הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

Summary

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

Abstract

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) מאפשרת הדמיה של תנועת תאים, חלוקה ומוות ברזולוציה של תא בודד. IVM דרך חלונות הדמיה שהוכנסו בניתוח הוא חזק במיוחד מכיוון שהוא מאפשר תצפית אורכית של אותה רקמה במשך ימים עד שבועות. חלונות הדמיה טיפוסיים כוללים כיסוי זכוכית במסגרת מתכת תואמת ביולוגית הנתפרת לעור העכבר. חלונות אלה יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, לעורר תגובה דלקתית חזקה, ולהיכשל עקב זכוכית שבורה או תפרים קרועים, שכל אחד מהם עשוי להצריך המתת חסד. כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחו חלונות להדמיה ארוכת טווח של איברי בטן ובלוטות החלב מסרט דק של פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון צלול אופטית ששימש בעבר להדמיית חלונות הדמיה גולגולתיים. חלונות אלה יכולים להיות מודבקים ישירות לרקמות, ובכך להפחית את הזמן הדרוש להחדרה. PDMS הוא גמיש, ותורם לעמידותו בעכברים לאורך זמן – עד 35 יום נבדקו. הדמיה אורכית היא הדמיה של אותו אזור רקמה במהלך מפגשים נפרדים. רשת נירוסטה הוטמעה בתוך החלונות כדי למקם את אותו אזור, מה שאפשר הדמיה של תהליכים דינמיים (כמו אינבולוציה של בלוטת החלב) באותם מקומות, בהפרש של ימים ספורים זה מזה. חלון סיליקון זה איפשר גם ניטור של תאים סרטניים בעלי תפוצה יחידה המתפתחים למיקרו-גרורות לאורך זמן. חלונות הסיליקון ששימשו במחקר זה פשוטים יותר להחדרה מאשר חלונות זכוכית ממוסגרים במתכת וגורמים לדלקת מוגבלת של הרקמות המצולמות. יתר על כן, רשתות משובצות מאפשרות מעקב פשוט אחר אותו אזור רקמה במפגשי הדמיה חוזרים ונשנים.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM), הדמיה של רקמות בבעלי חיים מורדמים, מציעה תובנות על הדינמיקה של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית ברקמות שלמות. היישומים של טכניקה זו משתנים מאוד, אך IVM סייע בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לעזור להבהיר כיצד תאים סרטניים פולשים לרקמות וגרורות, מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב ומגיבים לתרופות ^1,2,3. בנוסף, IVM היה המפתח לקידום ההבנה של המנגנונים המורכבים השולטים בתגובות החיסוניות על ידי מתן תובנות המשלימות לגישות פרופיל ex vivo (למשל, ציטומטריה של זרימה). לדוגמה, ניסויי הדמיה תוך-ורידיים חשפו פרטים על תפקודי מערכת החיסון בכל הקשור לנדידת תאים ולמגע בין תאים, והציעו פלטפורמה לכמות הדינמיקה המרחבית-טמפורלית בתגובה לפציעה או לזיהום 4,5,6,7. רבים מהתהליכים הללו יכולים להיחקר גם באמצעות כתמים היסטולוגיים, אך רק IVM מאפשר מעקב אחר שינויים דינמיים. למעשה, בעוד שמקטע היסטולוגי מציע תמונת מצב של הרקמה בזמן נתון, הדמיה תוך-תאית יכולה לעקוב אחר אירועים בין-תאיים ותת-תאיים בתוך אותה רקמה לאורך זמן. בפרט, ההתקדמות בתיוג הפלואורסצנטי והתפתחותם של כתבים מולקולריים אפשרו לאירועים מולקולריים להיות מתואמים עם התנהגויות תאיות, כגון התפשטות, מוות, תנועתיות ואינטראקציה עם תאים אחרים או עם המטריצה החוץ-תאית. רוב טכניקות IVM מבוססות על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אשר בשל פיזור אור, מה שהופך את ההדמיה של רקמות עמוקות יותר למאתגרת. הרקמה המעניינת, אם כן, צריכה לעתים קרובות להיחשף בניתוח בהליך פולשני וסופי לעתים קרובות. לכן, בהתאם לאתר האיבר, ניתן לדמות את הרקמה ברציפות במשך תקופה שנעה בין כמה ל -40 שעות⁸. לחלופין, החדרה כירורגית של חלון הדמיה קבוע מאפשרת הדמיה של אותה רקמה ברצף על פני תקופה של ימים עד שבועות ^7,9.

הפיתוח של חלונות הדמיה חדשים הודגש כצורך טכנולוגי לשיפור נוסף של גישות ההדמיה התוך-ויראלית¹⁰. חלון ההדמיה התוך-עינית הוא טבעת מתכת המכילה כיסוי זכוכית המחובר לעור עם תפרים¹¹. הפרעה לתנועה חופשית, הצטברות של הפרשה ונזק לכיסוי הזכוכית הם בעיות נפוצות שנראו בשימוש בחלונות כאלה. יתר על כן, החלון האבטיפוסי דורש ייצור מיוחד, וההליך הכירורגי יכול לדרוש הכשרה נרחבת. כדי לטפל בבעיות אלה, פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון, ששימש בעבר בחלונות גולגולת להדמיה ארוכת טווח במוח¹², הותאם לשימוש בהדמיית איברי בטן ובלוטת החלב. כאן מוצגת שיטה מפורטת ליצירת חלונות סיליקון מבוססי PDMS, כולל כיצד להטיל את החלון סביב רשת נירוסטה כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת של אותם אזורי רקמה. יתר על כן, מתואר הליך כירורגי פשוט ונטול תפרים להחדרת החלון מעל איברי הבטן או בלוטת החלב. גישה חדשה זו מתגברת על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום ומגבירה את הנגישות של הדמיה תוך-ורידית אורכית.

Protocol

כל ההליכים שתוארו בוצעו בהתאם להנחיות הכירורגיות של מעבדת קולד ספרינג הארבור ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת קולד ספרינג הארבור.

1. יציקת חלון הסיליקון

1. הכן את פולימר הסיליקון (PDMS) על ידי ערבוב האלסטומר הבסיסי וחומר הריפוי ביחס של 10:1 (v/v).
2. יציקו חלון על ידי הפקדת כמות קטנה של PDMS על משטח סטרילי וחלק והתאימו את יחס הנפח לאזור לעובי הרצוי.
   הערה: שימוש בתמיסת פולימר של 200 מ"ג עבור עיגול בקוטר 22 מ"מ על מכסה של מכסה של 24 לוחות היטב מביא לפשרה טובה בין עמידות החלון לבהירות אופטית.
3. אופציונלי: כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת ונשנית של אותם אזורי רקמה, לחץ קלות על רשת נירוסטה לתוך הסיליקון לאחר שה- PDMS נמצא על משטח היציקה הרצוי.
4. כדי להסיר בועות אוויר, מניחים את המשטח המצופה במייבש ואקום למשך 45 דקות כדי לנטרל את הפולימר.
5. יש לרפא את חלונות הסיליקון בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
6. נקבו את הפולימר בשולי התבנית וקלפו בעדינות את החלונות הנרפאים מהמשטח המשמש ליציקה עם מלקחיים.
7. לפני הניתוח, לעקר את החלונות על ידי autoclaving.

2. הכנת העכבר להכנסת חלון הסיליקון

1. הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 4% (v/v) איזופלורן. העבירו את העכבר למשטח חימום על שולחן הניתוח, הניחו את העכבר במסכת האף להרדמה והורידו את ריכוז האיזופלורן ל-2% לצורך תחזוקה לאורך כל הניתוח.
2. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטה של בהונות הגפיים האחוריות. אין להמשיך עד שהעכבר אינו פעיל ואינו מראה תגובת רפלקס צביטה בבוהן.
3. יש למרוח על העיניים חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהן להתייבש ולמנוע טראומה.
4. נהלו משכך כאבים מונע (בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית.
5. לגלח את אתר הניתוח ולהסיר לחלוטין את השיער עם קרם להסרת שיער.
6. יש למרוח תמיסת פובידון-יוד (10% v/v) ואתנול (70% v/v) ברצף פי 3 כדי למנוע את ההדבקה באתר הניתוח.

3. החדרת חלון גחון להדמיה בכבד; ניתן להתאמה לאיברי בטן אחרים (איור 1)

1. מקם את העכבר במצב שכיבה.
2. בצע חתך 10 מ"מ החל 3 מ"מ למטה מתהליך xiphoid באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
3. יש להסיר מקטע של 1-1.5 ס"מ² של העור לאורך קו האמצע.
4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
5. אופציונלי: כדי לדמיין חלק גדול יותר מהכבד, השתמשו במטושי כותנה סטריליים לחים במי מלח סטריליים כדי לדחוף את הכבד כלפי מטה מהסרעפת החושפת את הרצועה הפלציפורמית המחברת את הכבד לסרעפת. נתקו את הרצועה תוך הקפדה שלא לחתוך את הווריד הנבוב התחתון.
6. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הכבד סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה. דבק זה יוצר אטימה עגולה, ומשאיר את אזור המרכז שלם להדמיה.
   אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק. אין צורך לייבש את הרקמה לפני החלת הדבק.
   הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בכל הדבקים המבוססים על ציאנואקרילט עבור הליך זה. דבק כירורגי מבטיח סטריליות. עבור הליכים סופניים, דבקי-על לכל מטרה מניבים תוצאות טובות.
7. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
8. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
9. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
10. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הכבד צריך להיראות כעת דרך החלון.
11. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.
    אזהרה: אם ההליך מתבצע בטכניקות כירורגיות סטריליות והחלון מעוקר לפני ההחדרה, די באיטום הפצע באמצעות דבק כירורגי כדי למנוע זיהומים. עם זאת, אי ביצוע טכניקות אספטיות נכונות במהלך החדרה כירורגית או סגירה לא מושלמת עלול להוביל לזיהום גלוי או תת-קליני ולהתייבשות מהרקמה.

4. החדרת חלון רוחבי להדמיה בכבד; התואם את ההזרקה המקבילה של תאים סרטניים בווריד הפורטל (איור 2)

1. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי השמאלי
2. בצע חתך 10 מ"מ באגף הימני 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
3. יש להסיר קטע עור בגודל 1 ס"מ^ו-2 .
4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
5. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הכבד סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
   אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
   הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בכל הדבקים המבוססים על ציאנואקרילט עבור הליך זה. דבק כירורגי מבטיח סטריליות. עבור הליכים סופניים, דבקי-על לכל מטרה מניבים תוצאות טובות.
6. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
7. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
8. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
9. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
   הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הכבד צריך להיראות כעת דרך החלון.
10. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.
11. אם נדרשת הזרקת וריד פורטל:
    1. מקם את העכבר במצב שכיבה.
    2. בצע חתך של 10 מ"מ החל מתהליך ה- xiphoid בעור.
    3. באמצעות זוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים, לבצע חתך 10 מ"מ בצפק.
    4. טובלים שני צמר גפן מלוחים במי מלח סטריליים.
    5. השתמשו במטושים מכותנה כדי למשוך בעדינות את המעי על גזה סטרילית הרטובה במי מלח סטריליים, תוך הקפדה שלא לסובב או לשבש את הכיוון בדרך אחרת.
    6. יש להמשיך לעקור את המעי מחלל הבטן עד לווריד הפורטלי להיראות בצד ימין של הבטן.
    7. מכניסים מחט 31–33 גרם בקוטר 5–7 מ"מ עד לנקודת הכניסה של וריד הפורטל לתוך הכבד, תוך הקפדה להמשיך בתוך כלי הדם ולא דרכו.
    8. לאט לאט להזריק את התאים הסרטניים (resuspended ב 100 μL של PBS סטרילי).
       הערה: עבור ניסוי זה ניתן לתרבית את קו תאי סרטן הלבלב של אמורין (לדוגמה, KPC-BL/6-1199) בתרבית במדיית DMEM מלאה וב-1 x 10 10⁵ תאים מוזרקים ב-100 μL של PBS סטרילי.
    9. כדי למנוע דימום, מיד לאחר משיכת המחט, להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה עם חתיכה קטנה של ספוג כירורגי במשך 1-2 דקות.
    10. לאחר שחרור הלחץ, יש לעקוב אחר האתר במשך 1-2 דקות כדי לוודא שהמוסטזיס.
    11. באמצעות צמר גפן לח, להחזיר את המעי לתוך חלל הבטן בעקבות הכיוון הפיזיולוגי של האיבר.
    12. באמצעות מלקחיים סטריליים, להכניס את החלון מיד מתחת לצפק, בצד שמאל של חלל הבטן של העכבר.
    13. תפר עם תפרים משי 4-0 ומהדק את החתך בקו האמצע עם קליפסים לפצעים מפלדת אל-חלד 7 מ"מ.
    14. הזזת העכבר למצב דקוביטוס לרוחב שמאלה
    15. בצע חתך 10 מ"מ באגף הימני 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית דרך העור באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
    16. יש להסיר מקטע של 1 ס"מ² של העור סביב החתך.
    17. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
    18. משוך את החלון למקומו מעל הכבד לפני הדבקתו במקומו, כמתואר בשלבים 4.8-4.10.

5. החדרת החלון להדמיה בלבלב (איור 3)

1. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי הימני.
2. בצע חתך 10 מ"מ באגף השמאלי 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
3. יש להסיר מקטע של 1 ס"מ² של העור סביב החתך.
4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
5. באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים, משכו בעדינות את הטחול כדי לדמיין את הלבלב. המשך למקם מחדש את הלבלב עם מטושים מכותנה לחה כדי להפוך שטח פנים גדול יותר לנראה דרך החתך.
   הערה: בשלב זה, תאים סרטניים בלבלב יכולים להיות מוזרקים באופן אורתוטופי לתוך הלבלב אם זה חלק מהתכנון הניסויי.
6. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הלבלב סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
   אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
7. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הלבלב עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
8. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
9. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
10. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הלבלב צריך להיות גלוי כעת דרך החלון.
11. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.

6. החדרת החלון להדמיה בבלוטת החלב (איור 4)

1. מקם את העכבר על מצב השכיבה.
2. הכינו חתך 10 מ"מ מדיאלי לאחת הפטמות המפשעתיות באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
3. יש להסיר קטע עור בגודל 0.5 ס"מ² מעל בלוטת החלב.
4. השתמשו בזוג שני של מספריים סטריליים כדי להפריד בזהירות את בלוטת החלב מהעור על ידי פיזור המספריים בין שני המשטחים כדי לשבש את ההדבקה.
   הערה: כדי להקל על הדמיה של אזור בלוטת החלב המפשעה, הקפידו לנתח חלק מהעור מעל בלוטת החלב אך עדיף על הרגל האחורית, כך שהחלון אינו מגביל את ניידות העכבר.
5. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של בלוטת החלב סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
   אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
6. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד בלוטת החלב עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
   הערה: אזור מעגלי של רקמת בלוטת החלב צריך להיות גלוי כעת דרך החלון אם הוא מבוצע כראוי.
7. מקפלים את שולי החלון מתחת לעור.
8. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לעור. לדחוף למטה על העור עם מלקחיים כדי להצמיד את העור לחלון.
9. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.

7. התאוששות לאחר הניתוח

1. מניחים את העכבר בכלוב התאוששות נקי עם חומר קינון בשפע, ומבטיחים שחלק מהכלוב מונח על משטח חימום.
2. נטר את העכבר באופן רציף עד שהוא מודע ונייד.
3. במידת הצורך, לספק מנה נוספת של משכך כאבים 12 שעות לאחר המינון מראש.
   הערה: משככי כאבים נוספים הם בדרך כלל מיותרים, אך התייעצו עם וטרינר אם העכבר מראה סימני מצוקה (כגון גב חבוק, פרווה לא מטופחת או אובדן עניין במזון). עקוב אחר העכבר מדי יום במשך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח עבור סימנים של זיהום או תופעות לוואי אחרות. פחות מ-2% מהעכברים זקוקים לטיפול וטרינרי או להמתת חסד, בדרך כלל עקב ניתוק חלקי של החלון. חשוב לציין כי עבור עכברים זכרים עם חלונות הדמיה של כבד גחוני, לחימה בין עכברים עלולה לגרום לניתוק חלונות. זה נמנע על ידי דיור העכברים בנפרד.

8. הדמיה דרך החלון

1. הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 4% (v/v) איזופלורן.
2. יש למרוח על העיניים חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהן להתייבש ולמנוע טראומה.
3. העבר את העכבר מתא האינדוקציה לשלב המיקרוסקופ. מניחים את העכבר במסכת האף להרדמה, ומורידים את ריכוז האיזופלורן לכ-1-1.5% לצורך הרדמה בתחזוקה לאורך כל הליך ההדמיה.
4. הניחו חיישן כרית לחץ מתחת לעכבר כדי לנטר את קצב הנשימה ולקבע את העכבר לבמה באמצעות סרט ניתוח רך.
5. הכנס מדחום רקטלי כדי לעקוב אחר טמפרטורת הגוף לאורך כל סשן ההדמיה.
6. הפעל את המשטח המחומם, תוך ניטור הדוק של העכבר כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף לא תעלה על 37 °C (76 °F).
7. השתמש בתוכנה כדי לנטר את קצב הנשימה של העכבר. הקצב האופטימלי הוא ~ נשימה אחת לשנייה. התאימו את ההרדמה לפי הצורך.
8. לפני כל סשן הדמיה, נקו את החלון מכל מדיום טבילה ופסולת של עדשה שיורית על ידי ניגוב עדין שלו עם צמר גפן טבול ב-70% אתנול (v/v).
9. בעת שימוש בעדשת טבילה במים, יש למרוח ג'ל אולטרסאונד על החלון, תוך הימנעות מבועות.
   הערה: ניתן להשתמש גם במים מזוקקים, אך הם עשויים לדרוש יישום מחדש במהלך ההדמיה.
10. כדי למצוא את העומק האופטימלי להדמיה, ראשית, אתרו את הרשת והניחו אותה בפוקוס.
11. קבע את עומק הדמיית הרקמה המשוער על-ידי הגדרת החלק התחתון של הרשת ל- 0. מידע זה נחוץ כדי לאתר את מישור z המתאים במפגשי ההדמיה הבאים.
12. כדי לזהות את אותו מיקום במשך מספר הפעלות הדמיה, השתמש בריבועים שעל הרשת כנקודת ייחוס. במהלך ההדמיה, שים לב לכיוון הרשת ולמיקום בתוך הרשת של כל שדה ראייה שצולם (לדוגמה^{, שורה 2} מלמעלה^{, ריבוע 4} משמאל).
13. במהלך הפעלות הדמיה עוקבות, השתמש ברשת כדי לנווט בחזרה לאזורי רשת ספציפיים - וכך לשדות הדמיה.
14. לאחר כל סשן הדמיה, יש להסיר את כל מדיום הטבילה והפסולת של העדשה השיורית על ידי ניגוב עדין של החלון באמצעות ספוגית צמר גפן טבולה ב-70% אתנול (v/v).

תוצאות

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-ורידית דרך חלונות הדמיה כדי לצפות, לעקוב ולכמת מגוון רחב של אירועים תאיים ומולקולריים ברזולוציה של תא יחיד במשך תקופה של שעות עד שבועות. תכונות אידיאליות לחלון הדמיה כוללות: א) השפעה מוגבלת על רווחתו של העכבר ועל הפיזיולוגיה של הרקמה; ב) עמידות; ג) פשטות ההכנסה; ו-ד) צי?...

Discussion

חלונות הדמיה תוך-ורידיים הם כלים חשובים להדמיה ישירה של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית כשהם מתפתחים לאורך זמן. ההליך החדשני המתואר ליציקה והכנסת חלונות הדמיה גמישים מסיליקון בעכברים מתגבר על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום (הפרשה, שבירה והפר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453