التعديل الكيميائي لبقايا التربتوفان في Ca2+-ATPase N-domain لدراسة تريبتوفان-ANS FRET

Summary

ANS يربط Ca^{2 +}-ATPase recombinant N-المجال. عرض أطياف مضان نمط مثل FRET عند الإثارة في الطول الموجي من 295 نانومتر. ويروي التعديل الكيميائي الذي يتوسط فيه المكتب الوطني للإحصاء في Trp مضان المجال N، مما يؤدي إلى عدم وجود نقل للطاقة (FRET) بين بقايا Trp و ANS.

Abstract

الساركو / إندوبالازميك ريتيكولم Ca^{2 +}- ATPase (SERCA) هو ATPase من نوع P الذي تم بلورته في تشكيلات مختلفة. ومع ذلك، يمكن الحصول على معلومات وظيفية مفصلة من مجالات منعزلة مؤتلفة. يعرض المجال الهندسي (Trp552Leu و Tyr587Trp) النطاق الملتصق بالنيوكليوتيدات المؤتلف (N-domain) إخمادا مضانا عند الربط بين الليجاند. وفلوروفوري extrinsic، وهي 8-anilino-1-النفثالين السلفونات (ANS)، يرتبط إلى موقع الربط النيوكليوتيدات عن طريق التفاعلات الكهربائية والمائية مع آرغ، له، علاء، ليو، وبقايا في. ويتضح الربط ANS من خلال زيادة في كثافة الفلورسينس عندما متحمس في الطول الموجي (λ) من 370 نانومتر. ومع ذلك، عندما متحمس في λ من 295 نانومتر، ويبدو أن الزيادة في كثافة مضان أن يقترن إرواء الفلورية الجوهرية N-المجال. عرض الطيف الفلورية Föster نقل الطاقة الرنين (FRET) نمط مثل, مما يشير إلى وجود زوج Trp-ANS FRET, الذي يبدو أن تكون مدعومة مسافة قصيرة (~ 20 Å) بين Tyr587Trp و ANS. تصف هذه الدراسة تحليلا لزوج Trp-ANS FRET عن طريق التعديل الكيميائي Trp (وإرواء الفلورسينس) الذي يتم بوساطة N-bromosuccinimide (NBS). في N-المجال المعدل كيميائيا, زيادة مضان ANS عندما متحمس في λ من 295 نانومتر, على غرار عندما متحمس في λ من 370 نانومتر. ومن ثم، يمكن استخدام التعديل الكيميائي بوساطة NBS لبقايا Trp للتحقيق في عدم وجود FRET بين Trp و ANS. في غياب ترب مضان، لا ينبغي للمرء أن يلاحظ زيادة في مضان ANS. التعديل الكيميائي لمخلفات Trp في البروتينات من قبل NBS قد يكون مفيدا لفحص FRET بين بقايا Trp القريبة من ANS المقيدة. ومن المرجح أن يكون هذا المقايسة مفيدا أيضا عند استخدام الفلوروفوريس الأخرى.

Introduction

أصبح نقل الطاقة الرنين Föster (FRET) تقنية قياسية لتحديد المسافة بين الهياكل الجزيئية بعد الربط أو التفاعل في بنية البروتين ودراسات الوظائف^1و2و3و4. في P-نوع ATPases، وقد استخدمت FRET للتحقيق في هيكل ووظيفة من reticulum الساركو-endoplasmic Ca²⁺-ATPase (SERCA)^{2،5،6،7،8}، على سبيل المثال ، تم تحليل التقلبات الهيكلية خلال دورة الحفاز في البروتين كله من قبل FRET

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تحديد(في silico)من ANS وSERCA N-المجال التفاعل

1. توليد ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل البروتين (SERCA N-المجال) عن طريق النمذجة الجزيئية باستخدام البروتين المفضل النمذجة البرمجيات⁵⁰.
2. تحديد بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل موقع الربط النيوكليوتيدات باستخدام برنامج التركيب الجزيئي المفضل⁵¹، وتحديد وجود بقايا آرغ و ليس³⁵؛ هذه مطلوبة لربط ANS وزيادة كثافة الفلورسينس (العائد الكمي).
3. إجراء الالتحام الجزيئي (باستخدام برنامج الالتحام المفضل)^52،53،54 لتحديد تفاعلات ATP ، الفلورسين ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر الالتحام الجزيئي ربط ANS بموقع الربط بالنيوكليوتيدات في المجال N عبر التفاعلات الكهروستاتيكية وكذلك التفاعلات الكارهة للماء(الشكل 1). المسافة الجزيئية (20 Å) بين بقايا Trp و ANS (ملزمة بموقع الربط النيوكليوتيدات) يدعم حدوث FRET (الشكل 1). تم الحصول على تصميم (هند.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عرض أطياف مضان من مجمع ANS-N-المجال نمط مثل FRET عندما متحمس في λ من 295 نانومتر, في حين أن المسافة الجزيئية (20 Å) بين بقايا Trp و ANS يبدو لدعم حدوث FRET (الشكل 1). TRP التعديل الكيميائي من قبل النتائج NBS في أقل الفلورسنت N-المجال (الشكل 3B, الطيف و); وبالتالي، نقل الطاقة غير مم?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Bio-Rad	1610107	SDS-PAGE
Ammonium persulfate	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid	Sigma-Aldrich	A1028	Fluorophore
Bis-acrylamide	Bio-Rad	1610125	SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide	Sigma-Aldrich	B81255	Chemical modification
N,N-dimethylformamide	J.T. Baker	9213-12	Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F7250	Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette	Hellma	Z801291	Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer	Shimadzu	RF 5301PC	Fluorescence assay
HisTrap™ FF	GE Healtcare	11-0004-59	Protein purification
IPTG, Dioxane free	American Bionalytical	AB00841-00010	Protein expression
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G	Protein purification
LB media	Fisher Scientific	10000713	Cell culture
Pipetman L P10L	Gilson	FA10002M	Fluorescence assay
Pipetman L P100L	Gilson	FA10004M	Fluorescence assay
Pipetman L P200L	Gilson	FA10005M	Fluorescence assay
Pipetman L P1000L	Gilson	FA10006M	Fluorescence assay
Pipetman L P5000L	Gilson	FA10007	Fluorescence assay
Precision plus std	Bio-Rad	1610374	SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate	Bio-Rad	1610302	SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic	J.T. Baker	3828-19	Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic	J.T. Baker	3818-01	Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um	Millipore	GVWP04700	Solution filtration
Temed	Bio-Rad	1610801	SDS-PAGE
Tris	Bio-Rad	1610719	SDS-PAGE