Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

Yuhong Wang

doi:10.3791/62664

Summary

Il trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola è un metodo che traccia la dinamica del tRNA durante la sintesi proteica ribosomiale. Tracciando i singoli ribosomi, vengono identificate popolazioni disomogenee, che fanno luce sui meccanismi. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti conformazionali biologici in generale per rivelare relazioni dinamico-funzionali in molti altri biosistemi complessi. I metodi a singola molecola possono osservare passaggi non limitanti la velocità e intermedi chiave poco popolati, che non sono accessibili con i metodi convenzionali di ensemble a causa dell'effetto medio.

Abstract

Il ribosoma è un grande complesso ribonucleoproteico che assembla le proteine in modo processivo lungo i modelli di mRNA. Il diametro del ribosoma è di circa 20 nm per ospitare grandi substrati di tRNA nei siti A-, P- ed E. Di conseguenza, la dinamica dei ribosomi viene naturalmente de-sfasata rapidamente. Il metodo a singola molecola può rilevare ogni ribosoma separatamente e distinguere popolazioni disomogenee, il che è essenziale per rivelare i complicati meccanismi dei sistemi multicomponenti. Riportiamo i dettagli di un metodo smFRET basato sul microscopio invertito Nikon Ti2 per sondare la dinamica dei ribosomi tra la proteina ribosomiale L27 e i tRNA. L'L27 è etichettato nella sua posizione unica Cys 53 e ricostituito in un ribosoma progettato per mancare di L27. Il tRNA è etichettato nella sua regione del gomito. Mentre il tRNA si sposta in diverse posizioni all'interno del ribosoma durante il ciclo di allungamento, come la pre e post traslocazione, le efficienze e le dinamiche FRET mostrano differenze, che hanno suggerito più sottopopolazioni. Queste sottopopolazioni non sono rilevabili con metodi di insieme. Il microscopio smFRET basato su TIRF è costruito su un microscopio invertito manuale o motorizzato, con illuminazione laser costruita in casa. I campioni di ribosomi vengono purificati mediante ultracentrifugazione, caricati in una cella campione multicanale costruita in casa e quindi illuminati tramite un campo laser evanescente. Lo spot laser a riflessione può essere utilizzato per ottenere il controllo del feedback della messa a fuoco perfetta. I segnali di fluorescenza sono separati da una torretta-filtro motorizzata e raccolti da due telecamere CMOS digitali. Le intensità vengono recuperate tramite il software NIS-Elements.

Introduction

Il ribosoma è un complesso ribonucleoproteico grande ø 20 nm di una grande (50S) e una piccola (30S) subunità. Assembla peptidi lunghi lungo il modello di mRNA in modo processivo e cooperativo. Il ribosoma 30S si lega al fMet-tRNA^fMet e all'mRNA per avviare la sintesi proteica, e il 50S si unisce quindi per formare il complesso di iniziazione degli anni '70. I tRNA portano gli amminoacidi al ribosoma nel sito A (sito di legame aminoacil-tRNA), mentre la catena peptidil allungata è tenuta nel sito P (sito di legame peptidil-tRNA). Nel complesso di pre-traslocazione, la catena peptidil viene trasferita al tRNA nel sito A con l'aggiunta di un amminoacido. Nel ....