Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

Riepilogo

Il trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola è un metodo che traccia la dinamica del tRNA durante la sintesi proteica ribosomiale. Tracciando i singoli ribosomi, vengono identificate popolazioni disomogenee, che fanno luce sui meccanismi. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti conformazionali biologici in generale per rivelare relazioni dinamico-funzionali in molti altri biosistemi complessi. I metodi a singola molecola possono osservare passaggi non limitanti la velocità e intermedi chiave poco popolati, che non sono accessibili con i metodi convenzionali di ensemble a causa dell'effetto medio.

Abstract

Il ribosoma è un grande complesso ribonucleoproteico che assembla le proteine in modo processivo lungo i modelli di mRNA. Il diametro del ribosoma è di circa 20 nm per ospitare grandi substrati di tRNA nei siti A-, P- ed E. Di conseguenza, la dinamica dei ribosomi viene naturalmente de-sfasata rapidamente. Il metodo a singola molecola può rilevare ogni ribosoma separatamente e distinguere popolazioni disomogenee, il che è essenziale per rivelare i complicati meccanismi dei sistemi multicomponenti. Riportiamo i dettagli di un metodo smFRET basato sul microscopio invertito Nikon Ti2 per sondare la dinamica dei ribosomi tra la proteina ribosomiale L27 e i tRNA. L'L27 è etichettato nella sua posizione unica Cys 53 e ricostituito in un ribosoma progettato per mancare di L27. Il tRNA è etichettato nella sua regione del gomito. Mentre il tRNA si sposta in diverse posizioni all'interno del ribosoma durante il ciclo di allungamento, come la pre e post traslocazione, le efficienze e le dinamiche FRET mostrano differenze, che hanno suggerito più sottopopolazioni. Queste sottopopolazioni non sono rilevabili con metodi di insieme. Il microscopio smFRET basato su TIRF è costruito su un microscopio invertito manuale o motorizzato, con illuminazione laser costruita in casa. I campioni di ribosomi vengono purificati mediante ultracentrifugazione, caricati in una cella campione multicanale costruita in casa e quindi illuminati tramite un campo laser evanescente. Lo spot laser a riflessione può essere utilizzato per ottenere il controllo del feedback della messa a fuoco perfetta. I segnali di fluorescenza sono separati da una torretta-filtro motorizzata e raccolti da due telecamere CMOS digitali. Le intensità vengono recuperate tramite il software NIS-Elements.

Introduzione

Il ribosoma è un complesso ribonucleoproteico grande ø 20 nm di una grande (50S) e una piccola (30S) subunità. Assembla peptidi lunghi lungo il modello di mRNA in modo processivo e cooperativo. Il ribosoma 30S si lega al fMet-tRNA^fMet e all'mRNA per avviare la sintesi proteica, e il 50S si unisce quindi per formare il complesso di iniziazione degli anni '70. I tRNA portano gli amminoacidi al ribosoma nel sito A (sito di legame aminoacil-tRNA), mentre la catena peptidil allungata è tenuta nel sito P (sito di legame peptidil-tRNA). Nel complesso di pre-traslocazione, la catena peptidil viene trasferita al tRNA nel sito A con l'aggiunta di un amminoacido. Nel ....

Protocollo

1. Preparazione di ribosomi e tRNA etichettati per il rilevamento di FRET

1. Isolare il ribosoma senza L27 dal ceppo di E. coli IW312 secondo i protocolli standard^20,21. Estrarre il ribosoma regolare dal ceppo di E. coli MRE600.
2. Clonare il gene rpmA di L27 con C-terminal His-tag in plasmide pET-21b (+), che viene trasformato ed espresso in cellule BL21(DE3)pLysS¹⁵. Purificare la proteina tramite una colonna di sefarosio preconfezionata.
3. Etichettatura di L27
   1. Incubare 20-100 μM di L27 purificato in 100 μL con 2-10 volte l'eccesso di TCE....

Risultati

Lo smFRET aveva il ribosoma etichettato nella posizione centrale del traffico di tRNA, per distinguere la traslocazione del tRNA dal sito A- al sito P (Figura 1)¹⁵. La distanza dal residuo di etichettatura L27 al tRNA del sito A o P è rispettivamente di 52 o 61 Å, corrispondente all'efficienza FRET di 0,47 e 0,65. Dopo la raccolta delle immagini, le intensità di fluorescenza dai canali donatore e accettore sono state recuperate e tracciate come time lapse (

Discussione

SmFRET è sensibile ai segnali di fondo. In primo luogo, è necessario rivestire la camera del campione con un'interpolazione dello 0,05% e quindi essere aggiunta contemporaneamente alla soluzione di ribosoma per bloccare il legame non specifico del ribosoma alla superficie. Per vedere la fluorescenza dall'emissione dell'accettore Cy5, il cocktail di scavenger di ossigeno (soluzioni deossidiche, glucosio e Trolox) è essenziale. Senza questa soluzione, lo sbiancamento è troppo veloce nel canale accettore per ottenere in.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminosilane	Laysanbio	MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG	Laysanbio	Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells	Novagen	71403
Catalase	millipore sigma	C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge	nuaire
Cy3/C5-maleimide	ApexBio	A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope	Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood	Baker
Glucose oxidase	millipore sigma	G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)	Cytiva	17524701
Microscope cover slip	VWR	48393-230
Microscope glass slides	VWR	470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera	Hamamatsu
PEG (5,000)	Laysanbio	MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid	Novagen	69741
Sonicator	VWR	CPX-952-518R
TCEP	Apexbio	B6055
Trolox	millipore sigma	238813