM MgAc2، 1 MM EDTA, 4 M ATP, 7 M M BME, 2 m M Phenylalanine محددة synthetase, 2 A260/mL من TRNAPheالمسمى , و 50 ميكرومتر فينيلالاناين.
  6. إعداد مجمع ما قبل النقل (PRE) عن طريق خلط بدء، EF-Tu_NoG، ويمزج Phe في نسبة 1:2:2، في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد الحضانة، تنقية PRE من قبل 1.1 M السكروز وسادة الطرد المركزي الفائق بين عشية وضحاها في 100،000 × ز.
  7. إعداد مجمع ما بعد النقل (POST) عن طريق خلط بدء، EF-Tu_WG، ويمزج Phe في نسبة 1:2:2، في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. بعد الحضانة، تنقية POST من قبل 1.1 M السكروز وسادة الطرد المركزي الفائق بين عشية وضحاها في 100،000 × ز.

3. إعداد الشرائح عينة

  1. تنظيف الشرائح الزجاجية المجهر (75 ملم × 25 ملم) التي تحتوي على ستة أزواج من الثقوب (1 ملم في القطر). كل زوج يشكل مدخل منفذ لغرفة العينة. تأكد من أن المسافة بين كل فتحة مدخل منفذ هي 13 ملم والمسافة من مركز إلى مركز بين قناتين هي 6 ملم. ضع ست شرائح في بوتقة زجاجية.
  2. ملء بوتقة مع الأسيتون وسونيكاتي لهم لمدة 5 دقائق. decant الأسيتون وشطف الشرائح ثلاث مرات مع المياه فائقة البور. ملء بوتقة مرة أخرى بالماء و 1 مل من 10 M KOH. سونيكاتي لمدة 20 دقيقة.
  3. شطف الشرائح ثلاث مرات مع المياه فائقة البور. ملء بوتقة مرة أخرى مع الإيثانول وسونيكاتي لمدة 5 دقائق. تماما decant المذيبات. دع الشرائح تجف في غطاء الدخان.
  4. تنظيف الزجاج مجهر يغطي الأغطية (# 1.5 سمك، 24 × 40 ملم). تنفيذ خطوات التنظيف كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.3.
  5. خبز الشرائح وتنظيفها وأغطية في 300 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. الاحتفاظ بها في الفرن بين عشية وضحاها لتبرد.
  6. معطف غطاء مع أمينوسيلين. في بوتقة تحتوي على coverlips، صب في مزيج الميثانول (100 مل من الميثانول، 5 مل من الماء، 0.5 مل من HAc، و 1 مل من أمينوسيلين). تدفئة بوتقة في حمام مائي لمدة 10 دقائق، سونيكاتي لمدة 10 دقيقة، ومن ثم تدفئة بوتقة في حمام الماء لمدة 10 دقائق أخرى. Decant خليط الميثانول، شطف الغطاء جيدا في ثلاث بوتقات من المياه النظيفة. تطهير الأسطح مع تيار النيتروجين الجاف من خلال إبرة.
  7. معطف coverlips مع البيوتين-PEG في غطاء نظيف صفح.
    1. لجعل الحل PEG، استخدم 98 ملغ من PEG و 2-3 ملغ من البيوتين-PEG في 200 ميكرولتر من محلول NaHCO3 100 mM.
    2. وضع واحد coverlip شقة على سطح. إسقاط بعناية 60 ميكرولتر من محلول PEG على الحافة العلوية. ثم، وضع coverslip آخر على أعلى من ذلك، والسماح للتأثير الشعرية نشر الحل بين اثنين من coverlips. تأكد من عدم تشكيل فقاعات.
    3. كرر الخطوة 3.7.2 لزوجين آخرين من الأغطية. معطف ست قطع من الأغطية مع البيوتين. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من coverlips ، وضبط كمية PEG وPE TO PEG Biotin وفقا لذلك لجعل المزيد من حل PEG.
    4. تخزين هذه الأغطية في مربع تلميح فارغة مليئة بالماء واحتضان لمدة 3 ساعة في الظلام.
    5. بعد 3 ساعات، فصل الأغطية، وشطف بالماء في ثلاث بوتقات متتالية وتطهير مع تيار النيتروجين الجاف. ضع الأغطية المغلفة على رف خزفي. وضع علامة على السطح مع طلاء.
  8. تجميع غرف العينة19.
    1. سحب نصائح حادة ماصة من خلال الثقوب على الشرائح الزجاجية حتى تناسب ضيق. كشط ينتهي حاد قبالة حتى انها مسطحة تماما على السطح الزجاجي. قطع الطرف الآخر من طرف ليكون ما يقرب من 5 ملم لتحميل العينة.
    2. قص شريط مزدوج الوجه مع نمط القناة على ذلك (25 × 40 ملم).
    3. ضع الشريط ذو الوجهين على الشرائح الزجاجية على الجانب المسطح.
    4. ضع غطاء الأغطية المغلف على الشريط ذو الوجهين. اضغط عليه لجعل ختم ضيق من غرفة العينة. تأكد من أن الجانب المغلف يواجه الداخل.

4. جزيء واحد FRET التصوير

  1. قم بتشغيل الكمبيوتر.
  2. قم بتشغيل مفتاح المجهر.
  3. بدء تشغيل واجهة التحكم بالليزر، وبدوره على الليزر. اضغط على زر التمكين الموجود في مربع التحكم بالليزر لتسخين الليزر.
  4. تشغيل الكاميرات.
  5. بدء تشغيل برنامج المقترنة بالمجهر. انقر فوق الغالق العلوي إيقاف وانقر فوق المصباح تشغيل.
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت _WT TAM10بإضافة 10 ميكرولتر من 5٪ Tween-20 إلى 1 مل من المخزن المؤقت TAM10.
  7. إعداد محلول deoxy عن طريق وزن 3 ملغ من الجلوكوز أوكسيداز في أنبوب صغير microcentrifuge. أضف 45 ميكرولتر من الكاتالاسي. دوامة بلطف لإذابة الصلبة. تدور في 20،000 × ز في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة. خذ الناسخ الخارق
  8. إعداد محلول الجلوكوز 30٪ في الماء و200 mM Trolox الحل في DMSO.
  9. إعداد 0.5 ملغ / مل من محلول ستريبتافيدين في المياه الخالية من النيوكليز.
  10. أضف قطرة واحدة من زيت التصوير إلى هدف TIRF.
  11. ضع حجرات العينة على الهدف.
  12. ملء الغرفة مع 10 ميكرولتر من الحل ستريبتافيدين. انتظر دقيقة واحدة.
  13. اغسل الغرفة ب 30 مل من TAM10_WT العازلة واجمع محلول التشغيل بورق فلتر مطوي. انتظر دقيقة واحدة.
  14. تمييع المجمعات الريبوسومية (PRE أو POST) إلى تركيز 10-50 nM مع TAM10_WT العازلة.
  15. تحميل 20 ميكرولتر من عينة ريبوسوم في القناة. انتظر لمدة دقيقتين.
  16. جعل العازلة التصوير (50 ميكرولتر من تام10 العازلة بالإضافة إلى 0.5 ميكرولتر لكل من محلول ديوكسي، الجلوكوز، وترولوكس). خلط المخزن المؤقت جيدا.
  17. قم بمسح الغرفة ب 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير.
  18. تعيين الكاميرا للحصول على 100 مللي ثانية / الإطار، 16 بت، 4 × 4 binning.
  19. انقر فوق الغالق العلوي تشغيل والمصباح إيقاف.
  20. بدء اقتناء الكاميرا. نشر الصور في ثلاث نوافذ تمثل اثنين من الكاميرات الفردية وتراكب.
  21. انقر على التركيز التلقائي. ضبط دقيق للعثور على أفضل التركيز.
  22. انقر على طريقة. تعيين نقاط الحقل وتخزين الملفات ورقم الحلقة.
  23. انقر على تشغيل.
    ملاحظة: يظهر إطار جديد مع التصوير في الوقت الحقيقي. يتم عرض تقدم سلسلة الوقت وحقل عرض السلسلة في أعلى الإطار.
  24. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة، أغلق النافذة المنبثقة.
  25. فتح الملف ND (ملف المكتسبة).
  26. انقر على ROI / محرر عائد الاستثمار البسيط. اختر الخيار دائرة.
  27. حدد عائد الاستثمار على الصورة. انقر على إنهاء عند اكتماله.
  28. انقر على القياس / قياس الوقت لإظهار البيانات إما كمؤامرة أو كجداول بيانات.
  29. افتح علامة التبويب تصدير. تعيين معلمات التصدير.
  30. انقر على تصدير لحفظ كثافة.

النتائج

وكان smFRET ريبوسوم المسمى في الموقف الأوسط من حركة المرور TRNA، لتمييز نقل TRNA من A- إلى P-الموقع (الشكل 1)15. المسافة من بقايا وضع العلامات L27 إلى TRNA A- أو P-الموقع هو 52 أو 61 ألف، على التوالي، المقابلة لكفاءة FRET من 0.47 و 0.65. بعد جمع الصور، تم استرجاع وشدات الفلورسينس من قنوا?...

Discussion

SmFRET حساسة للإشارات الخلفية. أولا، فمن الضروري لمعطف غرفة عينة مع توين 0.05٪ ومن ثم تضاف بالتزامن مع الحل ريبوسوم لمنع ملزمة غير محددة من ريبوسوم إلى السطح. لرؤية الفلورسينس من انبعاث مقبول Cy5 ، يعد كوكتيل زبال الأكسجين (محلول ديوكسي والجلوكوز وترولوكس) ضروريا. بدون هذا الحل، التبييض سريع جدا ...

Disclosures

ي. وانغ يعلن عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452) ومؤسسة ويلش (E-1721).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AminosilaneLaysanbioMPEG-SIL-5000
Biotin-PEGLaysanbioBiotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cellsNovagen71403
Catalasemillipore sigmaC3515
CS150FNX Micro Ultracentrifugenuaire
Cy3/C5-maleimideApexBioA8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscopeNikon
EdgeGARD Laminar Flow HoodBaker
Glucose oxidasemillipore sigmaG2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)Cytiva17524701
Microscope cover slipVWR48393-230
Microscope glass slidesVWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 cameraHamamatsu
PEG (5,000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmidNovagen69741
SonicatorVWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
Troloxmillipore sigma238813

References

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved