リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

要約

単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。

要約

リボソームは、mRNAテンプレートに沿ってタンパク質をプロセス的に組み立てる大きなリボヌクレオタンパク質複合体です。リボソームの直径は、A-、P-およびEサイトで大きなtRNA基質を収容するために約20 nmである。その結果、リボソームダイナミクスは自然に素早く脱相します。単一分子法は、各リボソームを個別に検出し、不均質な集団を区別することができ、これは多成分系の複雑なメカニズムを明らかにするために不可欠である。ニコンTi2逆顕微鏡を用いたsmFRET法の詳細を報告し、リボソームタンパク質L27とtRNAの間のリボソームダイナミクスをプローブする。L27は独特なCys 53の位置でラベル付けされ、L27を欠くように設計されるリボソームに再構成される。tRNAは、その肘領域で標識される。tRNAが経え前および後転座などの伸び周期の間にリボソーム内の異なる場所に移動するにつれて、FRETの効率とダイナミクスは違いを示し、複数の亜集団が示唆されている。これらのサブ集団はアンサンブル法では検出できません。TIRFベースのsmFRET顕微鏡は、手動または電動反転顕微鏡、自家製レーザー照明で構築されています。リボソームサンプルは超遠心分離によって精製され、自家製のマルチチャンネルサンプルセルにロードされ、エバネッセントレーザーフィールドを介して照明されます。反射レーザースポットは、完璧な焦点のフィードバック制御を達成するために使用することができます。蛍光信号は、電動フィルタタレットで分離され、2台のデジタルCMOSカメラによって収集されます。強度は、NIS要素ソフトウェアを介して取得されます。

概要

リボソームは、大きい(50S)および小さい(30S)サブユニットのø 20 nm大きいリボヌクレオ蛋白質複合体である。mRNAテンプレートに沿って長いペプチドをプロセス的かつ協調的に組み立てます。リボソーム30SはfMet-tRNA^fMetとmRNAに結合してタンパク質合成を開始し、50Sは結合して70S開始複合体を形成する。tRNAは、A部位(アミノアシル-tRNA結合部位)でリボソームにアミノ酸をもたらし、一方、細長いペプチジル鎖がP部位(ペプチジル-tRNA結合部位)に保持されている。転座前複合体では、ペプチジル鎖は1つのアミノ酸を加えてA部位のtRNAに移される。一方、P部位tRNAは脱アシル化される。次いで、A-, P-tRNAはP-, E-部位に移動して転座後複合体を形成し、このEサイトがtRNA出口部位を表す。この状態では、ペプチジル-tRNAはPサイトに戻ります。伸長サイクルは、前立体と後方構造の間で継続し、リボソームはmRNA上に転位し^、一度に1コドン1個である。リボソームは、このプロセスを効率的かつ正確にするために、異なる機能部位を高度に調整しており、サブユニット間ラチェット^2、tRNAハイブリダイゼーション変動3、GTPase活性化^4、L1茎開閉⁵など。

プロトコル

1. FRET検出用の標識リボソームおよびtRNAの調製

1. L27を使用せずにリボソームを大腸菌株IW312から分離し、標準プロトコル^20,21に従う。大腸菌株MRE600から規則的なリボソームを抽出します。
2. L27のrpmA遺伝子をC末端HisタグでpET-21b(+)プラスミドにクローン化し、BL21(DE3)pLysS細胞¹⁵で形質転換して発現させる。プリップされたセファローズカラムを介してタンパク質を精製します。
3. L27のラベル付け
   1. 20~100 μMの精製L27を100 μLでインキュベートし、2-10倍のTCEP(トリス-2-カルボクセチルホスフィン)を室温(RT)で30分間培養します。バッファーは、NAP-5 カラムを使用して、溶液をPBSバッファー(10 mM Na₂HPO 4、1.8 mM KH₂PO_4、2.7mM KCl;0.137 M NaCl)に交換します。溶液にDMSOに10倍の過剰なCy5-maleimide単反応性染料を加え、暗闇の中でRTで2時間インキュベートする。
   2. 上記の標識タンパク質溶液(500 μL)をNap-5カ....

結果

smFRETは、tRNAトラフィックの中間位置にリボソーム標識を付け、TRNA転座をA-サイトからPサイト(図1)15に区別する。L27標識残渣からA-またはPサイトtRNAまでの距離は、それぞれ52Åまたは61Åであり、0.47および0.65のFRET効率に対応する。画像収集後、ドナーおよびアクセクサチャネルから蛍光強度を取得し、タイムラプスとしてプロットした(?.......

ディスカッション

SmFRET はバックグラウンド信号に敏感です。まず、サンプルチャンバを0.05%トゥイーンでコーティングし、リボソーム溶液と同時に添加して、表面へのリボソームの非特異的結合をブロックする必要があります。アクセプターCy5発光からの蛍光を見るためには、酸素スカベンジャーカクテル(デオキシ、グルコース、トロロークス溶液)が不可欠です。この解決策がなければ、アクセクサチャネ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminosilane	Laysanbio	MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG	Laysanbio	Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells	Novagen	71403
Catalase	millipore sigma	C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge	nuaire
Cy3/C5-maleimide	ApexBio	A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope	Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood	Baker
Glucose oxidase	millipore sigma	G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)	Cytiva	17524701
Microscope cover slip	VWR	48393-230
Microscope glass slides	VWR	470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera	Hamamatsu
PEG (5,000)	Laysanbio	MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid	Novagen	69741
Sonicator	VWR	CPX-952-518R
TCEP	Apexbio	B6055
Trolox	millipore sigma	238813