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要約

単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。

要約

リボソームは、mRNAテンプレートに沿ってタンパク質をプロセス的に組み立てる大きなリボヌクレオタンパク質複合体です。リボソームの直径は、A-、P-およびEサイトで大きなtRNA基質を収容するために約20 nmである。その結果、リボソームダイナミクスは自然に素早く脱相します。単一分子法は、各リボソームを個別に検出し、不均質な集団を区別することができ、これは多成分系の複雑なメカニズムを明らかにするために不可欠である。ニコンTi2逆顕微鏡を用いたsmFRET法の詳細を報告し、リボソームタンパク質L27とtRNAの間のリボソームダイナミクスをプローブする。L27は独特なCys 53の位置でラベル付けされ、L27を欠くように設計されるリボソームに再構成される。tRNAは、その肘領域で標識される。tRNAが経え前および後転座などの伸び周期の間にリボソーム内の異なる場所に移動するにつれて、FRETの効率とダイナミクスは違いを示し、複数の亜集団が示唆されている。これらのサブ集団はアンサンブル法では検出できません。TIRFベースのsmFRET顕微鏡は、手動または電動反転顕微鏡、自家製レーザー照明で構築されています。リボソームサンプルは超遠心分離によって精製され、自家製のマルチチャンネルサンプルセルにロードされ、エバネッセントレーザーフィールドを介して照明されます。反射レーザースポットは、完璧な焦点のフィードバック制御を達成するために使用することができます。蛍光信号は、電動フィルタタレットで分離され、2台のデジタルCMOSカメラによって収集されます。強度は、NIS要素ソフトウェアを介して取得されます。

概要

リボソームは、大きい(50S)および小さい(30S)サブユニットのø 20 nm大きいリボヌクレオ蛋白質複合体である。mRNAテンプレートに沿って長いペプチドをプロセス的かつ協調的に組み立てます。リボソーム30SはfMet-tRNAfMetとmRNAに結合してタンパク質合成を開始し、50Sは結合して70S開始複合体を形成する。tRNAは、A部位(アミノアシル-tRNA結合部位)でリボソームにアミノ酸をもたらし、一方、細長いペプチジル鎖がP部位(ペプチジル-tRNA結合部位)に保持されている。転座前複合体では、ペプチジル鎖は1つのアミノ酸を加えてA部位のtRNAに移される。一方、P部位tRNAは脱アシル化される。次いで、A-, P-tRNAはP-, E-部位に移動して転座後複合体を形成し、このEサイトがtRNA出口部位を表す。この状態では、ペプチジル-tRNAはPサイトに戻ります。伸長サイクルは、前立体と後方構造の間で継続し、リボソームはmRNA上に転位し、一度に1コドン1個である。リボソームは、このプロセスを効率的かつ正確にするために、異なる機能部位を高度に調整しており、サブユニット間ラチェット2、tRNAハイブリダイゼーション変動3、GTPase活性化4、L1茎開閉5など。その結果、すべての分子が独自のペースで移動するため、リボソームはすぐに脱相します。従来の方法では、見かけ上の平均パラメータしか推定できませんが、人口の少ない種または短命の種は平均効果6でマスクされます。単一分子法は、各リボソームを個別に検出することによってこの制限を破ることができ、その後、統計的再構成7を介して異なる種を同定する。tRNA-tRNA 8、EF-G-L119、L1-tRNA10、等の相互作用のようなリボソームダイナミクスをプローブするために、異なる標識部位が実装されている。また、大小のサブユニットにそれぞれラベルを付けて、サブユニット間ラチェット運動と因子との協調が観察される11,12。一方、smFRET法は他の中心的な生物学的プロセスにおいて幅広い応用を有し、多色FRET法が13に出現している。

以前は新しいリボソームFRETペアが14,15で開発されました。組換えリボソームタンパク質L27は発現され、精製され、標識され、リボソームに戻って組み込まれている。このタンパク質は、近距離でtRNAと相互作用し、転座後複合体におけるP部位tRNAの安定化に役立った。tRNAがA-からPサイトに移動すると、このタンパク質とtRNAとの距離が短くなり、smFRETシグナルによって区別することができます。複数のリボソーム亜集団は、統計的方法および突然変異誘発を用いて同定されており、転座前の複合体におけるこれらの集団の自発的な交換は、リボソームがmRNA上で移動する前により柔軟であり、復号時にはより剛性であることを示唆している。これらのバリエーションは、リボソーム機能に不可欠です。ここで、プロトコルは、リボソーム/tRNA標識の詳細、リボソームにおけるそれらの組み込み、smFRETサンプル調製、およびデータ取得/分析19を記述する。

プロトコル

1. FRET検出用の標識リボソームおよびtRNAの調製

  1. L27を使用せずにリボソームを大腸菌株IW312から分離し、標準プロトコル20,21に従う。大腸菌株MRE600から規則的なリボソームを抽出します。
  2. L27のrpmA遺伝子をC末端HisタグでpET-21b(+)プラスミドにクローン化し、BL21(DE3)pLysS細胞15で形質転換して発現させる。プリップされたセファローズカラムを介してタンパク質を精製します。
  3. L27のラベル付け
    1. 20~100 μMの精製L27を100 μLでインキュベートし、2-10倍のTCEP(トリス-2-カルボクセチルホスフィン)を室温(RT)で30分間培養します。バッファーは、NAP-5 カラムを使用して、溶液をPBSバッファー(10 mM Na2HPO 4、1.8 mM KH2PO4、2.7mM KCl;0.137 M NaCl)に交換します。溶液にDMSOに10倍の過剰なCy5-maleimide単反応性染料を加え、暗闇の中でRTで2時間インキュベートする。
    2. 上記の標識タンパク質溶液(500 μL)をNap-5カラムにロードして、過剰な染料を除去します。タンパク質が第1色帯に溶出し、その後に第2バンドにフリー色素がそれぞれ溶出することを確認する。溶出したタンパク質をTAM10バッファー(20 mM tris-HCl(pH 7.5)、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、0.5 mM EDTA、および7 mM BME(2-メルカプトエタノール)で収集します。
  4. L27でリボソームを再構成する。標識されたL27タンパク質を同量のIW312リボソームをTAM10 バッファーに混合し、37°Cで1時間インキュベートします。スクロースクッション超遠心分離(100,000 x g、一晩)により遊離タンパク質を除去し、チューブ下部に青色のペレットを形成させるためリボソームを使用します。
  5. 前に公表されたレポート22に従ってtRNAPheにラベルを付ける。まず、100 μLのNaBH 4(100mMストック、ドロップワイズを加える)を1時間0°CでtRNA(10A260水1mL)でインキュベートします。3 M KAc(pH 5.0)と2.5倍の量のエタノールを加えて、3回のエタノール沈殿を介して未反応NaBH4からtRNAを解放する。0.1 Mナトリウムの定液(pH 3.7)の最小容積(約20 μL)のCy3-NHS色素溶液(DMSOの10 μLの1mg)の1 μLで減少したtRNAをインキュベートします。37°Cで2時間のインキュベーションを行った後、小さなG25セファデックスカラムを介して未反応の染料からtRNAを分離し、2回のエタノール沈殿を介してフリー染料を除去する。

2. リボソーム複合体の調製

  1. IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts、およびtRNA合成酵素のHisタグ付きタンパク質を、標準的な方法15を用いて発現および精製する。
  2. 37 °CのTAM10 バッファーに次の成分を15分間添加して開始ミックスを準備します: 1 μMのラベリングリボソーム。IF1、IF2、および IF3 の各 1.5 μM;2 μM ビオチン化 mRNA (最初の 2 つのアミノ酸の MF をコーディング);4 μMのチャージド fMet-tRNAfMet;1 mM GTP.
  3. 37 °CのTAM10 バッファーに次の成分を15分間混合して、EF-Tu_Gミックスを調製します:4 μM EF-Tu、0.4 μM EF-Ts、2 μM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP、ピルビン酸キナーゼの0.02 mg/mL。
  4. EF-G を使用せずに、手順 2.3 と同様の EF Tu_NoG ミックスを準備します。
  5. ヌクレアーゼフリー水に次の成分を15分間混合してPheミックスを準備します:100 mMトリス(pH 7.5)、20 mM MgAc2、 1 mM EDTA、 4 mM ATP、 7 mM BME、2 mM フェニルアラニン特異的合成酵素、標識 tRNAPheの 2 A260/mL、および 50 μM フェニルアラニン。
  6. 開始、EF-Tu_NoG、およびPheを1:2:2の比で混合し、37°Cで2分間、トランスロケーション前複合体(PRE)を調製します。インキュベーション後、PREを1.1 Mのスクロースクッション超遠心分離で100,000xgで一晩浄化する。
  7. 開始、EF-Tu_WG、およびPheを1:2:2の比で混合し、37°Cで10分間、転位後複合体(POST)を調製します。インキュベーション後、100,000 x gで一晩で1.1 Mスクロースクッション超遠心化によってPOSTを浄化する。

3. サンプルスライドの準備

  1. 6つの穴(直径1mm)を含む顕微鏡ガラススライド(75 mm x 25 mm)をクリーニングします。各ペアは、サンプルチャンバーの入口出口を形成する。各流入口の穴間の距離が13mm、2つのチャンネル間の中心から中心までの距離が6mmであることを確認します。ガラスのるつぼに6枚のスライドを置きます。
  2. つぼにアセトンを入れ、5分間超音波処理します。アセトンをデカントし、超純水でスライドを3回すすいでください。水と10 M KOHの1 mLで再びるつぼを満たします。20分間のソニッケート。
  3. 超純水でスライドを3回すすいでください。5分間エタノールと超音波で再びるつぼを充填します。溶媒を完全にデカントします。スライドをフュームフードで乾かします。
  4. 顕微鏡ガラスカバーリップ(#1.5厚さ、24 x 40 mm)をきれいにしてください。手順 3.1 ~ 3.3 の手順に従って、クリーニング手順を実行します。
  5. クリーニングしたスライドとカバーリップを300°Cで3時間焼きます。冷却するために一晩炉に保管してください。
  6. カバースリップにアミノシランを塗ります。カバースリップを含むるつぼに、メタノールミックス(メタノール100mL、5mLの水、0.5mLのHAc、および1mLのアミノシラン)を注ぎます。水浴で10分間るつぼを温め、10分間超音波処理し、水浴でつぼを10分間温めます。メタノール混合物をデカントし、きれいな水の3つのるつぼでカバースリップをよく洗い流す。針を通して乾燥した窒素の流れで表面をパージします。
  7. ラミナークリーンフードにビオチンPEGでカバーリップをコーティングします。
    1. PEG溶液を作るために、100 mM NaHCO3 溶液の200 μLのPEGおよび2-3mgのビオチン-PEGの98 mgを使用して下さる。
    2. 1つのカバースリップを表面に平らに置きます。上端に60 μLのPEG溶液を慎重に落とします。その上に別のカバースリップを置き、毛細管効果が2つのカバーリップの間に溶液を広げさせます。気泡が形成されていないことを確認します。
    3. さらに 2 組のカバーリップについて、ステップ 3.7.2 を繰り返します。6枚のカバースリップにビオチンを塗ります。より多くのカバーリップが必要な場合は、PEGとビオチンPEGの量を調整して、より多くのPEGソリューションを作ります。
    4. これらのカバーリップを水で満たされた空のチップボックスに保管し、暗闇の中で3時間インキュベートします。
    5. 3時間後、カバーリップを分離し、3つの連続したるつぼに水ですすいで乾燥窒素流でパージします。コーティングされたカバーリップをセラミックラックに置きます。表面にコーティングを付けます。
  8. サンプルチャンバー19を組み立てる。
    1. ガラススライドの穴から鋭いピペットの先端を引っ張り、しっかりとフィットします。ガラス表面に完全に平らになるまで、鋭利な端を削ります。サンプルローディングの場合は、チップのもう一方の端を約5mmに切ります。
    2. チャネルパターンを持つ両面テープを切ります(25 x 40 mm)。
    3. 両面テープを平らな側のガラススライドに貼り付けます。
    4. 両面テープにコーティングされたカバースリップを貼り付けます。それを押して、サンプルチャンバーの密閉を行います。コーティングされた側面が内側に向かっていることを確認します。

4. 単一分子FRETイメージング

  1. コンピュータの電源を入れます。
  2. 顕微鏡スイッチをオンにします。
  3. レーザー制御インターフェースを起動し、レーザーをオンにします。レーザーコントロールボックスのイネーブルボタンを押して、レーザーを温める。
  4. カメラの電源を入れます。
  5. 顕微鏡関連のソフトウェア プログラムを起動します。上のシャッターをクリックして、ランプをクリックします。
  6. TAM 10 _WTバッファーの10μL の 5% Tween-20 を 1 mL の TAM10 バッファーに追加して準備します。
  7. 小さいマイクロ遠心分離管のブドウ糖オキシダーゼの3mgを秤量することによってデオキシ溶液を準備する。45 μLのカタラーゼを加えます。固体を溶解するために穏やかに渦。マイクロ遠心分離機で20,000 x g で1分間スピンします。上清を取る。
  8. 30%のグルコース溶液を水に、200 mMトロノックス溶液をDMSOで調製します。
  9. ヌクレアーゼを含まない水で0.5mg/mLのストレプトアビジン溶液を調製します。
  10. TIRFの目的に1滴のイメージングオイルを加えます。
  11. 目的にサンプルチャンバーを置きます。
  12. チャンバーに10 μLのストレプトアビジン溶液を充填します。1分待ちます。
  13. 30 mLのTAM10_WTバッファーでチャンバーを洗い、折り畳まれたフィルターペーパーでランスルー溶液を回収します。1分待ちます。
  14. リボソーム複合体(PREまたはPOST)を、TAM 10_WTバッファーで10〜50nM濃度に希釈します。
  15. リボソームサンプルの20 μLをチャネルにロードします。2分待ちます。
  16. イメージングバッファ(50 μLのTAM10 バッファにデオキシ、グルコース、トロロックスの各ソリューション0.5 μLを加えたもの)を作ります。バッファーをよく混ぜます。
  17. 30 μLのイメージングバッファでチャンバを洗い流します。
  18. カメラを100ミリ/フレーム、16ビット、4 x 4ビニングを取得するように設定します。
  19. 上のシャッター をクリック し、ランプを 消します。
  20. カメラの取得を開始します。2 つの個別のカメラとオーバーレイを表す 3 つのウィンドウに画像を広げます。
  21. [オートフォーカス] をクリックします。最適なフォーカスを見つけるために微調整します。
  22. メソッドをクリックします。フィールド ポイント、ファイル ストレージ、およびループ番号を設定します。
  23. [ 実行] をクリックします。
    メモ:リアルタイムイメージングを使用して新しいウィンドウが表示されます。時系列の進捗状況と視野シリーズは、ウィンドウの上部に表示されます。
  24. 画像の取得が完了したら、ポップアップ ウィンドウを閉じます。
  25. NDファイル(取得したファイル)を開きます。
  26. ROI/シンプルなROIエディタをクリックします。オプションの[円]を選択します。
  27. イメージの ROI を選択します。完了したら [完了]をクリックします 。
  28. [計測/時間測定]をクリックして、データをプロットまたはスプレッドシートとして表示します。
  29. [エクスポート] タブを開きます。エクスポート パラメータを設定します。
  30. [エクスポート]をクリックして強度を保存します。

結果

smFRETは、tRNAトラフィックの中間位置にリボソーム標識を付け、TRNA転座をA-サイトからPサイト(図1)15に区別する。L27標識残渣からA-またはPサイトtRNAまでの距離は、それぞれ52Åまたは61Åであり、0.47および0.65のFRET効率に対応する。画像収集後、ドナーおよびアクセクサチャネルから蛍光強度を取得し、タイムラプスとしてプロットした(?...

ディスカッション

SmFRET はバックグラウンド信号に敏感です。まず、サンプルチャンバを0.05%トゥイーンでコーティングし、リボソーム溶液と同時に添加して、表面へのリボソームの非特異的結合をブロックする必要があります。アクセプターCy5発光からの蛍光を見るためには、酸素スカベンジャーカクテル(デオキシ、グルコース、トロロークス溶液)が不可欠です。この解決策がなければ、アクセクサチャネ?...

開示事項

Y.王は利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(R01GM111452)とウェルチ財団(E-1721)によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AminosilaneLaysanbioMPEG-SIL-5000
Biotin-PEGLaysanbioBiotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cellsNovagen71403
Catalasemillipore sigmaC3515
CS150FNX Micro Ultracentrifugenuaire
Cy3/C5-maleimideApexBioA8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscopeNikon
EdgeGARD Laminar Flow HoodBaker
Glucose oxidasemillipore sigmaG2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)Cytiva17524701
Microscope cover slipVWR48393-230
Microscope glass slidesVWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 cameraHamamatsu
PEG (5,000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmidNovagen69741
SonicatorVWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
Troloxmillipore sigma238813

参考文献

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