JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен подход для долгосрочной прижизненной визуализации с использованием оптически чистых силиконовых окон, которые могут быть приклеены непосредственно к интересующей ткани / органу и коже. Эти окна дешевле и универсальнее, чем другие, используемые в настоящее время в полевых условиях, а хирургическое введение вызывает ограниченное воспаление и дистресс у животных.

Аннотация

Прижизненная микроскопия (IVM) позволяет визуализировать движение, деление и гибель клеток при разрешении одной клетки. IVM через хирургически вставленные окна визуализации особенно мощный, потому что он позволяет продольное наблюдение за одной и той же тканью в течение нескольких дней до недель. Типичные окна для визуализации состоят из стеклянной крышки в биосовместимой металлической раме, пришитой к коже мыши. Эти окна могут мешать свободному движению мышей, вызывать сильную воспалительную реакцию и выходить из строя из-за разбитого стекла или разорванных швов, любой из которых может потребовать эвтаназии. Для решения этих проблем были разработаны окна для долгосрочной визуализации органов брюшной полости и молочных желез из тонкой пленки полидиметилсилоксана (PDMS), оптически прозрачного силиконового полимера, ранее использовавшегося для краниальных окон визуализации. Эти окна можно приклеивать непосредственно к тканям, сокращая время, необходимое для вставки. PDMS является гибким, что способствует его долговечности на мышах с течением времени — было протестировано до 35 дней. Продольная визуализация - это визуализация одной и той же области ткани во время отдельных сеансов. Сетка из нержавеющей стали была встроена в окна, чтобы локализовать одну и ту же область, что позволило визуализировать динамические процессы (например, инволюцию молочной железы) в одних и тех же местах, с интервалом в несколько дней. Это силиконовое окно также позволило контролировать одиночные диссеминированные раковые клетки, развивающиеся в микрометастазы с течением времени. Силиконовые окна, используемые в этом исследовании, проще вставить, чем стеклянные окна с металлическим каркасом, и вызывают ограниченное воспаление изображенных тканей. Кроме того, встроенные сетки позволяют легко отслеживать одну и ту же область ткани в повторных сеансах визуализации.

Введение

Прижизненная микроскопия (IVM), визуализация тканей у анестезируемых животных, дает представление о динамике физиологических и патологических событий при клеточном разрешении в интактных тканях. Применение этого метода широко варьируется, но IVM сыграл важную роль в области биологии рака, чтобы помочь выяснить, как раковые клетки вторгаются в ткани и метастазируют, взаимодействуют с окружающей микросредой и реагируют на лекарства 1,2,3. Кроме того, IVM был ключом к углублению понимания сложных механизмов, регулирующих иммунные реакции, предоставляя понимание, дополняющее подходы профилирования ex vivo (например, проточная цитометрия). Например, эксперименты с прижизненной визуализацией выявили подробности об иммунных функциях, поскольку они связаны с миграцией клеток и контактом между клетками, и предложили платформу для количественной оценки пространственно-временной динамики в ответ на травму или инфекцию 4,5,6,7. Многие из этих процессов также могут быть изучены с помощью гистологического окрашивания, но только IVM позволяет отслеживать динамические изменения. Фактически, в то время как гистологический срез предлагает снимок ткани в данный момент времени, прижизненная визуализация может отслеживать межклеточные и субклеточные события в одной и той же ткани с течением времени. В частности, прогресс в флуоресцентной маркировке и разработка молекулярных репортеров позволили соотнести молекулярные события с клеточным поведением, таким как пролиферация, смерть, подвижность и взаимодействие с другими клетками или внеклеточным матриксом. Большинство методов IVM основаны на флуоресцентной микроскопии, которая из-за рассеяния света затрудняет визуализацию более глубоких тканей. Поэтому ткань, представляющая интерес, часто нуждается в хирургическом воздействии с помощью часто инвазивной и терминальной процедуры. Таким образом, в зависимости от участка органа, ткань может быть изображена непрерывно в течение периода, варьирующегося от нескольких до 40 ч8. В качестве альтернативы, хирургическое введение окна постоянной визуализации позволяет последовательно визуализировать одну и ту же ткань в течение периода от нескольких дней до недель 7,9.

Разработка новых окон визуализации была подчеркнута как технологическая необходимость дальнейшего совершенствования подходов к прижизненной визуализации10. Прототипное окно прижизненной визуализации представляет собой металлическое кольцо, содержащее стеклянную крышку, закрепленную на коже швами11. Вмешательство в свободное движение, накопление экссудата и повреждение стеклянной крышки являются общими проблемами, наблюдаемыми при использовании таких окон. Кроме того, прототип окна требует специализированного производства, а хирургическая процедура может потребовать обширной подготовки. Для решения этих проблем полидиметилсилоксан (PDMS), силиконовый полимер, который ранее использовался в черепных окнах для долгосрочной визуализации в мозге12, был адаптирован для использования в визуализации органов брюшной полости и молочных желез. Здесь представлен подробный метод создания силиконовых окон на основе PDMS, в том числе о том, как отлить окно вокруг сетки из нержавеющей стали, чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани. Кроме того, описана простая, без швов хирургическая процедура введения окна над органами брюшной полости или молочной железой. Этот новый подход преодолевает некоторые из наиболее распространенных проблем с используемыми в настоящее время окнами визуализации и повышает доступность продольной прижизненной визуализации.

протокол

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с Лабораторным хирургическим руководством Колд-Спринг-Харбор и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в лаборатории Колд-Спринг-Харбор.

1. Литье силиконового окна

  1. Получают силиконовый полимер (PDMS), смешивая базовый эластомер и отверждающий агент в соотношении 10:1 (v/v).
  2. Отлить окно, нанеся небольшое количество PDMS на стерильную, гладкую поверхность и отрегулировать отношение объема к площади до желаемой толщины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 200 мг раствора полимера для круга диаметром 22 мм на крышке крышки из 24 пластин приводит к хорошему компромиссу между прочностью окна и оптической прозрачностью.
  3. Дополнительно: Чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани, слегка вдавите сетку из нержавеющей стали в силикон после того, как PDMS окажется на желаемой поверхности литья.
  4. Чтобы удалить пузырьки воздуха, поместите покрытую поверхность в вакуумный осушитель на 45 мин для дегазации полимера.
  5. Отверните силиконовые окна в духовке при 80 °C в течение 45 мин.
  6. Нанесите полимер по краям формы и аккуратно отклейте отвержденные окна с поверхности, используемой для литья щипцами.
  7. Перед операцией стерилизуйте окна автоклавированием.

2. Подготовка мыши к вставке силиконового окна

  1. Обезболить мышь в индукционной камере с использованием 4% (v/v) изофлурана. Переместите мышь на согревающую прокладку на хирургическом столе, поместите мышь в маску для анестезии носа и понизьте концентрацию изофлурана до 2% для поддержания на протяжении всей операции.
  2. Проверьте глубину анестезии, защемив пальцы задних конечностей. Не продолжайте, пока мышь не станет неактивной и не покажет рефлекторную реакцию пальца ноги.
  3. Нанесите офтальмологическую смазку на глаза, чтобы они не высохли и предотвратили травмы.
  4. Вводят упреждающую анальгезию (бупренорфин 0,05 мг/кг) подкожно.
  5. Побрейте место операции и полностью удалите волосы с помощью крема для удаления волос.
  6. Применяют повидон-йодный раствор (10% v/v) и этанол (70% v/v) последовательно 3x для предотвращения инфекции хирургического участка.

3. Вставка вентрального окна для визуализации в печени; адаптируется для других органов брюшной полости (Рисунок 1)

  1. Поместите мышь в положение лежа на спине.
  2. Сделайте разрез 10 мм, начиная с 3 мм вниз от мечевидного процесса, используя стерильные ножницы и щипцы.
  3. Удалите участок кожи размером 1–1,5см2 вдоль средней линии.
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
  5. Необязательно: Чтобы визуализировать большую часть печени, используйте стерильные ватные палочки, смоченные стерильным физиологическим раствором, чтобы вытолкнуть печень вниз от диафрагмы, выявляя фальциформную связку, соединяющую печень с диафрагмой. Разорвите связку, следя за тем, чтобы не перерезать нижнюю полую вену.
  6. Выведите хирургический клей шприцем 31 Г, нанесите небольшое его количество на поверхность печени по краям области, подлежащей изображению. Этот клей создает круглое уплотнение, оставляя центральную область нетронутой для визуализации.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена. Нет необходимости сушить ткань перед нанесением клея.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые клеи на основе цианоакрилата могут быть успешно использованы для этой процедуры. Хирургический клей обеспечивает стерильность. Для терминальных процедур универсальные суперклеи дают хорошие результаты.
  7. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к печени, пока клей не высохнет (~2 мин).
  8. Сложите края окна под брюшину.
  9. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной. Надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
  10. Аналогичным образом, нанесите небольшое количество хирургического клея на брюшину, прежде чем надавить на кожу щипцами, чтобы закрепить ее на брюшине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении круглая область печеночной ткани теперь должна быть видна через окно.
  11. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.
    ВНИМАНИЕ: Если процедура проводится с использованием стерильных хирургических методов и окно стерилизуется перед введением, достаточно герметизации раны хирургическим клеем, чтобы избежать инфекций. Однако несоблюдение надлежащих асептических методов во время хирургического введения или несовершенное закрытие может привести к явной или субклинической инфекции и высыханию ткани.

4. Вставка бокового окна для визуализации в печени; совместима с одновременной инъекцией раковых клеток в воротную вену (рисунок 2)

  1. Поместите мышь в левое боковое положение пролежней
  2. Сделайте 10 мм разрез на правом фланге на 3 мм ниже реберной дуги с помощью стерильных ножниц и щипцов.
  3. Удалите участок кожиразмером 1 см2 .
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
  5. Выведите хирургический клей шприцем 31 Г, нанесите небольшое его количество на поверхность печени по краям области, подлежащей изображению.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые клеи на основе цианоакрилата могут быть успешно использованы для этой процедуры. Хирургический клей обеспечивает стерильность. Для терминальных процедур универсальные суперклеи дают хорошие результаты.
  6. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к печени, пока клей не высохнет (~2 мин).
  7. Сложите края окна под брюшину.
  8. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной. Надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
  9. Аналогичным образом, нанесите небольшое количество хирургического клея на брюшину, прежде чем надавить на кожу щипцами, чтобы закрепить ее на брюшине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении круглая область печеночной ткани теперь должна быть видна через окно.
  10. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.
  11. Если требуется инъекция в воротную вену:
    1. Поместите мышь в положение лежа на спине.
    2. Сделайте разрез 10 мм, начиная с мечевидного отростка в коже.
    3. Используя вторую пару стерильных ножниц и щипцов, сделайте 10-миллиметровый разрез в брюшине.
    4. Обмакните два ватных тампона в стерильный физиологический раствор.
    5. Используйте ватные тампоны, чтобы осторожно вытянуть кишечник на стерильную марлю, смоченную стерильным физиологическим раствором, заботясь о том, чтобы не скручивать или иным образом не нарушать ориентацию.
    6. Продолжайте смещать кишечник из брюшной полости до тех пор, пока портальная вена не будет видна с правой стороны живота.
    7. Вставьте иглу 31–33 G 5–7 мм каудальной в точку входа воротной вены в печень, убедившись, что она протекает внутри кровеносного сосуда, а не через него.
    8. Медленно вводят раковые клетки (повторно суспендируют в 100 мкл стерильного PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента амуриновую линию раковых раковых клеток поджелудочной железы (например, KPC-BL/6-1199) можно культивировать в полной среде DMEM и 1 х 105 клеток, вводимых в 100 мкл стерильных PBS.
    9. Чтобы предотвратить кровотечение, сразу после извлечения иглы нанесите мягкое давление на место инъекции небольшим кусочком хирургической губки в течение 1–2 мин.
    10. После того, как давление будет снято, контролируйте участок в течение 1–2 мин, чтобы обеспечить гемостаз.
    11. Используя смоченные ватные тампоны, верните кишечник в брюшную полость, следуя физиологической ориентации органа.
    12. Используя стерильные щипцы, вставьте окно сразу под брюшину, с левой стороны брюшной полости мыши.
    13. Зашить 4-0 шелковых швов и скрепить разрез средней линии 7 мм зажимами из нержавеющей стали.
    14. Перемещение мыши в левое боковое пролежнее положение
    15. Сделайте 10 мм разрез на правом фланге 3 мм под реберной дугой через кожу с помощью стерильных ножниц и щипцов.
    16. Удалите участок кожи размером 1см2 вокруг разреза.
    17. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
    18. Потяните окно на место над печенью, прежде чем приклеить его на место, как описано в шагах 4.8–4.10.

5. Вставка окна для визуализации в поджелудочной железе (рисунок 3)

  1. Поместите мышь в правое боковое положение пролежней.
  2. Сделайте 10 мм разрез на левом фланге на 3 мм ниже реберной дуги с помощью стерильных ножниц и щипцов.
  3. Удалите участок кожи размером 1см2 вокруг разреза.
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи.
  5. Используя стерильные ватные тампоны, пропитанные стерильным физиологическим раствором, осторожно потяните на селезенку, чтобы визуализировать поджелудочную железу. Приступайте к перемещению поджелудочной железы с помощью смоченных ватных тампонов, чтобы сделать большую площадь поверхности видимой через разрез.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент раковые клетки поджелудочной железы могут быть ортотопически введены в поджелудочную железу, если это является частью экспериментального проекта.
  6. Извлеките хирургический клей шприцем 31 G, нанесите небольшое его количество на поверхность поджелудочной железы по краям области, подлежащей изображению.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена.
  7. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к поджелудочной железе, пока клей не высохнет (~2 мин).
  8. Сложите края окна под брюшину.
  9. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной. Надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
  10. Аналогичным образом, нанесите небольшое количество хирургического клея на брюшину, прежде чем надавить на кожу щипцами, чтобы закрепить ее на брюшине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении круглая область ткани поджелудочной железы теперь должна быть видна через окно.
  11. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.

6. Вставка окна для визуализации в молочной железе (рисунок 4)

  1. Поместите мышь в положение лежа на спине.
  2. Сделайте 10-миллиметровый разрез медиальным к одному из паховых сосков с помощью стерильных ножниц и щипцов.
  3. Удалите 0,5см2 участка кожи над молочной железой.
  4. Используйте вторую пару стерильных ножниц, чтобы тщательно отделить молочную железу от кожи, распределив ножницы между двумя поверхностями, чтобы нарушить сцепление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить визуализацию области паховой молочной железы, будьте осторожны, чтобы рассечь часть кожи над молочной железой, но выше задней ноги, чтобы окно не ограничивало подвижность мыши.
  5. Извлеките хирургический клей шприцем 31 G, нанесите небольшое его количество на поверхность молочной железы по краям области, подлежащей изображению.
    ВНИМАНИЕ: Ограничьте клей небольшими каплями, образующими круговой рисунок вокруг области визуализации. Ткань, непосредственно контактирующая с клеем, не может быть изображена.
  6. Расположите окно с помощью щипцов и крепко прижмите его к молочной железе, пока клей не высохнет (~2 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Круглая область ткани молочной железы теперь должна быть видна через окно, если выполнена правильно.
  7. Сложите края окна под кожу.
  8. Шприцем нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под кожей. Надавите на кожу щипцами, чтобы закрепить кожу к окну.
  9. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который поможет предотвратить рост кожи над окном.

7. Послеоперационное восстановление

  1. Поместите мышь в чистую клетку для восстановления с достаточным количеством гнездового материала, убедившись, что часть клетки покоится на грелке.
  2. Непрерывно контролируйте мышь, пока она не станет сознательной и подвижной.
  3. При необходимости назначают дополнительную дозу анальгетика через 12 ч после введения упреждающей дозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная анальгезия, как правило, не нужна, но проконсультируйтесь с ветеринаром, если мышь проявляет признаки дистресса (например, сгорбленную спину, неопрятный мех или потерянный интерес к пище). Ежедневно контролируйте мышь в течение первых 3 дней после операции на наличие признаков инфекции или других побочных эффектов. Менее 2% мышей нуждаются в ветеринарной помощи или эвтаназии, как правило, из-за частичного отслоения окна. Важно отметить, что для самцов мышей с вентральными окнами визуализации печени борьба между мышами может привести к отслоению окон. Этого можно избежать, разместив мышей отдельно.

8. Визуализация через окно

  1. Обезболить мышь в индукционной камере с использованием 4% (v/v) изофлурана.
  2. Нанесите офтальмологическую смазку на глаза, чтобы они не высохли и предотвратили травмы.
  3. Переместите мышь из индукционной камеры на ступень микроскопа. Поместите мышь в анестезирующую маску для носа и уменьшите концентрацию изофлурана примерно до 1-1,5% для поддерживающей анестезии на протяжении всей процедуры визуализации.
  4. Поместите датчик нажимной панели под мышью, чтобы контролировать частоту дыхания и зафиксировать мышь на сцене с помощью мягкой хирургической ленты.
  5. Вставьте ректальный термометр для мониторинга температуры тела на протяжении всего сеанса визуализации.
  6. Включите нагретую подушку, внимательно следя за мышью, чтобы температура тела не превышала 37 °C.
  7. Используйте программное обеспечение для мониторинга частоты дыхания мыши. Оптимальная скорость составляет ~1 вдох в секунду. Отрегулируйте анестезию по мере необходимости.
  8. Перед каждым сеансом визуализации очищайте окно от любой остаточной среды погружения в линзы и мусора, аккуратно протирая его ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле (v/v).
  9. При использовании погружной в воду линзы нанесите ультразвуковой гель на окно, избегая пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дистиллированная вода также может быть использована, но может потребовать повторного применения во время визуализации.
  10. Чтобы найти оптимальную глубину для визуализации, сначала найдите сетку и поместите ее в фокус.
  11. Определите приблизительную глубину визуализации ткани, установив нижнюю часть сетки на 0. Эта информация необходима для определения местоположения соответствующей плоскости z в последующих сеансах визуализации.
  12. Чтобы определить одно и то же местоположение в течение нескольких сеансов визуализации, используйте квадраты на сетке в качестве контрольной точки. Во время визуализации обратите внимание на ориентацию сетки и расположение в сетке каждого изображенного поля зрения (например,2-я строка сверху,4-й квадрат слева).
  13. Во время последовательных сеансов визуализации используйте сетку для перехода обратно к определенным областям сетки и, таким образом, к полям визуализации.
  14. После каждого сеанса визуализации удаляйте любую остаточную среду погружения в линзы и мусор, осторожно протирая окно ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле (v/v).

Результаты

Прижизненная визуализация через окна визуализации может использоваться для наблюдения, отслеживания и количественной оценки широкого спектра клеточных и молекулярных событий с одноклеточным разрешением в течение периода от часов до недель. К идеальным особенностям окна визуализац?...

Обсуждение

Окна прижизненной визуализации являются важными инструментами для непосредственной визуализации физиологических и патологических процессов с клеточным разрешением, поскольку они разворачиваются с течением времени. Новая процедура, описанная для литья и вставки гибких силиконовых ...

Раскрытие информации

М.Е. является членом исследовательского консультативного совета по бренсокатибу для Insmed, Inc.; член научно-консультативного совета компании Vividion Therapeutics, Inc.; консультант компании Protalix, Inc.; D.A.T. является соучредителем Mestag Therapeutics, входит в научно-консультативный совет и владеет акциями Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology и Cygnal Therapeutics. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Роба Эйферта за его помощь в разработке и оптимизации решеток из нержавеющей стали лазерной резки. Эта работа была поддержана Онкологическим центром CSHL (P30-CA045508) и средствами для M.E. от Национальных институтов здравоохранения (NIH) (1R01CA2374135 и 5P01CA013106-49); CSHL и Northwell Health; Фонд семьи Томпсон; Плавайте по Всей Америке; и грант Фонда Саймонса CSHL. M.S. был поддержан Национальным институтом общих медицинских наук Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) и Национальным институтом рака NIH под номером 1F30CA253993-01. L.M. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Джеймса С. Макдоннелла. J.M.A. является получателем стипендии Института исследований рака / Ирвингтонской постдокторской стипендии (CRI Award #3435). D.A.T. поддерживается Специализированной лабораторией по исследованию рака поджелудочной железы Фонда Люстгартена и Фондом семьи Томпсон. Мультфильмы создавались с Biorender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape3M70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP miceJackson Laboratory22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)Vector Laboratories SK-4200
Alcohol swabsBD 326895
Anesthesia systemMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) miceJackson Laboratory18549
C57BL/6J miceJackson Laboratory664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 AntibodyAbcamab125212
Curity gauze sponges Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) Abcamab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Abcamab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant ClearElectron Microscopy Sciences24236-10Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness Electron Microscopy Sciences72296-08
Ender-3 Pro 3D printerShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanketKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
Fiji imaging processing packagehttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)InvitrogenF8795
Gating system:BIOPAC Systems Inc.The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series DA100C
Dual Gating Sys small animalDTU200 
MP160 for Windows - Analysis systemMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V;015000 
Pressure Pad TSD110 
GelfoamPfizer9031508Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissorsFine Science Tools14090-11Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO AntibodyR&D SystemsAF3667
Hot bead sterilizerFine Science Tools18000-45Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurane (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFP micewww.mmrrc.org012039-MU
Micro dissecting forcepsRobozRS-5135Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forcepsRobozRS-51531 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsServohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probePerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
OxygenGeneral Welding Supply Corp.
Polylactic acid filamentHatchbox1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube ophthalmic ointmentDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clipsRoboz SurgicalRS-9255
Stainless steel gridFotofabOne grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture PlatesFisher ScientificFB012929Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope LaVision BioTecImaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR micro cover glassVWR48404-453

Ссылки

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  13. Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

179

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены