리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

요약

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

초록

리보솜은 mRNA 템플릿을 따라 공정하게 단백질을 조립하는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체입니다. 리보솜의 직경은 A-, P-및 E-사이트에서 대형 tRNA 기판을 수용할 수 있는 약 20nm이다. 따라서 리보솜 역학은 자연스럽게 빠르게 단계적 해제됩니다. 단일 분자 방법은 각각의 리보솜을 개별적으로 감지하고 다중 구성 요소 시스템의 복잡한 메커니즘을 드러내는 데 필수적인 불동성 집단을 구별할 수 있습니다. 우리는 리보솜 단백질 L27과 tRNAs 사이 리보솜 역학을 조사하기 위하여 Nikon Ti2 반전 현미경을 기반으로 smFRET 방법의 세부 사항을 보고합니다. L27은 독특한 Cys 53 위치에 표시되어 L27이 부족하도록 설계된 리보솜으로 재구성됩니다. tRNA는 팔꿈치 부위에 표시되어 있습니다. tRNA가 전지 및 전후 전좌와 같은 신장 주기 동안 리보솜 내부의 다른 위치로 이동함에 따라 FRET 효율성과 역학은 여러 하위 집단을 제안한 차이를 나타낸다. 이러한 하위 채우기는 앙상블 방법으로 는 감지할 수 없습니다. TIRF 기반 smFRET 현미경은 수동 또는 전동 반전 현미경에 내장되어 있으며 집에서 만든 레이저 조명이 있습니다. 리보솜 샘플은 초원심분리에 의해 정제되어 집에서 만든 다중 채널 샘플 셀에 로드된 다음 에반에센트 레이저 필드를 통해 조명됩니다. 반사 레이저 스팟은 완벽한 초점의 피드백 제어를 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 신호는 전동 필터 포탑으로 분리되고 두 대의 디지털 CMOS 카메라에 의해 수집됩니다. 강도는 NIS-Elements 소프트웨어를 통해 검색됩니다.

서문

리보솜은 큰 (50S) 및 작은 (30S) 하위 단위의 ø 20 nm 큰 리보뉴클레오단백질 복합체이다. 그것은 공정하고 협조적으로 mRNA 템플릿을 따라 긴 펩티드를 조립합니다. 리보솜 30S는 단백질 합성을 시작하기 위해^{fMet-tRNA fMet} 및 mRNA에 결합하고, 50S는 70S 개시 복합체를 형성하기 위하여 그 때 결합합니다. tRNA는 A-사이트(아미노아실-tRNA 결합 부위)에서 리보솜에 아미노산을 가져오고, 길쭉한 펩티딜 체인은 P-site(peptidyl-tRNA 결합 부위)에서 유지된다. 전전 측부 복합체에서 펩티딜 사슬은 1개의 아미노산을 첨가한 A-사이트에서 tRNA로 전달된다. 한편, P-사이트 tRNA는 디딜레이트된다. 그런 다음 A-, P-tRNA는 P-, E-사이트로 이동하여 전자 사이트가 tRNA 출구 사이트를 나타내는 트랜스로케이션 후 복합체를 형성합니다. 이 상태에서, 펩디딜-tRNA는 P-사이트로 다시 이동한다. 신장 주기는 리보솜이 mRNA에 전·후 부적합,^한번에 1개의 코돈으로 이동하면서 사전 및 사후 적합성 사이에서 계속된다. 리보솜은 서브유닛 래칫^2,tRNA 혼성화 변동^3,GTPase 활성화^4,L1 줄기 개방 폐쇄⁵등과 같은 이 공정을 효율적이고 정확하게 만들기 위해 다양한 기능성 부위의 고도로 조화를 이룬다. 따라서, 리보솜은 모든 분자가 자신의 속도로 움직이기 때문에 신속하게 탈위상을 해제합니다. 종래의 방법은 명백한 평균 매개변수만 추론할 수 있지만, 인구밀도가 낮거나 수명이 짧은 종은 평균 효과^6에서가려질 것이다. 단일 분자 방법은 각 리보솜을 개별적으로 검출하여 이러한 한계를 깨고 통계 적 재구성^7을통해 다른 종을 식별 할 수 있습니다. tRNA-tRNA^8,EF-G-L11^9,L1-tRNA¹⁰등 사이의 상호 작용과 같은 리보솜 역학을 조사하기 위해 상이한 라벨링 사이트가 구현되었습니다. 또한, 크고 작은 서브유닛을 각각 라벨링함으로써, 서브유닛 래칫 운동학 및 인자와의 조정이^{관찰된다 11,12.} 한편, smFRET 방법은 다른 중앙 생물학적 과정에 광범위한 응용을 가지며, 다색 FRET 방법은^13으로부상하고 있다.

이전에는 소설 리보솜 FRET 쌍이^14,15를개발했습니다. 재조합 리보솜 단백질 L27은 표현, 정제 및 라벨을 부착하고 리보솜으로 다시 통합하였다. 이 단백질은 가까운 거리에서 tRNA와 상호 작용하고 전후 복합체에서 P 사이트 tRNA를 안정화하는 데 도움이되었습니다. tRNA가 A-에서 P-사이트로 이동하면 이 단백질과 tRNA 사이의 거리가 단축되어 스프렛 신호로 구별될 수 있습니다. 복수의 리보솜 하위집단은 통계적 방법 및 돌연변이발생을 이용하여 확인되었으며, 전소-전좌 복합체에서 이들 집단의 자발적교환은 리보솜이 mRNA에서 이동하기 전에 보다 유연하고, 디코딩 시 보다 경직된^16,17,18을시사한다. 이러한 변화는 리보솜 함수에 필수적입니다. 여기서, 프로토콜은 리보솜/tRNA 라벨링의 세부 사항, 리보솜에 의한, smFRET 샘플 제제 및 데이터^{수집/분석(19)에}대해 설명한다.

프로토콜

1. FRET 검출을 위한 라벨이 부착된 리보솜 및 tRNA 의 준비

1. 표준^{프로토콜(20,21)에}따라 대장균 균주 IW312로부터 L27없이 리보솜을 분리한다. 대장균 균주 MRE600으로부터 일반 리보솜을 추출한다.
2. C-단말 그의 태그와 L27의 rpmA 유전자를 pET-21b (+) 플라스미드로 복제하여 BL21(DE3)pLysS^{세포(15)로}변형및 발현된다. 미리 포장된 세파로즈 컬럼을 통해 단백질을 정화합니다.
3. L27 라벨링
   1. 실온(RT)에서 2-10배 초과 TCEP(Tris-2-carboxyethyl-phosphine)를 100 μL로 20-100 μM의 정제 L27을 30분 동안 배양한다. 버퍼는 용액을 낮잠-5 컬럼을 사용하여 PBS 버퍼(10m Na₂HPO_4,1.8mM KH₂PO_4,2.7 mM KCl; 0.137 M NaCl)로 교환한다. DMSO에 10배 초과 Cy5-maleimide 모노 반응성 염료를 첨가하고 2시간 동안 어둠 속에서 RT에서 배양합니다.
   2. 낮잠-5 컬럼에 위에서 언급한 표지된 단백질 용액(500 μL)을 적재하여 과도한 염료를 제거합니다. 제1색 밴드에서 단백질 엘루트가 있는지, 두 번째 밴드에서 프리 염료 엘루트가 각각 들어있는지 확인합니다. TAM₁₀ 버퍼(20m mM tris-HCl(pH 7.5), 10m M Mg(OAc)_2,30mM NH_4Cl,70mMM KCl, 0.5mMM EDTA, 7mM BME(2-메르카토에탄올)의 1mL에서 발출 단백질을 수집한다.
4. L27로 리보솜을 재구성합니다. 라벨이 부착된 L27 단백질을 TAM₁₀ 버퍼에서 동일한 양의 IW312 리보솜과 혼합하고 37°C에서 1h로 배양합니다. 리보솜이 튜브 바닥에 파란색 펠릿을 형성 할 수 있도록 자당 쿠션 울트라 원심 분리 (100,000 x g,하룻밤)에 의해 무료 단백질을 제거합니다.
5. 이전에 발표된^{보고서(22)에}따라 tRNA^Phe에 라벨을 부착하십시오. 먼저, TRNA(10A₂₆₀ in water)를 NaBH 4(100mM 스톡, 드롭와이즈)의 100 μL로 0°C에서 1h로 배양한다. 3M KAc(pH 5.0)와 2.5배 의 에탄올 부피를 1/10 부피를 추가하여 3회 에탄올 강수량을 통해 반응되지 않은 NaBH_4로부터 tRNA를 해제합니다. 0.1M 나트륨 포메이트(pH 3.7)의 최소 부피(~20 μL)에서 Cy3-NHS 염료 용액(DMSO 10 μL에서 1mg)의 1μL로 감소된 tRNA를 배양한다. 37°C에서 2시간 의 배양 후, 작은 G25 Sephadex 컬럼을 통해 반응되지 않은 염료로부터 tRNA를 분리한 다음, 2회 에탄올 침전을 통해 무료 염료를 제거한다.

2. 리보솜 단지 의 준비

1. 표준^{방법(15)을}사용하여 IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts 및 tRNA 신디사이저의 태그가 지정된 단백질을 표현하고 정화한다.
2. 15분 동안 37°C에서 TAM₁₀ 버퍼에 다음 성분을 첨가하여 개시 믹스를 준비: 라벨리보솜의 1 μM; IF1, IF2 및 IF3의 각각 1.5 μM; 2 μM 바이오티니얼 mRNA (처음 두 아미노산에 대한 MF 코딩); 충전 된 fMet-tRNA^fMet의4 μM; 및 1 mM GTP.
3. EF-Tu_G 혼합을 37°C에서 37°C에서 15분 동안 혼합하여 EF-Tu_G 혼합을 준비: 4 μM EF-Tu, 0.4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4mM GTP, 4mM PEP, 및 0.02 mg/mL의 Pyruvate 키나제.
4. EF-G 없이 2.3단계와 유사한 EF-Tu_NoG 믹스를 준비한다.
5. 다음 성분을 37°C에서 15분 동안 37°C에서 혼합하여 페 믹스를 준비: 100mM Tris (pH 7.5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM 페닐알라닌 특정 신디사이저, 2 A260/mL 라벨 tRNA^Phe,및 50 μM 페닐라닌.
6. 개시, EF-Tu_NoG 및 페믹스를 1:2:2, 37°C에서 2분 동안 혼합하여 전전 전과 복합체(PRE)를 준비한다. 인큐베이션 후, 100,000 x g에서하룻밤 동안 1.1 M 자당 쿠션 울트라 센트 심분리로 PRE를 정화합니다.
7. 개시, EF-Tu_WG 및 페믹스를 1:2:2, 37°C에서 10분 동안 혼합하여 전후 복합체(POST)를 준비한다. 인큐베이션 후, 100,000 x g에서하룻밤 동안 1.1 M 자당 쿠션 울트라 센트 심분리로 POST를 정화합니다.

3. 샘플 슬라이드 준비

1. 6쌍의 구멍(직경 1mm)을 포함하는 현미경 유리 슬라이드(75mm x 25mm)를 청소하십시오. 각 쌍은 샘플 챔버의 입구 출구를 형성한다. 각 입구 콘센트 구멍 사이의 거리가 13mm이고 두 채널 사이의 중심간 거리가 6mm인지 확인합니다. 6개의 슬라이드를 유리 도가니에 놓습니다.
2. 아세톤으로 도가니를 채우고 5 분 동안 초음파 처리하십시오. 아세톤을 데수고 초순수물로 슬라이드를 세 번 헹구십시오. 도가니를 다시 물과 10M KOH의 1mL로 채웁니다. 20 분 동안 초음파 처리합니다.
3. 초순수로 슬라이드를 세 번 헹구십시오. 에탄올로 도가니를 다시 채우고 5 분 동안 초음파 처리하십시오. 용매를 완전히 데산합니다. 연기 후드에서 슬라이드를 건조하게하십시오.
4. 현미경 유리 커버립 (#1.5 두께, 24 x 40mm)을 청소하십시오. 3.1-3.3 단계에서 설명한 대로 청소 단계를 수행합니다.
5. 청소된 슬라이드와 커버립을 300°C에서 3시간 동안 굽습니다. 밤새 용광로에 보관하여 식힙니다.
6. 아미노인으로 커버슬립을 코팅합니다. 커버립을 함유하는 도가니에서 메탄올 믹스(메탄올 100mL, 물 5mL, HAc 0.5mL, 아미노실란 1mL)을 붓는다. 도가니를 10분 동안 따뜻하게 하고, 10분 동안 초음파 처리한 다음, 수조에서 도가니를 10분 더 데우습니다. 메탄올 혼합물을 데치고, 깨끗한 물의 세 도가니에 커버슬립을 잘 헹구는다. 바늘을 통해 건조한 질소 스트림으로 표면을 제거합니다.
7. 커버립을 비오틴-페그로 래미나르 클린 후드에 코팅합니다.
   1. PEG 용액을 만들려면 98 mg의 PEG와 2-3 mg의 비오틴-PEG를 100m NaHCO₃ 용액의 200 μL에 사용하십시오.
   2. 표면에 하나의 커버슬립을 평평하게 놓습니다. 상단 가장자리에 PEG 용액60 μL을 조심스럽게 떨어 뜨립니다. 그런 다음, 그 위에 또 다른 커버 슬립을 놓고 모세관 효과가 두 커버립 사이에 용액을 퍼뜨리게합니다. 거품이 형성되지 않았는지 확인합니다.
   3. 두 쌍의 커버립에 대해 3.7.2 단계를 반복합니다. 커버립 6장에 비오틴을 코팅합니다. 더 많은 커버립이 필요한 경우 PEG 및 비오틴 PEG의 양을 적절히 조정하여 더 많은 PEG 솔루션을 만듭니다.
   4. 이 커버립을 물로 가득 찬 빈 팁 박스에 보관하고 어둠 속에서 3 시간 동안 배양하십시오.
   5. 3 시간 후, 커버립을 분리하고, 3 연속 도가니로 물로 헹구고, 건조한 질소 스트림으로 제거합니다. 코팅된 커버립을 세라믹 랙에 놓습니다. 코팅으로 표면을 표시합니다.
8. 샘플^{챔버(19)를}조립한다.
   1. 날카로운 파이펫 팁을 유리 슬라이드의 구멍을 통해 당겨서 꽉 맞을 때까지 당깁니다. 날카로운 끝을 유리 표면에 완전히 평평해질 때까지 긁어냅니다. 팁의 다른 쪽 끝을 샘플 로딩을 위해 약 5mm로 잘라냅니다.
   2. 채널 패턴(25 x 40mm)으로 양면 테이프를 잘라냅니다.
   3. 양면 테이프를 평평한 쪽의 유리 슬라이드에 고정합니다.
   4. 코팅된 커버슬립을 양면 테이프에 고정합니다. 시료 챔버의 단단한 씰을 만들기 위해 그것을 누릅니다. 코팅된 면이 안쪽을 향하고 있는지 확인하십시오.

4. 단일 분자 FRET 이미징

1. 컴퓨터를 켭니다.
2. 현미경 스위치를 켭니다.
3. 레이저 제어 인터페이스를 시작하고 레이저를 켭니다. 레이저 제어 상자의 사용 버튼을 눌러 레이저를 따뜻하게 합니다.
4. 카메라를 켭니다.
5. 현미경 관련 소프트웨어 프로그램을 시작합니다. 상단 셔터를 클릭하고 램프를 클릭합니다.
6. TAM₁₀_WT 버퍼의 1mL에 5% Tween-20의 10 μL을 추가하여 TAM₁₀ _WT 버퍼를 준비합니다.
7. 작은 미세 원심 분리기 튜브에 포도당 산화제 3 mg을 계량하여 탈옥 용액을 준비하십시오. 카탈라아제 45μL를 추가합니다. 고체를 부드럽게 녹여 소용돌이. 마이크로센트심분리기에서 20,000 x g로 1분 간 회전합니다. 상수.
8. DMSO에서 물 에서 30 % 포도당 용액과 200 mM 트룰록스 용액을 준비하십시오.
9. 뉴클레아제없는 물에 스트렙타비딘 용액의 0.5 mg / mL을 준비합니다.
10. TIRF 목표에 이미징 오일 한 방울을 추가합니다.
11. 샘플 챔버를 목표에 넣습니다.
12. 챔버를 10μL의 스트렙타비딘 용액으로 채웁니다. 1 분 기다립니다.
13. 30mL의 TAM10_WT 버퍼로 챔버를 세척하고 접힌 필터 용지로 런스루 솔루션을 수집합니다. 1 분 기다립니다.
14. TAM₁₀_WT 버퍼로 리보솜 복합체(PRE 또는 POST)를 10-50nM 농도로 희석합니다.
15. 리보솜 샘플의 20 μL을 채널에 로드합니다. 2 분 기다립니다.
16. 이미징 버퍼를 만듭니다(TAM 10 버퍼의₅₀ μL과 각각 의 0.5 μL의 탈옥, 포도당 및 트록스 솔루션)을 만듭니다. 버퍼를 잘 섞습니다.
17. 이미징 버퍼의 30 μL로 챔버를 플러시합니다.
18. 카메라를 설정하여 100 ms/프레임, 16비트, 4 x 4 비닝을 획득합니다.
19. 상단 셔터 켜기와 램프를 클릭합니다.
20. 카메라 수집을 시작합니다. 이미지를 두 개의 개별 카메라와 오버레이를 나타내는 세 개의 창으로 확산합니다.
21. 자동 초점을클릭합니다. 최고의 초점을 찾기 위해 미세 조정.
22. 메서드를 클릭합니다. 필드 포인트, 파일 저장소 및 루프 번호를 설정합니다.
23. 실행을클릭합니다.
    참고: 실시간 이미징과 함께 새 창이 나타납니다. 타임 시리즈 및 뷰 필드 시리즈의 진행 률이 창 상단에 표시됩니다.
24. 이미지 수집이 완료되면 팝업 창을 닫습니다.
25. ND 파일(획득파일)을 엽니다.
26. ROI / 간단한 ROI 편집기클릭합니다. 옵션 서클을 선택합니다.
27. 이미지에서 ROI를 선택합니다. 완료되면 완료를 클릭합니다.
28. 측정/시간 측정을 클릭하여 데이터를 플롯또는 스프레드시트로 표시합니다.
29. 내보내기 탭을 엽니다. 내보내기 매개 변수를 설정합니다.
30. 내보내기를 클릭하여 강도를 저장합니다.

결과

smFRET는 tRNA 트래픽의 중간 위치에 리보솜을 표시하여 TRNA 전좌를 A-에서 P 사이트로 구별하였다(도1)^15. L27 라벨링 잔류물에서 A-또는 P-사이트 tRNA에 대한 거리는 각각 52 또는 61Å이며, FRET 효율은 0.47 및 0.65에 해당한다. 이미지 수집 후, 기증자 및 수락자 채널의 형광 강도가 검색되어 시간 경과로플롯되었습니다(그림 1). FRET 효율은 ?...

토론

SmFRET는 배경 신호에 민감합니다. 먼저, 시료 챔버를 0.05% 트웬으로 코팅한 다음 리보솜 용액과 동시에 첨가하여 표면에 리보솜의 비특이적 결합을 차단할 필요가 있다. 수용자 Cy5 방출에서 형광을 보기 위해 산소 제거제 칵테일 (데옥시, 포도당 및 트로록스 용액)이 필수적입니다. 이 솔루션없이, 표백은 유용한 정보를 얻기 위해 수용자 채널에서 너무 빠릅니다. 리보솜 실험을 위한 또 다른 중요한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminosilane	Laysanbio	MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG	Laysanbio	Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells	Novagen	71403
Catalase	millipore sigma	C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge	nuaire
Cy3/C5-maleimide	ApexBio	A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope	Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood	Baker
Glucose oxidase	millipore sigma	G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)	Cytiva	17524701
Microscope cover slip	VWR	48393-230
Microscope glass slides	VWR	470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera	Hamamatsu
PEG (5,000)	Laysanbio	MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid	Novagen	69741
Sonicator	VWR	CPX-952-518R
TCEP	Apexbio	B6055
Trolox	millipore sigma	238813