Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Resumen

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar pasos no limitantes de velocidad e intermedios clave poco poblados, a los que no son accesibles los métodos de conjunto convencionales debido al efecto promedio.

Resumen

El ribosoma es un gran complejo de ribonucleoproteínas que ensambla proteínas procesivamente a lo largo de plantillas de ARNm. El diámetro del ribosoma es de aproximadamente 20 nm para acomodar grandes sustratos de ARNt en los sitios A, P y E. En consecuencia, la dinámica del ribosoma se desesfálice naturalmente rápidamente. El método de molécula única puede detectar cada ribosoma por separado y distinguir poblaciones no homogéneas, lo cual es esencial para revelar los complicados mecanismos de los sistemas de múltiples componentes. Informamos los detalles de un método smFRET basado en el microscopio invertido Nikon Ti2 para sondear la dinámica de los ribosomas entre la proteína ribosómica L27 y los ARNt. El L27 está etiquetado en su posición única Cys 53 y reconstituido en un ribosoma que está diseñado para carecer de L27. El ARNt está etiquetado en la región del codo. A medida que el ARNt se mueve a diferentes ubicaciones dentro del ribosoma durante el ciclo de elongación, como la pre y post-translocación, las eficiencias y dinámicas de FRET exhiben diferencias, lo que ha sugerido múltiples subpoblaciones. Estas subpoblaciones no son detectables por métodos de conjunto. El microscopio smFRET basado en TIRF está construido sobre un microscopio invertido manual o motorizado, con iluminación láser casera. Las muestras de ribosomas se purifican mediante ultracentrifugación, se cargan en una célula de muestra multicanal construida en casa y luego se iluminan a través de un campo láser evanescente. El punto láser de reflexión se puede utilizar para lograr el control de retroalimentación del enfoque perfecto. Las señales de fluorescencia están separadas por una torreta de filtro motorizada y recogidas por dos cámaras CMOS digitales. Las intensidades se recuperan a través del software NIS-Elements.

Introducción

El ribosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande de ø 20 nm de una subunidad grande (50S) y una pequeña (30S). Ensambla péptidos largos a lo largo de la plantilla de ARNm de manera procesiva y cooperativa. El ribosoma 30S se une al fMet-tRNA^fMet y al ARNm para iniciar la síntesis de proteínas, y el 50S luego se une para formar el complejo de iniciación 70S. Los ARNt llevan aminoácidos al ribosoma en el sitio A (sitio de unión aminoacil-ARNt), mientras que la cadena peptidilada alargada se mantiene en el sitio P (sitio de unión peptidil-ARNt). En el complejo de pre-translocación, la cadena de peptidil se transfiere al ARNt en el sitio A con un aminoácido añadido. Mientras tanto, el ARNt del sitio P está desacilado. Luego, los ARNt A-, P- se mueven a los sitios P-, E- para formar el complejo post-translocación, en el que el sitio E representa el sitio de salida del ARNt. En este estado, el PEPTIDIL-ARNt se mueve de vuelta al sitio P. El ciclo de elongación continúa entre las pre y postconformaciones mientras que el ribosoma se transloca en el ARNm, un codón a la vez¹. El ribosoma es altamente coordinativo de diferentes sitios funcionales para hacer que este proceso sea eficiente y preciso, como el trinquete intersubunidad^2,las fluctuaciones de hibridación de ARNt^3,las activaciones de GTPasa^4,la apertura-cierre del tallo L1^5,etc. En consecuencia, los ribosomas se desespaspas rápidamente porque cada molécula se mueve a su propio ritmo. Los métodos convencionales solo pueden deducir parámetros medios aparentes, pero las especies poco pobladas o de corta duración se enmascararán en el efecto medio⁶. El método de molécula única puede romper esta limitación detectando cada ribosoma individualmente, luego identificar diferentes especies a través de la reconstrucción estadística⁷. Se han implementado diferentes sitios de etiquetado para sondear la dinámica de los ribosomas, como las interacciones entre tRNA-ARNt^8,EF-G-L11^9,L1-ARNt^10,etc. Además, al etiquetar las subunidades grandes y pequeñas, respectivamente, se observa la cinética de trinquete entre subunidades y la coordinación con los factores^11,12. Mientras tanto, el método smFRET tiene amplias aplicaciones en otros procesos biológicos centrales, y están surgiendo métodos FRET multicolor¹³.

Anteriormente se desarrolló un nuevo par de RIBOSOMAS FRET^14,15. La proteína ribosómica recombinante L27 ha sido expresada, purificada y etiquetada, e incorporada de nuevo al ribosoma. Esta proteína interactuó con los ARNt a corta distancia y ayudó a estabilizar el ARNt del sitio P en el complejo post-translocación. Cuando el ARNt se mueve del sitio A- al P, la distancia entre esta proteína y el ARNt se acorta, lo que puede distinguirse por la señal smFRET. Se han identificado múltiples subpoblaciones de ribosomas utilizando métodos estadísticos y mutagénesis, y el intercambio espontáneo de estas poblaciones en el complejo pre- pero no post- translocación sugiere que el ribosoma es más flexible antes de moverse sobre el ARNm, y más rígido durante la decodificación^16,17,18. Estas variaciones son esenciales para la función del ribosoma. Aquí, el protocolo describe los detalles del etiquetado ribosómico/ARNt, su incorporación en el ribosoma, la preparación de muestras smFRET y la adquisición/análisis de datos¹⁹.

Protocolo

1. Preparación de ribosoma y ARNt etiquetados para la detección de FRET

1. Aislar ribosoma sin L27 de la cepa de E. coli IW312 según protocolos estándar^20,21. Extraiga el ribosoma regular de la cepa MRE600 de E. coli.
2. Clonar el gen rpmA de L27 con C-terminal His-tag en plásmido pET-21b (+), que se transforma y se expresa en células BL21(DE3)pLysS¹⁵. Purificar la proteína a través de una columna de sefalrosa preenvasada.
3. Etiquetado de L27
   1. Incubar 20-100 μM de L27 purificado en 100 μL con un exceso de 2-10 veces de TCEP (Tris-2-carboxietil-fosfina) a temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Intercambio de búfer de la solución en búfer PBS₍₁₀mM Na 2 HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), utilizando una columna nap-5. Agregue 10 veces el exceso de colorante monoreactivo Cy5-maleimida en DMSO en la solución e incube a RT en la oscuridad durante 2 h.
   2. Cargue la solución de proteína etiquetada (500 μL) mencionada anteriormente en una columna Nap-5 para eliminar el exceso de colorante. Asegúrese de que la proteína elute en la primera banda de color, seguida por el colorante libre elute en la segunda banda, respectivamente. Recoger la proteína eluida en 1 mL de tampón TAM₁₀ (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)₂, 30 mM NH₄Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA y 7 mM BME (2-mercaptoetanol)).
4. Reconstituir el ribosoma con L27. Mezclar la proteína L27 etiquetada con una cantidad igual de ribosoma IW312 en tampón TAM₁₀ e incubar a 37 °C durante 1 h. Retire la proteína libre mediante ultracentrifugación de cojín de sacarosa (100.000 x g,durante la noche) para permitir que el ribosoma forme una bolita de color azul en la parte inferior del tubo.
5. Etiquetar el ARNt^Phe según el informe publicado anteriormente²². Primero, incubar el ARNt (10 A₂₆₀ en 1 mL de agua) con 100 μL de NaBH₄ (100 mM de stock, añadiendo gota a gota) a 0 °C durante 1 h. Libere los ARNs de NaBH₄ no reaccionado a través de la precipitación de etanol tres veces agregando 1/10 de volumen de 3 M KAc (pH 5.0) y 2.5x volumen de etanol. Incubar el ARNt reducido con 1 μL de solución de colorante Cy3-NHS (1 mg en 10 μL de DMSO) en un volumen mínimo (~20 μL) de formiato de sodio 0,1 M (pH 3,7). Después de 2 h de incubación a 37 °C, separe el ARNt del colorante no reaccionado a través de una pequeña columna de Sephadex G25 y luego retire el colorante libre mediante precipitación de etanol dos veces.

2. Preparación de los complejos de ribosomas

1. Expresar y purificar las proteínas marcadas con His de IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts y SINTETASAS de ARNt utilizando métodos estándar¹⁵.
2. Preparar la mezcla de iniciación añadiendo los siguientes ingredientes en tampón TAM₁₀ a 37 °C durante 15 min: 1 μM del ribosoma etiquetado; 1,5 μM cada uno de IF1, IF2 e IF3; ARNm biotinilado de 2 μM (que codifica MF para los dos primeros aminoácidos); 4 μM de fMet-tRNA^fMetcargado; y 1 mM GTP.
3. Prepare la mezcla EF-Tu_G mezclando los siguientes ingredientes en tampón TAM₁₀ a 37 °C durante 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP y 0,02 mg/mL de piruvato quinasa.
4. Prepare la mezcla EF-Tu_NoG similar al paso 2.3 sin EF-G.
5. Prepare la mezcla de Phe mezclando los siguientes ingredientes en agua libre de nucleasa a 37 °C durante 15 min: 100 mM Tris (pH 7.5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM de fenilalanina sintetasa específica, 2 A260/mL de ARNt^Pheetiquetado y 50 μM de fenilalanina.
6. Prepare el complejo de pre-translocación (PRE) mezclando las mezclas de iniciación, EF-Tu_NoG y Phe en la proporción de 1:2:2, a 37 °C durante 2 min. Después de la incubación, purificar el PRE por 1,1 M de cojín de sacarosa ultracentrifugación durante la noche a 100.000 x g.
7. Prepare el complejo post-translocación (POST) mezclando las mezclas de iniciación, EF-Tu_WG y Phe en la proporción de 1:2:2, a 37 °C durante 10 min. Después de la incubación, purificar el POST por 1,1 M de cojín de sacarosa ultracentrifugación durante la noche a 100.000 x g.

3. Preparación de diapositivas de muestra

1. Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio (75 mm x 25 mm) que contienen seis pares de orificios (1 mm de diámetro). Cada par forma una entrada-salida de la cámara de muestra. Asegúrese de que la distancia entre cada orificio de entrada-salida sea de 13 mm y la distancia de centro a centro entre dos canales sea de 6 mm. Coloque seis diapositivas en un crisol de vidrio.
2. Llena el crisol con acetona y sonica durante 5 min. Decantar la acetona y enjuagar los portaobjetos tres veces con agua ultrapura. Llene el crisol de nuevo con agua y 1 mL de 10 M KOH. Sonicar durante 20 min.
3. Enjuague los toboganes tres veces con agua ultrapura. Llene el crisol nuevamente con etanol y sonicato durante 5 min. Decantar completamente el disolvente. Deje que las diapositivas se sequen en la campana de humos.
4. Limpie las cubiertas de vidrio del microscopio (espesor #1.5, 24 x 40 mm). Realice los pasos de limpieza como se describe en los pasos 3.1-3.3.
5. Hornea los toboganes y fundas limpias a 300 °C durante 3 h. Manténgalos en el horno durante la noche para que se enfríen.
6. Cubra el cobierno con aminosilano. En el crisol que contiene fundas, vierta la mezcla de metanol (100 ml de metanol, 5 ml de agua, 0,5 ml de HAc y 1 ml de aminosilano). Caliente el crisol en un baño de agua durante 10 minutos, sonicarlo durante 10 minutos y luego caliente el crisol en el baño de agua durante otros 10 minutos. Decantar la mezcla de metanol, enjuagar bien el coverslip en tres crisoles de agua limpia. Purgue las superficies con una corriente de nitrógeno seco a través de una aguja.
7. Cubra las fundas con biotina-PEG en una campana laminar limpia.
   1. Para hacer la solución de PEG, use 98 mg de PEG y 2-3 mg de biotina-PEG en 200 μL de 100 mM de solución de NaHCO_3.
   2. Coloca una cubierta plana sobre una superficie. Deje caer cuidadosamente 60 μL de solución de PEG en el borde superior. Luego, coloca otro coverslip encima, dejando que el efecto capilar extienda la solución entre los dos coverslips. Asegúrese de que no se formen burbujas.
   3. Repita el paso 3.7.2 para dos pares más de fundas. Cubra seis piezas de fundas con biotina. Si se necesitan más hojas de cubierta, ajuste la cantidad de PEG y Peg de biotina en consecuencia para hacer más solución de PEG.
   4. Guarde estos recuestos en una caja de punta vacía llena de agua e incube durante 3 h en la oscuridad.
   5. Después de 3 h, separe las cubiertas, enjuague con agua en tres crisoles consecutivos y purgue con una corriente de nitrógeno seco. Coloque las fundas recubiertas en un estante de cerámica. Marque la superficie con recubrimiento.
8. Montar las cámaras de muestra¹⁹.
   1. Tire de las puntas de pipeta afiladas a través de los orificios de los portaobjetos de vidrio hasta que quepan bien. Raspe los extremos afilados hasta que estén completamente planos a la superficie del vidrio. Corte el otro extremo de la punta para que sea de aproximadamente 5 mm para la carga de la muestra.
   2. Corta una cinta de doble cara con el patrón de canal (25 x 40 mm).
   3. Pegue la cinta de doble cara en los toboganes de vidrio en el lado plano.
   4. Pegue la funda recubierta en la cinta de doble cara. Presione sobre él para hacer un sello hermético de la cámara de muestra. Asegúrese de que el lado recubierto esté orientado hacia adentro.

4. Imágenes FRET de molécula única

1. Encienda el equipo.
2. Encienda el interruptor del microscopio.
3. Inicie la interfaz de control láser y encienda el láser. Presione el botón de activación en la caja de control del láser para calentar el láser.
4. Encienda las cámaras.
5. Inicie el programa de software asociado al microscopio. Haga clic en el obturador superior Desactivado y haga clic en la luz Encendida.
6. Prepare el búfer TAM₁₀_WT agregando 10 μL de Tween-20 al 5% en 1 ml de tampón TAM_10.
7. Prepare la solución desoxi pesando 3 mg de glucosa oxidasa en un pequeño tubo de microcentrífuga. Añadir 45 μL de catalasa. Vórtice suavemente para disolver el sólido. Girar a 20.000 x g en una microcentrífuga durante 1 min. Toma el sobrenadante.
8. Preparar solución de glucosa al 30% en agua y solución de Trolox al 200 mM en DMSO.
9. Preparar 0,5 mg/ml de solución de estreptavidina en agua libre de nucleasas.
10. Agregue una gota de aceite de imagen al objetivo TIRF.
11. Coloque las cámaras de muestra en el objetivo.
12. Llene la cámara con 10 μL de solución de estreptavidina. Espere 1 min.
13. Lave la cámara con 30 ml de tampón de TAM10_WT y recoja la solución de correntía con un papel de filtro doblado. Espere 1 min.
14. Diluir los complejos de ribosomas (PRE o POST) a una concentración de 10-50 nM con TAM₁₀_WT tampón.
15. Cargue 20 μL de la muestra de ribosoma en el canal. Espere 2 min.
16. Haga el tampón de imágenes (50 μL de tampón TAM₁₀ más 0,5 μL cada una de las soluciones de desoxi, glucosa y Trolox). Mezcle bien el amortiguador.
17. Enjuague la cámara con 30 μL del tampón de imágenes.
18. Configure la cámara para que adquiera 100 ms/frame, 16 bits, 4 x 4 binning.
19. Haga clic en el obturador superior Encendido y la lámpara Apagada.
20. Inicie la adquisición de la cámara. Distribuya las imágenes en tres ventanas que representan dos cámaras individuales y la superposición.
21. Haga clic en Enfoque automático. Ajuste fino para encontrar el mejor enfoque.
22. Haga clic en un método. Establezca los puntos de campo, el almacenamiento de archivos y el número de bucle.
23. Haga clic en Ejecutar.
    NOTA: Aparece una nueva ventana con imágenes en tiempo real. El progreso de la serie temporal y la serie de campo de visión se muestran en la parte superior de la ventana.
24. Una vez completada la adquisición de la imagen, cierre la ventana emergente.
25. Abra el archivo ND (archivo adquirido).
26. Haga clic en ROI / editor de ROI simple. Elija la opción Círculo.
27. Seleccione el ROI en la imagen. Haga clic en Finalizar cuando esté completo.
28. Haga clic en Medición / Medición de tiempo para mostrar los datos como una gráfica o como una hoja de cálculo.
29. Abra la pestaña Exportar. Establezca los parámetros de exportación.
30. Haga clic en Exportar para guardar las intensidades.

Resultados

El smFRET tenía el ribosoma etiquetado en la posición media del tráfico de ARNt, para distinguir la translocación del ARNt del sitio A- al P (Figura 1)¹⁵. La distancia desde el residuo de etiquetado L27 hasta el ARNt del sitio A o P es de 52 o 61 Å, respectivamente, lo que corresponde a una eficiencia FRET de 0,47 y 0,65. Después de la recolección de imágenes, las intensidades de fluorescencia de los canales donante y aceptor se recuperaron y trazaron como lap...

Discusión

SmFRET es sensible a las señales de fondo. Primero, es necesario recubrir la cámara de muestra con una interpolación al 0,05% y luego agregarse simultáneamente con la solución de ribosoma para bloquear la unión no específica del ribosoma a la superficie. Para ver la fluorescencia de la emisión de Cy5 aceptor, el cóctel eliminador de oxígeno (soluciones deoxy, glucosa y Trolox) es esencial. Sin esta solución, el blanqueo es demasiado rápido en el canal aceptor para obtener información útil. Otro paso crític...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminosilane	Laysanbio	MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG	Laysanbio	Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells	Novagen	71403
Catalase	millipore sigma	C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge	nuaire
Cy3/C5-maleimide	ApexBio	A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope	Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood	Baker
Glucose oxidase	millipore sigma	G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)	Cytiva	17524701
Microscope cover slip	VWR	48393-230
Microscope glass slides	VWR	470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera	Hamamatsu
PEG (5,000)	Laysanbio	MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid	Novagen	69741
Sonicator	VWR	CPX-952-518R
TCEP	Apexbio	B6055
Trolox	millipore sigma	238813