Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Zusammenfassung

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Zusammenfassung

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ermöglicht die Visualisierung von Zellbewegung, -teilung und -tod bei Einzelzellauflösung. IVM durch chirurgisch eingesetzte Bildgebungsfenster ist besonders leistungsfähig, da es die Längsmessung desselben Gewebes über Tage bis Wochen ermöglicht. Typische Bildfenster bestehen aus einem Glasdeckglas in einem biokompatiblen Metallrahmen, der an der Haut der Maus vernäht ist. Diese Fenster können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen und aufgrund von Glasscherben oder zerrissenen Nähten versagen, von denen jede Euthanasie erfordern kann. Um diese Probleme anzugehen, wurden Fenster für die langfristige Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen aus einem dünnen Film aus Polydimethylsiloxan (PDMS) entwickelt, einem optisch klaren Silikonpolymer, das zuvor für kraniale Bildgebungsfenster verwendet wurde. Diese Fenster können direkt auf das Gewebe geklebt werden, wodurch die Zeit für das Einführen reduziert wird. PDMS ist flexibel und trägt im Laufe der Zeit zu seiner Haltbarkeit bei Mäusen bei – es wurden bis zu 35 Tage getestet. Längsschnittbildgebung ist die Bildgebung derselben Geweberegion während separater Sitzungen. Ein Edelstahlgitter wurde in die Fenster eingebettet, um die gleiche Region zu lokalisieren, was die Visualisierung dynamischer Prozesse (wie die Involution der Brustdrüse) an den gleichen Stellen im Abstand von Tagen ermöglicht. Dieses Silikonfenster ermöglichte auch die Überwachung einzelner disseminierter Krebszellen, die sich im Laufe der Zeit zu Mikrometastasen entwickelten. Die in dieser Studie verwendeten Silikonfenster sind einfacher einzusetzen als metallgerahmte Glasfenster und verursachen eine begrenzte Entzündung des abgebildeten Gewebes. Darüber hinaus ermöglichen eingebettete Gitter eine einfache Verfolgung derselben Geweberegion in wiederholten Bildgebungssitzungen.

Einleitung

Die intravitale Mikroskopie (IVM), die Bildgebung von Geweben bei betäubten Tieren, bietet Einblicke in die Dynamik physiologischer und pathologischer Ereignisse bei zellulärer Auflösung in intaktem Gewebe. Die Anwendungen dieser Technik sind sehr unterschiedlich, aber IVM war im Bereich der Krebsbiologie von entscheidender Bedeutung, um aufzuklären, wie Krebszellen in Gewebe eindringen und metastasieren, mit der umgebenden Mikroumgebung interagieren und auf Medikamente reagieren ^1,2,3. Darüber hinaus war IVM der Schlüssel zum besseren Verständnis der komplexen Mechanismen, die Immunantworten steuern, indem es Erkenntnisse lieferte, die Ex-vivo-Profiling-Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie) ergänzten. Zum Beispiel haben intravitale Bildgebungsexperimente Details über Immunfunktionen in Bezug auf Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt enthüllt und eine Plattform zur Quantifizierung der raumzeitlichen Dynamik als Reaktion auf Verletzungen oder Infektionen^geboten 4,5,6,7. Viele dieser Prozesse können auch durch histologische Färbung untersucht werden, aber nur IVM ermöglicht die Verfolgung dynamischer Veränderungen. Während ein histologischer Abschnitt eine Momentaufnahme des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, kann die intravitale Bildgebung interzelluläre und subzelluläre Ereignisse innerhalb desselben Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen. Insbesondere Fortschritte bei der Fluoreszenzmarkierung und die Entwicklung molekularer Reporter haben es ermöglicht, molekulare Ereignisse mit zellulärem Verhalten wie Proliferation, Tod, Motilität und Interaktion mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix zu korrelieren. Die meisten IVM-Techniken basieren auf der Fluoreszenzmikroskopie, die aufgrund der Lichtstreuung die Abbildung tieferer Gewebe schwierig macht. Das interessierende Gewebe muss daher oft mit einem oft invasiven und terminalen Verfahren operativ exponiert werden. So kann das Gewebe je nach Organstelle kontinuierlich für einen Zeitraum von wenigen bis 40 h⁸ abgebildet werden. Alternativ ermöglicht das chirurgische Einsetzen eines permanenten Bildgebungsfensters die sequentielle Abbildung desselben Gewebes über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen ^7,9.

Die Entwicklung neuer Bildgebungsfenster wurde als technologischer Bedarf zur weiteren Verbesserung intravitaler Bildgebungsansätze^{hervorgehoben 10}. Das prototypische intravitale Bildgebungsfenster ist ein Metallring, der einen Glasdeckel enthält, der mit Nähten¹¹ auf der Haut befestigt ist. Störungen der Bewegungsfreiheit, die Ansammlung von Exsudat und Schäden am Glasdeckglas sind häufige Probleme bei der Verwendung solcher Fenster. Darüber hinaus erfordert das prototypische Fenster eine spezielle Produktion, und der chirurgische Eingriff kann eine umfangreiche Schulung erfordern. Um diese Probleme anzugehen, wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Silikonpolymer, das zuvor in Schädelfenstern für die Langzeitbildgebung im Gehirn verwendet wurde¹², für den Einsatz in der Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen angepasst. Hier wird eine detaillierte Methode zur Erzeugung von PDMS-basierten Silikonfenstern vorgestellt, einschließlich der Frage, wie das Fenster um ein Edelstahlgitter gegossen wird, um Landmarken für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Weiterhin wird ein einfacher, stichfreier Operationsablauf zum Einführen des Fensters über Bauchorgane oder die Brustdrüse beschrieben. Dieser neue Ansatz überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern und erhöht die Zugänglichkeit der intravitalen Längsbildgebung.

Protokoll

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den chirurgischen Richtlinien des Cold Spring Harbor Laboratory durchgeführt und waren vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cold Spring Harbor Laboratory genehmigt worden.

1. Gießen des Silikonfensters

1. Bereiten Sie das Silikonpolymer (PDMS) vor, indem Sie das Basiselastomer und den Härter im Verhältnis 10:1 (v/v) mischen.
2. Gießen Sie ein Fenster, indem Sie eine kleine Menge PDMS auf eine sterile, glatte Oberfläche abscheiden und das Verhältnis von Volumen zu Fläche auf die gewünschte Dicke einstellen.
   HINWEIS: Die Verwendung von 200 mg Polymerlösung für einen Kreis mit einem Durchmesser von 22 mm auf dem Deckel eines 24-Well-Plate-Deckels führt zu einem guten Kompromiss zwischen Fensterrobustheit und optischer Klarheit.
3. Optional: Um Landmarken für die wiederholte Bildgebung derselben Geweberegionen bereitzustellen, drücken Sie leicht ein Edelstahlgitter in das Silikon, nachdem sich das PDMS auf der gewünschten Gießoberfläche befindet.
4. Um Luftblasen zu entfernen, legen Sie die beschichtete Oberfläche für 45 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator, um das Polymer zu entgasen.
5. Die Silikonfenster in einem Ofen bei 80 °C für 45 min aushärten.
6. Ritzen Sie das Polymer an den Rändern der Form und ziehen Sie die ausgehärteten Fenster vorsichtig von der Oberfläche ab, die für das Gießen mit Pinzetten verwendet wird.
7. Sterilisieren Sie vor der Operation die Fenster durch Autoklavieren.

2. Vorbereitung der Maus für das Einsetzen des Silikonfensters

1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Isofluran. Bewegen Sie die Maus zu einem Wärmekissen auf dem Operationstisch, legen Sie die Maus in die Anästhesie-Nasenmaske und senken Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% für die Aufrechterhaltung während der gesamten Operation.
2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen der Hinterbeine kneifen. Fahren Sie nicht fort, bis die Maus inaktiv ist und keine Zehenklemmreflexreaktion zeigt.
3. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen und ein Trauma verhindern.
4. Präventive Analgesie (Buprenorphin 0,05 mg/kg) subkutan verabreichen.
5. Rasieren Sie die Operationsstelle und entfernen Sie die Haare vollständig mit einer Haarentfernungscreme.
6. Tragen Sie Povidon-Jod-Lösung (10% v/v) und Ethanol (70% v/v) 3x nacheinander auf, um eine Infektion an der Operationsstelle zu verhindern.

3. Einführen eines ventralen Fensters für die Bildgebung in der Leber; anpassbar für andere Bauchorgane (Abbildung 1)

1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage.
2. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt, der 3 mm nach unten mit sterilen Scheren und Pinzetten beginnt.
3. Entfernen Sie einen 1–1,5 cm² großen Hautabschnitt entlang der Mittellinie.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
5. Optional: Um einen größeren Teil der Leber sichtbar zu machen, verwenden Sie sterile Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, um die Leber vom Zwerchfell nach unten zu drücken und das falciforme Band freizulegen, das die Leber mit dem Zwerchfell verbindet. Durchtrennen Sie das Band und achten Sie darauf, die untere Hohlvene nicht zu schneiden.
6. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze ab, tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf. Dieser Klebstoff erzeugt eine kreisförmige Dichtung, die den mittleren Bereich für die Bildgebung intakt lässt.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden. Es ist nicht notwendig, das Gewebe vor dem Auftragen des Klebstoffs zu trocknen.
   HINWEIS: Alle Klebstoffe auf Cyanacrylatbasis können für dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt werden. Chirurgischer Klebstoff sorgt für Sterilität. Für Klemmenverfahren liefern Allzweck-Sekundenkleber gute Ergebnisse.
7. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
8. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
9. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
10. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Durchführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Lebergewebes durch das Fenster sichtbar sein.
11. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.
    ACHTUNG: Wenn der Eingriff mit sterilen chirurgischen Techniken durchgeführt wird und das Fenster vor dem Einsetzen sterilisiert wird, reicht das Versiegeln der Wunde mit chirurgischem Klebstoff aus, um Infektionen zu vermeiden. Das Versäumnis, die richtigen aseptischen Techniken während des chirurgischen Einführens oder eines unvollkommenen Verschlusses zu befolgen, kann jedoch zu einer offensichtlichen oder subklinischen Infektion und zum Austrocknen des Gewebes führen.

4. Einfügen eines seitlichen Fensters für die Bildgebung in der Leber; kompatibel mit der gleichzeitigen Injektion von Krebszellen in die Pfortader (Abbildung 2)

1. Platzieren Sie die Maus auf der linken seitlichen Dekubitusposition
2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt an der rechten Flanke 3 mm unterhalb des Rippenbogens mit steriler Schere und Pinzette.
3. Entfernen Sie einen 1 cm² großen Hautabschnitt.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
5. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze ab, tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
   HINWEIS: Alle Klebstoffe auf Cyanacrylatbasis können für dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt werden. Chirurgischer Klebstoff sorgt für Sterilität. Für Klemmenverfahren liefern Allzweck-Sekundenkleber gute Ergebnisse.
6. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
7. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
8. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
9. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
   HINWEIS: Bei korrekter Durchführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Lebergewebes durch das Fenster sichtbar sein.
10. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.
11. Wenn eine Pfortaderinjektion erforderlich ist:
    1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage.
    2. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt, beginnend mit dem Xiphoid-Prozess in der Haut.
    3. Machen Sie mit einer zweiten sterilen Schere und Pinzette einen 10-mm-Schnitt im Peritoneum.
    4. Tauchen Sie zwei Wattestäbchen in sterile Kochsalzlösung.
    5. Verwenden Sie die Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig auf sterile Gaze zu ziehen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet ist, und achten Sie darauf, die Ausrichtung nicht zu verdrehen oder anderweitig zu stören.
    6. Verschieben Sie den Darm aus der Bauchhöhle, bis die Pfortader auf der rechten Seite des Abdomens sichtbar ist.
    7. Führen Sie eine 31–33 G Nadel 5–7 mm Caudal zum Eintrittspunkt der Pfortader in die Leber ein und achten Sie darauf, innerhalb des Blutgefäßes und nicht durch es hindurch zu gehen.
    8. Injizieren Sie langsam die Krebszellen (resuspendiert in 100 μL sterilem PBS).
       HINWEIS: Für dieses Experiment kann die Amurinzelllinie für Bauchspeicheldrüsenkrebs (z. B. KPC-BL / 6-1199) in vollständigen DMEM-Medien kultiviert und 1 x 10⁵ Zellen in 100 μL steriles PBS injiziert werden.
    9. Um Blutungen zu vermeiden, üben Sie unmittelbar nach dem Zurückziehen der Nadel mit einem kleinen Stück chirurgischem Schwamm für 1–2 min sanften Druck auf die Injektionsstelle aus.
    10. Nachdem der Druck nachgelassen hat, überwachen Sie die Stelle für 1-2 Minuten, um die Hämostase sicherzustellen.
    11. Mit angefeuchteten Wattestäbchen den Darm nach der physiologischen Orientierung des Organs in die Bauchhöhle zurückbringen.
    12. Verwenden Sie eine sterile Pinzette und setzen Sie das Fenster unmittelbar unter dem Peritoneum auf der linken Seite der Bauchhöhle der Maus ein.
    13. Nähen Sie mit 4-0 Seidennähten und heften Sie den Mittellinienschnitt mit 7 mm gewickelten Edelstahlclips.
    14. Bewegen Sie die Maus in die linke seitliche Dekubitusposition
    15. Machen Sie einen 10 mm Einschnitt an der rechten Flanke 3 mm unter dem Rippenbogen durch die Haut mit steriler Schere und Pinzette.
    16. Entfernen Sie einen 1 cm² großen Hautabschnitt um den Schnitt herum.
    17. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
    18. Ziehen Sie das Fenster über die Leber, bevor Sie es an Ort und Stelle kleben, wie unter den Schritten 4.8 bis 4.10 beschrieben.

5. Einfügen des Fensters für die Bildgebung in der Bauchspeicheldrüse (Abbildung 3)

1. Platzieren Sie die Maus auf der rechten seitlichen Dekubitusposition.
2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt an der linken Flanke 3 mm unterhalb des Rippenbogens mit steriler Schere und Pinzette.
3. Entfernen Sie einen 1 cm² großen Hautabschnitt um den Schnitt herum.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
5. Ziehen Sie mit sterilen Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung getränkt sind, vorsichtig an der Milz, um die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren. Positionieren Sie die Bauchspeicheldrüse mit den angefeuchteten Wattestäbchen neu, um durch den Schnitt mehr Oberfläche sichtbar zu machen.
   HINWEIS: An diesem Punkt können Bauchspeicheldrüsenkrebszellen orthotop in die Bauchspeicheldrüse injiziert werden, wenn dies Teil des experimentellen Designs ist.
6. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze zurück und tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Bauchspeicheldrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
7. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Bauchspeicheldrüse, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
8. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
9. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
10. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Ausführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Bauchspeicheldrüsengewebes durch das Fenster sichtbar sein.
11. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.

6. Einfügen des Fensters für die Bildgebung in die Brustdrüse (Abbildung 4)

1. Legen Sie die Maus auf die Rückenlage.
2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt medial zu einem der Leistenbrustwarzen mit steriler Schere und Pinzette.
3. Entfernen Sie einen 0,5 cm² großen Hautabschnitt oberhalb der Brustdrüse.
4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere, um die Brustdrüse vorsichtig von der Haut zu trennen, indem Sie die Schere zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die Haftung zu stören.
   HINWEIS: Um die Bildgebung des Leisten-Brustdrüsenbereichs zu erleichtern, achten Sie darauf, einen Teil der Haut oberhalb der Brustdrüse, aber oberhalb des Hinterbeins zu sezieren, damit das Fenster die Beweglichkeit der Maus nicht einschränkt.
5. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze zurück und tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Brustdrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
   VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
6. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Brustdrüse, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
   HINWEIS: Ein kreisförmiger Bereich des Brustdrüsengewebes sollte jetzt durch das Fenster sichtbar sein, wenn er korrekt ausgeführt wird.
7. Falten Sie die Ränder des Fensters unter die Haut.
8. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter der Haut befinden. Drücken Sie mit einer Pinzette auf die Haut, um die Haut am Fenster zu befestigen.
9. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.

7. Nachchirurgische Genesung

1. Legen Sie die Maus in einen sauberen Erholungskäfig mit reichlich Nistmaterial und stellen Sie sicher, dass ein Teil des Käfigs auf einem Heizkissen ruht.
2. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie bewusst und mobil ist.
3. Falls erforderlich, geben Sie eine zusätzliche Dosis Analgetikum 12 h nach der präventiven Dosis.
   HINWEIS: Zusätzliche Analgesie ist im Allgemeinen unnötig, aber konsultieren Sie einen Tierarzt, wenn die Maus Anzeichen von Stress zeigt (wie gebeugter Rücken, ungepflegtes Fell oder verlorenes Interesse an Nahrung). Überwachen Sie die Maus täglich für die ersten 3 Tage nach der Operation auf Anzeichen einer Infektion oder andere Nebenwirkungen. Weniger als 2% der Mäuse benötigen tierärztliche Hilfe oder Euthanasie, typischerweise aufgrund einer teilweisen Ablösung des Fensters. Es ist wichtig zu beachten, dass bei männlichen Mäusen mit ventralen Leberbildgebungsfenstern der Kampf zwischen Mäusen zu einer Ablösung der Fenster führen kann. Dies wird vermieden, indem die Mäuse separat untergebracht werden.

8. Bildgebung durch das Fenster

1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Isofluran.
2. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen und ein Trauma verhindern.
3. Bewegen Sie die Maus von der Induktionskammer in die Mikroskopstufe. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Nasenmaske und senken Sie die Isofluran-Konzentration auf etwa 1-1,5% für die Erhaltungsanästhesie während des gesamten bildgebenden Verfahrens.
4. Platzieren Sie einen Druckkissensensor unter der Maus, um die Atemfrequenz zu überwachen, und fixieren Sie die Maus mit weichem chirurgischem Klebeband auf der Bühne.
5. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Körpertemperatur während der gesamten Bildgebungssitzung zu überwachen.
6. Schalten Sie das beheizte Pad ein und überwachen Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Körpertemperatur 37 ° C nicht überschreitet.
7. Verwenden Sie Software, um die Atemfrequenz der Maus zu überwachen. Die optimale Rate beträgt ~ 1 Atem / Sekunde. Stellen Sie die Anästhesie nach Bedarf ein.
8. Reinigen Sie vor jeder Bildgebungssitzung das Fenster von Restlinsentauchmedium und Ablagerungen, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.
9. Wenn Sie eine Wassertauchlinse verwenden, tragen Sie Ultraschallgel auf das Fenster auf und vermeiden Sie Blasen.
   HINWEIS: Destilliertes Wasser kann ebenfalls verwendet werden, erfordert jedoch möglicherweise eine erneute Anwendung während der Bildgebung.
10. Um die optimale Tiefe für die Bildgebung zu finden, lokalisieren Sie zuerst das Raster und platzieren Sie es im Fokus.
11. Bestimmen Sie die ungefähre Gewebebildgebungstiefe, indem Sie den unteren Rand des Gitters auf 0 setzen. Diese Informationen sind notwendig, um die entsprechende z-Ebene in nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu lokalisieren.
12. Um dieselbe Position über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg zu identifizieren, verwenden Sie die Quadrate auf dem Raster als Referenzpunkt. Notieren Sie sich während der Bildgebung die Ausrichtung des Rasters und die Position innerhalb des Rasters jedes abgebildeten Sichtfelds (z. B. 2. Reihe von oben, ^{4. Quadrat} von links).
13. Verwenden Sie während aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen das Raster, um zu bestimmten Rasterbereichen - und damit zu Bildfeldern - zu navigieren.
14. Entfernen Sie nach jeder Bildgebungssitzung alle verbleibenden Linsentauchmedien und Ablagerungen, indem Sie das Fenster vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.

Ergebnisse

Die intravitale Bildgebung durch Bildgebungsfenster kann verwendet werden, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Ereignissen mit Einzelzellauflösung über einen Zeitraum von Stunden bis Wochen zu beobachten, zu verfolgen und zu quantifizieren. Zu den idealen Merkmalen für ein Bildgebungsfenster gehören: a) begrenzte Auswirkungen auf das Wohlbefinden der Maus und die Physiologie des Gewebes; b) Haltbarkeit; c) Einfachheit des Einfügens; und d) Freie Landmarken für wiederholte Bildgebung derselben Reg...

Diskussion

Intravitale Bildgebungsfenster sind wichtige Werkzeuge, um physiologische und pathologische Prozesse in zellulärer Auflösung direkt sichtbar zu machen, während sie sich im Laufe der Zeit entfalten. Das neuartige Verfahren zum Gießen und Einsetzen flexibler Silikonbildgebungsfenster in Mäuse überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern (Exsudat, Bruch und Störung der normalen Mobilität), bietet zusätzliche Sicherheit für die Maus und erhöht die Zugänglichkeit dieser Te...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape	3M	70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2	Ethicon	N267H
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)	Vector Laboratories	SK-4200
Alcohol swabs	BD	326895
Anesthesia system	Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors	BIOPAC	ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray	LORIS	109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice	Jackson Laboratory	18549
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	14-0451-82
CD68 Antibody	Abcam	ab125212
Curity gauze sponges	Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)	Abcam	ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear	Electron Microscopy Sciences	24236-10	Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Ender-3 Pro 3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket	Kent Scientific	RT-0520
Fc Receptor Blocker	Innovex Biosciences	NB309
Fiji imaging processing package			https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515)	Invitrogen	F8795
Gating system:	BIOPAC Systems Inc.		The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software		ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series		DA100C
Dual Gating Sys small animal		DTU200
MP160 for Windows - Analysis system		MP160WSW
MouseOx Plus 120V		MOX-120V;015000
Pressure Pad		TSD110
Gelfoam	Pfizer	9031508	Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody	R&D Systems	AF3667
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc	BD	324912
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594	Vector Laboratories	DL-1177-1
LysM-eGFP mice	www.mmrrc.org	012039-MU
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length
MTS MiniBionix II 808	MTS Systems		Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe	PerkinElmer	NEV11169
Nitrogen	General Welding Supply Corp.
Oxygen	General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament	Hatchbox		1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36970
Puralube ophthalmic ointment	Dechra	NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips	Roboz Surgical	RS-9255
Stainless steel grid	Fotofab		One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.
Surface Treated SterileTissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012929	Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope	LaVision BioTec		Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr
Vetbond	3M	70200742529
VWR micro cover glass	VWR	48404-453