Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Özet

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Özet

İntravital mikroskopi (IVM), hücre hareketinin, bölünmesinin ve ölümünün tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilmesini sağlar. Cerrahi olarak yerleştirilmiş görüntüleme pencerelerinden IVM özellikle güçlüdür, çünkü aynı dokunun günler ila haftalar boyunca uzunlamasına gözlemlenmesine izin verir. Tipik görüntüleme pencereleri, farenin derisine dikilmiş biyouyumlu metal bir çerçevede cam bir kapak kaymasından oluşur. Bu pencereler farelerin serbest dolaşımına müdahale edebilir, güçlü bir enflamatuar yanıt ortaya çıkarabilir ve herhangi biri ötenazi gerektirebilecek kırık cam veya yırtık dikişler nedeniyle başarısız olabilir. Bu sorunları ele almak için, uzun süreli abdominal organ ve meme bezi görüntüleme pencereleri, daha önce kranial görüntüleme pencereleri için kullanılan optik olarak berrak bir silikon polimer olan ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) filminden geliştirilmiştir. Bu pencereler doğrudan dokulara yapıştırılabilir ve bu da yerleştirme için gereken süreyi azaltır. PDMS esnektir ve zaman içinde farelerde dayanıklılığına katkıda bulunur - 35 güne kadar test edilmiştir. Uzunlamasına görüntüleme, aynı doku bölgesinin ayrı seanslar sırasında görüntülenmesidir. Aynı bölgeyi lokalize etmek için pencerelerin içine paslanmaz çelik bir ızgara yerleştirildi ve dinamik süreçlerin (meme bezi evrimi gibi) aynı yerlerde, günler arayla görselleştirilmesine izin verildi. Bu silikon pencere aynı zamanda zamanla mikro-metastazlara dönüşen tek yayılmış kanser hücrelerinin izlenmesine de izin verdi. Bu çalışmada kullanılan silikon pencerelerin yerleştirilmesi metal çerçeveli cam pencerelere göre daha basittir ve görüntülenen dokuların sınırlı iltihaplanmasına neden olur. Ayrıca, gömülü ızgaralar, tekrarlanan görüntüleme oturumlarında aynı doku bölgesinin doğrudan izlenmesini sağlar.

Giriş

İntravital mikroskopi (IVM), anestezi uygulanan hayvanlarda dokuların görüntülenmesi, bozulmamış dokularda hücresel çözünürlükte fizyolojik ve patolojik olayların dinamikleri hakkında fikir verir. Bu tekniğin uygulamaları büyük ölçüde değişmektedir, ancak IVM, kanser hücrelerinin dokuları nasıl istila ettiğini ve metastaz yaptığını, çevredeki mikro çevre ile etkileşime girdiğini ve ilaçlara nasıl yanıt verdiğini aydınlatmaya yardımcı olmak için kanser biyolojisi alanında etkili olmuştur ^1,2,3. Ek olarak, IVM, ex vivo profilleme yaklaşımlarına (örneğin, akış sitometrisi) tamamlayıcı içgörüler sağlayarak bağışıklık tepkilerini yöneten karmaşık mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmenin anahtarı olmuştur. Örneğin, intravital görüntüleme deneyleri, hücre göçü ve hücre-hücre teması ile ilgili olarak bağışıklık fonksiyonları hakkında ayrıntıları ortaya çıkarmış ve yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak uzaysal zamansal dinamikleri ölçmek için bir platform sunmuştur 4,5,6,7. Bu süreçlerin birçoğu histolojik boyama yoluyla da incelenebilir, ancak yalnızca IVM dinamik değişikliklerin izlenmesine izin verir. Aslında, histolojik bir kesit belirli bir zamanda dokunun anlık görüntüsünü sunarken, intravital görüntüleme zaman içinde aynı doku içindeki hücreler arası ve hücre altı olayları izleyebilir. Özellikle, floresan etiketlemesindeki ilerleme ve moleküler muhabirlerin gelişimi, moleküler olayların proliferasyon, ölüm, hareketlilik ve diğer hücrelerle veya hücre dışı matriks ile etkileşim gibi hücresel davranışlarla ilişkilendirilmesine izin vermiştir. Çoğu IVM tekniği, ışık saçılması nedeniyle daha derin dokuların görüntülenmesini zorlaştıran floresan mikroskopiye dayanmaktadır. Bu nedenle, ilgilenilen dokunun sıklıkla invaziv ve terminal bir prosedürle cerrahi olarak maruz bırakılması gerekir. Böylece, organ bölgesine bağlı olarak, doku birkaç ila 40 saat⁸ arasında değişen bir süre boyunca sürekli olarak görüntülenebilir. Alternatif olarak, kalıcı bir görüntüleme penceresinin cerrahi olarak yerleştirilmesi, aynı dokunun^günler ila haftalar ^7,9 arasında sırayla görüntülenmesine izin verir.

Yeni görüntüleme pencerelerinin geliştirilmesi, intravital görüntüleme yaklaşımlarını daha da geliştirmek için teknolojik bir ihtiyaç olarak vurgulanmıştır¹⁰. Prototipik intravital görüntüleme penceresi, dikişlerle cilde sabitlenmiş cam bir örtü içeren metal bir halkadır¹¹. Serbest dolaşıma müdahale, eksüda birikimi ve cam kapak kaymasının zarar görmesi, bu tür pencerelerin kullanılmasında görülen yaygın sorunlardır. Dahası, prototipik pencere özel üretim gerektirir ve cerrahi prosedür kapsamlı bir eğitim gerektirebilir. Bu sorunları ele almak için, daha önce beyin^12'de uzun süreli görüntüleme için kraniyal pencerelerde kullanılan bir silikon polimer olan polidimetilsiloksan (PDMS), abdominal organ ve meme bezi görüntülemesinde kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Burada, PDMS tabanlı silikon pencereler oluşturmak için, aynı doku bölgelerinin tekrarlanan görüntülenmesi için işaretler sağlamak üzere pencerenin paslanmaz çelik bir ızgaranın etrafına nasıl döküleceği de dahil olmak üzere ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır. Ayrıca, pencerenin karın organlarının veya meme bezinin üzerine yerleştirilmesi için basit, dikişsiz bir cerrahi prosedür tanımlanmıştır. Bu yeni yaklaşım, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir ve uzunlamasına intravital görüntülemenin erişilebilirliğini artırır.

Protokol

Açıklanan tüm prosedürler Cold Spring Harbor Laboratuvarı Cerrahi Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Cold Spring Harbor Laboratuvarı'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Silikon pencerenin dökümü

1. Baz elastomeri ve kürleme maddesini 10:1 (v/v) oranında karıştırarak silikon polimeri (PDMS) hazırlayın.
2. Steril, pürüzsüz bir yüzeye az miktarda PDMS koyarak bir pencere açın ve hacim-alan oranını istenen kalınlığa ayarlayın.
   NOT: 24 kuyu plakalı kapağın kapağındaki 22 mm çaplı bir daire için 200 mg polimer çözeltisinin kullanılması, pencere sağlamlığı ile optik netlik arasında iyi bir uzlaşma sağlar.
3. İsteğe bağlı: Aynı doku bölgelerinin tekrar tekrar görüntülenmesi için işaretler sağlamak amacıyla, PDMS istenen döküm yüzeyine geldikten sonra paslanmaz çelik bir ızgarayı silikonun içine hafifçe bastırın.
4. Hava kabarcıklarını gidermek için, kaplanmış yüzeyi polimerin gazını gidermek üzere 45 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
5. Silikon pencereleri 80 °C'de bir fırında 45 dakika kürleyin.
6. Polimeri kalıbın kenarlarında puanlayın ve kürlenmiş pencereleri forseps ile döküm için kullanılan yüzeyden yavaşça soyun.
7. Ameliyattan önce, pencereleri otoklavlama ile sterilize edin.

2. Fareyi silikon pencerenin yerleştirilmesi için hazırlama

1. Fareyi bir indüksiyon odasında %4 (v/v) izofluran kullanarak anestezi altına alın. Fareyi ameliyat masasındaki bir ısıtma pedine getirin, fareyi anestezi burun maskesine yerleştirin ve ameliyat boyunca bakım için izofluran konsantrasyonunu% 2'ye düşürün.
2. Arka bacakların ayak parmaklarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Fare devre dışı kalana ve ayak parmağını sıkıştırma refleksi tepkisi göstermeyene kadar devam etmeyin.
3. Kurumasını önlemek ve travmayı önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
4. Preemptif analjezi (buprenorfin 0.05 mg/kg) deri altından uygulanır.
5. Ameliyat bölgesini tıraş edin ve bir epilasyon kremi ile tüyleri tamamen çıkarın.
6. Cerrahi bölge enfeksiyonunu önlemek için povidon-iyot çözeltisi (% 10 v / v) ve etanol (% 70 v / v) art arda 3x uygulayın.

3. Karaciğerde görüntüleme için bir ventral pencere yerleştirmek; diğer karın organları için uyarlanabilir (Şekil 1)

1. Fareyi sırtüstü konuma getirin.
2. Steril makas ve forseps kullanarak ksifoid işlemden 3 mm aşağıya doğru 10 mm'lik bir kesi yapın.
3. Orta hat boyunca cildin 1–1,5^cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
4. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
5. İsteğe bağlı: Karaciğerin daha büyük bir bölümünü görselleştirmek için, karaciğeri diyaframa bağlayan falsiform ligamenti ortaya çıkaran karaciğeri diyaframdan aşağı itmek için steril salin ile nemlendirilmiş steril pamuklu çubuklar kullanın. İnferior vena kavayı kesmemeye özen göstererek bağı kesin.
6. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki karaciğer yüzeyine az miktarda uygulayın. Bu yapıştırıcı, görüntüleme için orta alanı sağlam bırakan dairesel bir sızdırmazlık oluşturur.
   DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez. Yapıştırıcıyı uygulamadan önce dokuyu kurutmak gerekli değildir.
   NOT: Bu prosedür için herhangi bir siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı başarıyla kullanılabilir. Cerrahi yapıştırıcı sterilite sağlar. Terminal prosedürleri için, çok amaçlı süper yapıştırıcılar iyi sonuçlar verir.
7. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) karaciğere sıkıca tutun.
8. Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
9. Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
10. Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
    NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, karaciğer dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
11. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
    DİKKAT: İşlem steril cerrahi teknikler kullanılarak gerçekleştirilirse ve pencere yerleştirilmeden önce sterilize edilirse, yaranın cerrahi yapıştırıcı ile kapatılması enfeksiyonları önlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, cerrahi yerleştirme sırasında uygun aseptik tekniklerin izlenmemesi veya kusurlu kapanma, açık veya subklinik enfeksiyona ve dokudan kurumaya neden olabilir.

4. Karaciğerde görüntüleme için yanal bir pencere yerleştirilmesi; portal vendeki kanser hücrelerinin eşzamanlı enjeksiyonu ile uyumlu (Şekil 2)

1. Fareyi sol lateral decubitus pozisyonuna yerleştirin
2. Steril makas ve forseps kullanarak kostal kemerin 3 mm altında sağ kanatta 10 mm'lik bir kesi yapın.
3. Cildin 1^cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
4. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
5. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki karaciğer yüzeyine az miktarda uygulayın.
   DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
   NOT: Bu prosedür için herhangi bir siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı başarıyla kullanılabilir. Cerrahi yapıştırıcı sterilite sağlar. Terminal prosedürleri için, çok amaçlı süper yapıştırıcılar iyi sonuçlar verir.
6. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) karaciğere sıkıca tutun.
7. Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
8. Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
9. Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
   NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, karaciğer dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
10. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.
11. Portal ven enjeksiyonu gerekiyorsa:
    1. Fareyi sırtüstü konuma getirin.
    2. Derideki ksifoid süreçten başlayarak 10 mm'lik bir kesi yapın.
    3. İkinci bir çift steril makas ve forseps kullanarak, peritonda 10 mm'lik bir kesi yapın.
    4. İki pamuklu çubuğu steril salin içine batırın.
    5. Bağırsağı steril salin ile nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine nazikçe çekmek için pamuklu çubukları kullanın, oryantasyonu bükmemeye veya başka bir şekilde üzmemeye dikkat edin.
    6. Portal ven karnın sağ tarafında görünene kadar bağırsağı karın boşluğundan çıkarmaya devam edin.
    7. Portal venin karaciğere giriş noktasına 31–33 G iğne 5–7 mm'lik bir kaudal yerleştirin, kan damarı içinde ilerlediğinizden emin olun, içinden geçmediğinizden emin olun.
    8. Kanser hücrelerini yavaşça enjekte edin (100 μL steril PBS'de yeniden askıya alınır).
       NOT: Bu deney için amurin pankreas kanseri hücre hattı (örneğin, KPC-BL / 6-1199) tam DMEM ortamında kültürlenebilir ve 100 μL steril PBS'ye enjekte edilen 1 x 10⁵ hücre.
    9. Kanamayı önlemek için, iğneyi çektikten hemen sonra, enjeksiyon bölgesine 1-2 dakika boyunca küçük bir cerrahi sünger parçası ile hafif bir baskı uygulayın.
    10. Basınç serbest bırakıldıktan sonra, hemostazı sağlamak için bölgeyi 1-2 dakika izleyin.
    11. Nemlendirilmiş pamuklu çubuklar kullanarak, organın fizyolojik yönelimini takiben bağırsağı karın boşluğuna geri döndürün.
    12. Steril forseps kullanarak, pencereyi periton altına, farenin karın boşluğunun sol tarafına yerleştirin.
    13. 4-0 ipek dikişle sütür ve 7 mm paslanmaz çelik sargı klipsleri ile orta hat kesisini zımbalayın.
    14. Fareyi sol lateral decubitus konumuna getirin
    15. Steril makas ve forseps kullanarak kostal kemerin 3 mm altında sağ kanatta deriden 10 mm'lik bir kesi yapın.
    16. Kesinin etrafındaki cildin 1^cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
    17. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
    18. 4.8-4.10 adımlarında açıklandığı gibi, pencereyi yerine yapıştırmadan önce karaciğerin üzerine çekin.

5. Pankreasta görüntüleme için pencerenin yerleştirilmesi (Şekil 3)

1. Fareyi sağ lateral decubitus pozisyonuna getirin.
2. Sol kanatta kostal kemerin 3 mm altında steril makas ve forseps kullanarak 10 mm'lik bir kesi yapın.
3. Kesinin etrafındaki cildin 1^cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
4. Periton bölümünün cilt bölümünden biraz daha küçük bir bölümünü çıkarmak için ikinci bir çift steril makas ve forseps kullanın.
5. Steril salin ile ıslatılmış steril pamuklu çubuklar kullanarak, pankreası görselleştirmek için dalağı yavaşça çekin. Kesi boyunca daha fazla yüzey alanı görünür hale getirmek için pankreası nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla yeniden konumlandırmaya devam edin.
   NOT: Bu noktada, pankreas kanseri hücreleri, deneysel tasarımın bir parçasıysa, pankreasa ortopik olarak enjekte edilebilir.
6. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki pankreasın yüzeyine az miktarda uygulayın.
   DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
7. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) pankreasa sıkıca tutun.
8. Pencerenin kenarlarını periton altına katlayın.
9. Bir şırınga ile, şimdi periton altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Pencereye sabitlemek için forsepslerle periton üzerinde aşağı doğru itin.
10. Benzer şekilde, peritona sabitlemek için forseps ile cilde bastırmadan önce periton üzerine az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun.
    NOT: Doğru şekilde gerçekleştirilirse, pankreas dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
11. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.

6. Meme bezinde görüntüleme için pencerenin yerleştirilmesi (Şekil 4)

1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
2. Steril makas ve forseps kullanarak kasık meme uçlarından birine medial 10 mm'lik bir kesi yapın.
3. Meme bezinin üzerindeki cildin 0,5^cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
4. Yapışmayı bozmak için makası iki yüzey arasına yayarak meme bezini ciltten dikkatlice ayırmak için ikinci bir çift steril makas kullanın.
   NOT: Kasık meme bezi alanının görüntülenmesini kolaylaştırmak için, memeli bezin üzerindeki cildin bir kısmını diseke etmeye dikkat edin, ancak arka bacaktan daha üstündür, böylece pencere farenin hareketliliğini sınırlamaz.
5. Cerrahi yapıştırıcıyı 31 G'lık bir şırınga ile çekin, görüntülenecek alanın kenarları etrafındaki meme bezinin yüzeyine az miktarda uygulayın.
   DİKKAT: Yapıştırıcıyı, görüntüleme alanının etrafında dairesel bir desen oluşturan küçük damlacıklarla sınırlandırın. Yapıştırıcı ile hemen temas eden doku görüntülenemez.
6. Forseps kullanarak pencereyi konumlandırın ve yapıştırıcı kuruyana kadar (~ 2 dakika) meme bezine sıkıca tutun.
   NOT: Doğru yapıldığında meme bezi dokusunun dairesel bir alanı artık pencereden görülebilmelidir.
7. Pencerenin kenarlarını cildin altına katlayın.
8. Bir şırınga ile, şimdi cildin altında bulunan pencerenin kenarlarına az miktarda cerrahi yapıştırıcı koyun. Cildi pencereye sabitlemek için forseps ile cildi aşağı doğru itin.
9. Cildin pencerenin üzerinde tekrar büyümesini önlemeye yardımcı olacak bir jant oluşturmak için pencerenin kenarlarına yapıştırıcı uygulayın.

7. Ameliyat sonrası iyileşme

1. Fareyi, geniş yuvalama malzemesine sahip temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin ve kafesin bir kısmının bir ısıtma yastığı üzerinde durduğundan emin olun.
2. Fareyi bilinçli ve hareketli olana kadar sürekli izleyin.
3. Gerekirse, önleyici dozdan 12 saat sonra ek bir analjezik dozu sağlayın.
   NOT: Ek analjezi genellikle gereksizdir, ancak fare sıkıntı belirtileri gösteriyorsa (kambur sırt, dağınık kürk veya yiyeceğe olan ilginin kaybolması gibi) bir veterinere danışın. Fareyi ameliyattan sonraki ilk 3 gün boyunca enfeksiyon belirtileri veya diğer olumsuz etkiler açısından günlük olarak izleyin. Farelerin% 2'sinden azı, tipik olarak pencerenin kısmen ayrılması nedeniyle veteriner dikkati veya ötenazi gerektirir. Ventral karaciğer görüntüleme pencerelerine sahip erkek fareler için, fareler arasındaki kavganın pencerelerin ayrılmasıyla sonuçlanabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu, fareleri ayrı ayrı barındırarak önlenir.

8. Pencereden görüntüleme

1. Fareyi bir indüksiyon odasında %4 (v/v) izofluran kullanarak anestezi altına alın.
2. Kurumasını önlemek ve travmayı önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
3. Fareyi indüksiyon odasından mikroskop aşamasına getirin. Fareyi anestezi burun maskesine yerleştirin ve görüntüleme prosedürü boyunca idame anestezisi için izofluran konsantrasyonunu yaklaşık% 1-1.5'e düşürün.
4. Nefes alma hızını izlemek için farenin altına bir basınç yastığı sensörü yerleştirin ve yumuşak cerrahi bant kullanarak fareyi sahneye sabitleyin.
5. Görüntüleme oturumu boyunca vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre takın.
6. Isıtılmış pedi açın, vücut sıcaklığının 37 ° C'yi geçmemesini sağlamak için fareyi yakından izleyin.
7. Farenin nefes hızını izlemek için yazılımı kullanın. En uygun hız ~ 1 nefes / saniyedir. Anesteziyi gerektiği gibi ayarlayın.
8. Her görüntüleme seansından önce, pencereyi herhangi bir artık lens daldırma ortamından ve kalıntılarından, %70 etanol (v/v) içine batırılmış bir pamuklu çubukla nazikçe silerek temizleyin.
9. Bir suya daldırma lensi kullanırken, kabarcıklardan kaçınarak pencereye ultrason jeli uygulayın.
   NOT: Damıtılmış su da kullanılabilir, ancak görüntüleme sırasında yeniden uygulanması gerekebilir.
10. Görüntüleme için en uygun derinliği bulmak için, önce ızgarayı bulun ve odağa yerleştirin.
11. Izgaranın alt kısmını 0 olarak ayarlayarak yaklaşık doku görüntüleme derinliğini belirleyin. Bu bilgi, sonraki görüntüleme oturumlarında karşılık gelen z düzlemini bulmak için gereklidir.
12. Birden fazla görüntüleme oturumunda aynı konumu tanımlamak için, ızgaradaki kareleri referans noktası olarak kullanın. Görüntüleme sırasında, görüntülenen her görüş alanının ızgarası içindeki ızgaranın yönünü ve konumunu not edin (örneğin, üstten 2. sıra, soldan 4^. kare).
13. Ardışık görüntüleme oturumları sırasında, belirli ızgara alanlarına ve dolayısıyla görüntüleme alanlarına geri dönmek için ızgarayı kullanın.
14. Her görüntüleme seansını takiben, pencereyi %70 etanol (v/v) içine batırılmış pamuklu çubukla nazikçe silerek artık lens daldırma ortamını ve kalıntılarını temizleyin.

Sonuçlar

Görüntüleme pencereleri aracılığıyla intravital görüntüleme, saatler ila haftalar boyunca tek hücre çözünürlüğünde çok çeşitli hücresel ve moleküler olayları gözlemlemek, izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Bir görüntüleme penceresi için ideal özellikler şunlardır: a) farenin refahı ve dokunun fizyolojisi üzerinde sınırlı etki; b) dayanıklılık; c) yerleştirme kolaylığı; ve d) aynı bölgenin tekrar tekrar görüntülenmesi için açık yer işaretleri. Sonuç, kolayca ü...

Tartışmalar

İntravital görüntüleme pencereleri, fizyolojik ve patolojik süreçleri zaman içinde ortaya çıktıklarında hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirmek için önemli araçlardır. Farelerde esnek, silikon görüntüleme pencerelerinin dökümü ve yerleştirilmesi için açıklanan yeni prosedür, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle (eksüda, kırılma ve normal hareketliliğe müdahale) ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir, fare için ek güvenlik sağlar ve bu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453