التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

Summary

يتم تقديم نهج هنا للتصوير داخل الحيوية على المدى الطويل باستخدام نوافذ سيليكون واضحة بصريا يمكن لصقها مباشرة على الأنسجة / العضو محل الاهتمام والجلد. هذه النوافذ أرخص وأكثر تنوعا من غيرها المستخدمة حاليا في هذا المجال ، ويسبب الإدخال الجراحي التهابا محدودا وضيقا للحيوانات.

Abstract

يتيح الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) تصور حركة الخلية وانقسامها وموتها بدقة خلية واحدة. IVM من خلال نوافذ التصوير التي يتم إدخالها جراحيا قوية بشكل خاص لأنها تسمح بالمراقبة الطولية لنفس الأنسجة على مدار أيام إلى أسابيع. تشتمل نوافذ التصوير النموذجية على غطاء زجاجي في إطار معدني متوافق حيويا يتم خياطته على جلد الماوس. يمكن أن تتداخل هذه النوافذ مع الحركة الحرة للفئران ، وتثير استجابة التهابية قوية ، وتفشل بسبب الزجاج المكسور أو الغرز الممزقة ، والتي قد يتطلب أي منها القتل الرحيم. لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير نوافذ لتصوير أعضاء البطن والغدة الثديية على المدى الطويل من فيلم رقيق من polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون شفاف بصريا كان يستخدم سابقا لنوافذ التصوير في الجمجمة. يمكن لصق هذه النوافذ مباشرة على الأنسجة ، مما يقلل من الوقت اللازم للإدخال. يتميز نظام PDMS بالمرونة ، مما يساهم في متانته في الفئران بمرور الوقت - تم اختبار ما يصل إلى 35 يوما. التصوير الطولي هو تصوير لنفس منطقة الأنسجة خلال جلسات منفصلة. تم تضمين شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النوافذ لتوطين نفس المنطقة ، مما يسمح بتصور العمليات الديناميكية (مثل التفاف الغدة الثديية) في نفس المواقع ، بفارق أيام. سمحت نافذة السيليكون هذه أيضا بمراقبة الخلايا السرطانية المنتشرة المفردة التي تتطور إلى نقائل صغيرة بمرور الوقت. نوافذ السيليكون المستخدمة في هذه الدراسة أبسط في الإدخال من النوافذ الزجاجية ذات الإطار المعدني وتسبب التهابا محدودا في الأنسجة المصورة. علاوة على ذلك ، تسمح الشبكات المدمجة بالتتبع المباشر لنفس منطقة الأنسجة في جلسات التصوير المتكررة.

Introduction

يقدم الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) ، وهو تصوير الأنسجة في الحيوانات المخدرة ، نظرة ثاقبة على ديناميكيات الأحداث الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية في الأنسجة السليمة. تختلف تطبيقات هذه التقنية على نطاق واسع ، ولكن IVM كان له دور فعال في مجال بيولوجيا السرطان للمساعدة في توضيح كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة وانتشارها ، والتفاعل مع البيئة الدقيقة المحيطة ، والاستجابة للأدوية¹،^2،3. بالإضافة إلى ذلك ، كان IVM مفتاحا لتعزيز فهم الآليات المعقدة التي تحكم الاستجابات المناعية من خلال توفير رؤى مكملة لنهج التنميط خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي). على سبيل المثال ، كشفت تجارب التصوير داخل الحيوية عن تفاصيل حول وظائف المناعة من حيث صلتها بهجرة الخلايا والاتصال الخلوي الخلوي وقدمت منصة لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية استجابة للإصابة أو العدوى^4،5،^6،7. يمكن أيضا دراسة العديد من هذه العمليات من خلال التلطيخ النسيجي ، ولكن IVM فقط يسمح بتتبع التغييرات الديناميكية. في الواقع ، في حين أن القسم النسيجي يقدم لقطة للأنسجة في وقت معين ، يمكن للتصوير داخل الحيوية تتبع الأحداث بين الخلايا وتحت الخلايا داخل نفس النسيج بمرور الوقت. على وجه الخصوص ، سمح التقدم في وضع العلامات الفلورية وتطوير المراسلين الجزيئيين بربط الأحداث الجزيئية بالسلوكيات الخلوية ، مثل الانتشار والموت والحركة والتفاعل مع الخلايا الأخرى أو المصفوفة خارج الخلية. تعتمد معظم تقنيات IVM على الفحص المجهري الفلوري ، والذي بسبب تشتت الضوء ، يجعل تصوير الأنسجة العميقة أمرا صعبا. لذلك ، غالبا ما تحتاج الأنسجة المثيرة للاهتمام إلى التعرض جراحيا من خلال إجراء جراحي ونهائي في كثير من الأحيان. وبالتالي ، اعتمادا على موقع العضو ، يمكن تصوير الأنسجة بشكل مستمر لفترة تتراوح من عدد قليل إلى 40 ساعة⁸. بدلا من ذلك ، يسمح الإدخال الجراحي لنافذة تصوير دائمة بتصوير نفس الأنسجة بالتتابع على مدى فترة من الأيام إلى الأسابيع ^7,9.

تم تسليط الضوء على تطوير نوافذ تصوير جديدة كحاجة تكنولوجية لزيادة تحسين أساليب التصوير داخل الحيوية¹⁰. نافذة التصوير النموذجية داخل الحيوية هي حلقة معدنية تحتوي على غطاء زجاجي مثبت على الجلد باستخدام خيوط¹¹. التداخل مع حرية الحركة ، وتراكم الإفرازات ، وتلف الغطاء الزجاجي هي مشاكل شائعة شوهدت مع استخدام هذه النوافذ. علاوة على ذلك ، تتطلب النافذة النموذجية إنتاجا متخصصا ، ويمكن أن يتطلب الإجراء الجراحي تدريبا مكثفا. لمعالجة هذه القضايا ، تم تكييف polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون ، والذي تم استخدامه سابقا في نوافذ الجمجمة للتصوير طويل الأجل في الدماغ¹² ، للاستخدام في تصوير أعضاء البطن والغدة الثديية. هنا ، يتم تقديم طريقة مفصلة لتوليد نوافذ السيليكون القائمة على PDMS ، بما في ذلك كيفية إلقاء النافذة حول شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. علاوة على ذلك ، يتم وصف إجراء جراحي بسيط وخالي من الغرز لإدخال النافذة فوق أعضاء البطن أو الغدة الثديية. يتغلب هذا النهج الجديد على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا ويزيد من إمكانية الوصول إلى التصوير الطولي داخل الحيوية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للمبادئ التوجيهية الجراحية لمختبر كولد سبرينج هاربور وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مختبر كولد سبرينج هاربور.

1. صب نافذة السيليكون

1. تحضير بوليمر السيليكون (PDMS) عن طريق خلط المطاط الصناعي الأساسي وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 (v / v).
2. قم بصب نافذة عن طريق إيداع كمية صغيرة من PDMS على سطح معقم وأملس وضبط نسبة الحجم إلى المساحة إلى السماكة المطلوبة.
   ملاحظة: يؤدي استخدام 200 ملغ من محلول البوليمر لدائرة قطرها 22 مم على غطاء غطاء 24 صفيحة جيدة إلى حل وسط جيد بين متانة النافذة والوضوح البصري.
3. اختياري: لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة، اضغط برفق على شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ في السيليكون بعد أن يكون PDMS على سطح الصب المطلوب.
4. لإزالة فقاعات الهواء ، ضع السطح المطلي في مجفف فراغ لمدة 45 دقيقة لإزالة غاز البوليمر.
5. عالج نوافذ السيليكون في فرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
6. سجل البوليمر عند حواف القالب وقشر النوافذ المعالجة بلطف من السطح المستخدم في الصب باستخدام الملقط.
7. قبل الجراحة ، قم بتعقيم النوافذ عن طريق التعقيم.

2. إعداد الماوس لإدخال نافذة السيليكون

1. تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 4٪ (v / v) isoflurane. حرك الماوس إلى وسادة الاحترار على الطاولة الجراحية ، وضع الماوس في قناع الأنف المخدر ، وخفض تركيز الأيزوفلوران إلى 2٪ للصيانة طوال الجراحة.
2. تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص أصابع القدم من الأطراف الخلفية. لا تتابع حتى يصبح الماوس غير نشط ولا يظهر استجابة منعكسة لقرصة إصبع القدم.
3. ضع مواد التشحيم العينية على العينين لمنعهما من الجفاف ومنع الصدمة.
4. إدارة التسكين الوقائي (البوبرينورفين 0.05 ملغم / كغ) تحت الجلد.
5. حلق الموقع الجراحي وإزالة الشعر تماما باستخدام كريم إزالة الشعر.
6. تطبيق محلول البوفيدون اليود (10٪ v / v) والإيثانول (70٪ v / v) على التوالي 3x لمنع عدوى الموقع الجراحي.

3. إدخال نافذة بطنية للتصوير في الكبد ؛ قابلة للتكيف مع أعضاء البطن الأخرى (الشكل 1)

1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
2. قم بعمل شق 10 مم بدءا من 3 مم لأسفل من عملية الخناق باستخدام مقص وملقط معقمين.
3. إزالة قسم 1-1.5 سم² من الجلد على طول خط الوسط.
4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
5. اختياري: لتصور جزء أكبر من الكبد، استخدم مسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم لدفع الكبد لأسفل من الحجاب الحاجز الذي يكشف عن الرباط المنجلي الذي يربط الكبد بالحجاب الحاجز. اقطع الرباط مع الحرص على عدم قطع الوريد الأجوف السفلي.
6. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها. تخلق هذه المادة اللاصقة ختما دائريا ، تاركة المنطقة المركزية سليمة للتصوير.
   تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة. ليس من الضروري تجفيف الأنسجة قبل تطبيق المادة اللاصقة.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي مواد لاصقة قائمة على سيانو أكريليت بنجاح لهذا الإجراء. لاصق جراحي يضمن العقم. بالنسبة للإجراءات الطرفية ، تحقق الغراء الفائق لجميع الأغراض نتائج جيدة.
7. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
8. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
9. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
10. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة الكبد مرئية الآن من خلال النافذة.
11. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.
    تنبيه: إذا تم تنفيذ الإجراء باستخدام تقنيات جراحية معقمة وتم تعقيم النافذة قبل الإدخال ، فإن إغلاق الجرح بمادة لاصقة جراحية يكفي لتجنب العدوى. ومع ذلك ، فإن الفشل في اتباع تقنيات التعقيم المناسبة أثناء الإدخال الجراحي أو الإغلاق غير الكامل يمكن أن يؤدي إلى عدوى علنية أو تحت السريرية وتجفيف الأنسجة.

4. إدخال نافذة جانبية للتصوير في الكبد ؛ متوافقة مع الحقن المتزامن للخلايا السرطانية في الوريد البابي (الشكل 2)

1. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر
2. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيمن 3 مم أسفل القوس الساحلي باستخدام مقص وملقط معقمين.
3. إزالة 1 سم² قسم من الجلد.
4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
5. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
   تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي مواد لاصقة قائمة على سيانو أكريليت بنجاح لهذا الإجراء. لاصق جراحي يضمن العقم. بالنسبة للإجراءات الطرفية ، تحقق الغراء الفائق لجميع الأغراض نتائج جيدة.
6. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على الكبد حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
7. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
8. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
9. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
   ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة الكبد مرئية الآن من خلال النافذة.
10. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.
11. إذا كانت هناك حاجة إلى حقن الوريد البابي:
    1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
    2. قم بعمل شق 10 مم بدءا من عملية الخناق في الجلد.
    3. باستخدام زوج ثان من المقص المعقم والملقط ، قم بعمل شق 10 مم في الصفاق.
    4. اغمس مسحتين من القطن في محلول ملحي معقم.
    5. استخدم مسحات القطن لسحب الأمعاء بلطف إلى شاش معقم مبلل بمحلول ملحي معقم ، مع الحرص على عدم التواء الاتجاه أو إزعاجه بطريقة أخرى.
    6. استمر في إزاحة الأمعاء من تجويف البطن حتى يصبح الوريد البابي مرئيا على الجانب الأيمن من البطن.
    7. أدخل إبرة 31-33 جم ذيلية 5-7 مم إلى نقطة دخول الوريد البابي إلى الكبد ، مع التأكد من المضي قدما داخل الوعاء الدموي وليس من خلاله.
    8. حقن الخلايا السرطانية ببطء (أعيد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة).
       ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة ، يمكن استزراع خط خلايا سرطان البنكرياس الامورين (على سبيل المثال ، KPC-BL/6-1199) في وسائط DMEM كاملة وخلايا 1 × 10⁵ يتم حقنها في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة.
    9. لمنع النزيف ، مباشرة بعد سحب الإبرة ، ضع ضغطا لطيفا على موقع الحقن بقطعة صغيرة من الإسفنج الجراحي لمدة 1-2 دقيقة.
    10. بعد تحرير الضغط ، راقب الموقع لمدة 1-2 دقيقة لضمان الإرقاء.
    11. باستخدام مسحات القطن المبللة ، أعد الأمعاء إلى تجويف البطن بعد التوجه الفسيولوجي للعضو.
    12. باستخدام ملقط معقم ، أدخل النافذة مباشرة تحت الصفاق ، على الجانب الأيسر من تجويف البطن للماوس.
    13. خياطة مع 4-0 خيوط الحرير وتدبيس شق خط الوسط مع مشابك الجرح 7 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    14. حرك الماوس إلى موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر
    15. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيمن 3 مم تحت القوس الساحلي من خلال الجلد باستخدام مقص وملقط معقم.
    16. إزالة قسم 1 سم² من الجلد حول الشق.
    17. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
    18. اسحب النافذة إلى مكانها فوق الكبد قبل لصقها في مكانها ، كما هو موضح في الخطوات 4.8-4.10.

5. إدخال نافذة للتصوير في البنكرياس (الشكل 3)

1. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيمن.
2. قم بعمل شق 10 مم على الجناح الأيسر 3 مم أسفل القوس الساحلي باستخدام مقص وملقط معقمين.
3. إزالة قسم 1 سم² من الجلد حول الشق.
4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد.
5. باستخدام مسحات قطنية معقمة غارقة في محلول ملحي معقم ، اسحب الطحال بلطف لتصور البنكرياس. انتقل إلى إعادة وضع البنكرياس باستخدام مسحات القطن المبللة لجعل مساحة السطح مرئية من خلال الشق.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن حقن خلايا سرطان البنكرياس عن طريق تقويم العظام في البنكرياس إذا كان جزءا من التصميم التجريبي.
6. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح البنكرياس حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
   تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
7. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام على البنكرياس حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
8. قم بطي حواف النافذة تحت الصفاق.
9. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق. اضغط لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.
10. وبالمثل ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على الصفاق قبل الضغط على الجلد باستخدام ملقط لتثبيته على الصفاق.
    ملاحظة: إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فيجب أن تكون منطقة دائرية من أنسجة البنكرياس مرئية الآن من خلال النافذة.
11. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.

6. إدخال نافذة للتصوير في الغدة الثديية (الشكل 4)

1. ضع الماوس على وضع الاستلقاء.
2. اصنعي شقا إنسيابيا بمقدار 10 مم لإحدى الحلمات الإربية باستخدام مقص وملقط معقمين.
3. إزالة 0.5 سم² جزء من الجلد فوق الغدة الثديية.
4. استخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم لفصل الغدة الثديية بعناية عن الجلد عن طريق نشر المقص بين السطحين لتعطيل الالتصاق.
   ملاحظة: لتسهيل تصوير منطقة الغدة الثديية الأربية، احرصي على تشريح جزء من الجلد فوق الغدة الثديية ولكن متفوقا على الساق الخلفية، بحيث لا تحد النافذة من حركة الماوس.
5. اسحب المادة اللاصقة الجراحية باستخدام حقنة 31 جم ، وقم بتطبيق كمية صغيرة منها على سطح الغدة الثديية حول حواف المنطقة المراد تصويرها.
   تنبيه: قصر المادة اللاصقة على قطرات صغيرة تشكل نمطا دائريا حول منطقة التصوير. لا يمكن تصوير الأنسجة الملامسة مباشرة للمادة اللاصقة.
6. ضع النافذة باستخدام الملقط وأمسكها بإحكام ضد الغدة الثديية حتى تجف المادة اللاصقة (~ 2 دقيقة).
   ملاحظة: يجب أن تكون المنطقة الدائرية من أنسجة الغدة الثديية مرئية الآن من خلال النافذة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
7. أضعاف حواف النافذة تحت الجلد.
8. باستخدام حقنة ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الجلد. اضغط لأسفل على الجلد باستخدام الملقط لتثبيت الجلد على النافذة.
9. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تساعد على منع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة.

7. التعافي بعد الجراحة

1. ضع الماوس في قفص استرداد نظيف مع مواد تعشيش وافرة ، مما يضمن أن جزءا من القفص يستريح على وسادة تدفئة.
2. راقب الماوس باستمرار حتى يصبح واعيا ومتحركا.
3. إذا لزم الأمر ، قدم جرعة إضافية من المسكن 12 ساعة بعد الجرعة الوقائية.
   ملاحظة: التسكين الإضافي غير ضروري بشكل عام ، ولكن استشر الطبيب البيطري إذا أظهر الفأر علامات الضيق (مثل الظهر المنحني أو الفراء غير المهذب أو فقد الاهتمام بالطعام). راقب الفأر يوميا لأول 3 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات العدوى أو الآثار الضارة الأخرى. أقل من 2٪ من الفئران تتطلب عناية بيطرية أو القتل الرحيم ، وعادة ما يكون ذلك بسبب الانفصال الجزئي للنافذة. من المهم ملاحظة أنه بالنسبة للفئران الذكور التي لديها نوافذ تصوير الكبد البطني ، يمكن أن يؤدي القتال بين الفئران إلى انفصال النوافذ. يتم تجنب ذلك عن طريق إيواء الفئران بشكل منفصل.

8. التصوير من خلال النافذة

1. تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 4٪ (v / v) isoflurane.
2. ضع مواد التشحيم العينية على العينين لمنعهما من الجفاف ومنع الصدمة.
3. حرك الماوس من غرفة الحث إلى مرحلة المجهر. ضع الفأرة في قناع الأنف المخدر ، وخفض تركيز الأيزوفلوران إلى حوالي 1-1.5٪ لتخدير الصيانة طوال عملية التصوير.
4. ضع مستشعر وسادة الضغط أسفل الماوس لمراقبة معدل التنفس وتثبيت الماوس على المسرح باستخدام شريط جراحي ناعم.
5. أدخل ميزان حرارة مستقيمي لمراقبة درجة حرارة الجسم طوال جلسة التصوير.
6. قم بتشغيل الوسادة المسخنة ، وراقب الماوس عن كثب للتأكد من أن درجة حرارة الجسم لا تتجاوز 37 درجة مئوية.
7. استخدم البرنامج لمراقبة معدل تنفس الماوس. المعدل الأمثل هو ~ 1 التنفس / الثانية. اضبط التخدير كما هو مطلوب.
8. قبل كل جلسة تصوير، نظف النافذة من أي وسط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسحها بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v/v).
9. عند استخدام عدسة الغمر بالماء ، ضع هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة ، وتجنب الفقاعات.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الماء المقطر ولكن قد يتطلب إعادة تطبيقه أثناء التصوير.
10. للعثور على العمق الأمثل للتصوير ، أولا ، حدد موقع الشبكة ووضعها في التركيز البؤري.
11. حدد عمق تصوير الأنسجة التقريبي عن طريق تعيين الجزء السفلي من الشبكة إلى 0. هذه المعلومات ضرورية لتحديد موقع المستوى z المقابل في جلسات التصوير اللاحقة.
12. لتحديد نفس الموقع عبر جلسات تصوير متعددة، استخدم المربعات الموجودة على الشبكة كنقطة مرجعية. أثناء التصوير ، لاحظ اتجاه الشبكة والموقع داخل شبكة كل مجال رؤية تم تصويره (على سبيل المثال ، الصف 2^الثاني من الأعلى^{، المربع} 4 من اليسار).
13. أثناء جلسات التصوير المتتالية، استخدم الشبكة للانتقال مرة أخرى إلى مناطق شبكة محددة - وبالتالي حقول التصوير.
14. بعد كل جلسة تصوير، قم بإزالة أي وسيط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسح النافذة بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول (v/v).

النتائج

يمكن استخدام التصوير داخل الحيوية من خلال نوافذ التصوير لمراقبة وتتبع وتحديد مجموعة واسعة من الأحداث الخلوية والجزيئية بدقة خلية واحدة على مدى فترة من ساعات إلى أسابيع. وتشمل الميزات المثالية لنافذة التصوير ما يلي: (أ) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدو?...

Discussion

تعد نوافذ التصوير داخل الحيوية أدوات مهمة للتصور المباشر للعمليات الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية أثناء تكشفها بمرور الوقت. يتغلب الإجراء الجديد الموصوف لصب وإدخال نوافذ تصوير مرنة من السيليكون في الفئران على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا (الإفرازات والكسر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453