Продольная прижизненная визуализация через прозрачные силиконовые окна

Резюме

Здесь представлен подход для долгосрочной прижизненной визуализации с использованием оптически чистых силиконовых окон, которые могут быть приклеены непосредственно к интересующей ткани / органу и коже. Эти окна дешевле и универсальнее, чем другие, используемые в настоящее время в полевых условиях, а хирургическое введение вызывает ограниченное воспаление и дистресс у животных.

Аннотация

Прижизненная микроскопия (IVM) позволяет визуализировать движение, деление и гибель клеток при разрешении одной клетки. IVM через хирургически вставленные окна визуализации особенно мощный, потому что он позволяет продольное наблюдение за одной и той же тканью в течение нескольких дней до недель. Типичные окна для визуализации состоят из стеклянной крышки в биосовместимой металлической раме, пришитой к коже мыши. Эти окна могут мешать свободному движению мышей, вызывать сильную воспалительную реакцию и выходить из строя из-за разбитого стекла или разорванных швов, любой из которых может потребовать эвтаназии. Для решения этих проблем были разработаны окна для долгосрочной визуализации органов брюшной полости и молочных желез из тонкой пленки полидиметилсилоксана (PDMS), оптически прозрачного силиконового полимера, ранее использовавшегося для краниальных окон визуализации. Эти окна можно приклеивать непосредственно к тканям, сокращая время, необходимое для вставки. PDMS является гибким, что способствует его долговечности на мышах с течением времени — было протестировано до 35 дней. Продольная визуализация - это визуализация одной и той же области ткани во время отдельных сеансов. Сетка из нержавеющей стали была встроена в окна, чтобы локализовать одну и ту же область, что позволило визуализировать динамические процессы (например, инволюцию молочной железы) в одних и тех же местах, с интервалом в несколько дней. Это силиконовое окно также позволило контролировать одиночные диссеминированные раковые клетки, развивающиеся в микрометастазы с течением времени. Силиконовые окна, используемые в этом исследовании, проще вставить, чем стеклянные окна с металлическим каркасом, и вызывают ограниченное воспаление изображенных тканей. Кроме того, встроенные сетки позволяют легко отслеживать одну и ту же область ткани в повторных сеансах визуализации.

Введение

Прижизненная микроскопия (IVM), визуализация тканей у анестезируемых животных, дает представление о динамике физиологических и патологических событий при клеточном разрешении в интактных тканях. Применение этого метода широко варьируется, но IVM сыграл важную роль в области биологии рака, чтобы помочь выяснить, как раковые клетки вторгаются в ткани и метастазируют, взаимодействуют с окружающей микросредой и реагируют на лекарства ^1,2,3. Кроме того, IVM был ключом к углублению понимания сложных механизмов, регулирующих иммунные реакции, предоставляя понимание, дополняющее подх....

протокол

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с Лабораторным хирургическим руководством Колд-Спринг-Харбор и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в лаборатории Колд-Спринг-Харбор.

1. Литье силиконового окна

1. Получают силиконовый полимер (PDMS), смешивая базовый эластомер и отверждающий агент в соотношении 10:1 (v/v).
2. Отлить окно, нанеся небольшое количество PDMS на стерильную, гладкую поверхность и отрегулировать отношение объема к площади до желаемой толщины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 200 мг раствора полимера для круга диаметром 22 мм на крышке кр....

Результаты

Прижизненная визуализация через окна визуализации может использоваться для наблюдения, отслеживания и количественной оценки широкого спектра клеточных и молекулярных событий с одноклеточным разрешением в течение периода от часов до недель. К идеальным особенностям окна визуализац?.......

Обсуждение

Окна прижизненной визуализации являются важными инструментами для непосредственной визуализации физиологических и патологических процессов с клеточным разрешением, поскольку они разворачиваются с течением времени. Новая процедура, описанная для литья и вставки гибких силиконовых .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453