Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ANS נקשר לתחום N רקומביננטי של Ca2+ATPase. ספקטרום פלואורסצנטי מציג תבנית דמוית FRET עם עירור באורך גל של 295 ננומטר. שינוי כימי בתיווך NBS של Trp מרווה את הפלואורסצנטיות של N-domain, מה שמוביל להיעדר העברת אנרגיה (FRET) בין שאריות Trp ו- ANS.

Abstract

הסרקו/אנדופלסמי רטיקולום Ca2+-ATPase (SERCA) הוא ATPase מסוג P שהתגבש בקונפורמציות שונות. מידע פונקציונלי מפורט ניתן בכל זאת לקבל מתחומים רקומביננטיים מבודדים. הדומיין המהונדס (Trp552Leu ו- Tyr587Trp) רקומביננטי נוקלאוטיד מחייב תחום (N-domain) מציג פלואורסצנטיות מרווה על כריכת ליגנד. פלואורופור חיצוני, כלומר, 8-אנילינו-1-נפטלין סולפונט (ANS), נקשר לאתר כריכת הנוקלאוטידים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות עם שאריות ארג, שלו, עלא, לאו ו-Phe. כריכת ANS מעידה על העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות כאשר נרגשים באורך גל (λ) של 370 ננומטר. עם זאת, כאשר נרגשים ב λ של 295 ננומטר, העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות נראה מצמיד את מרווה של פלואורסצנטיות מהותית N-תחום. ספקטרום פלואורסצנטי מציג תבנית דמוית העברת אנרגיית תהודה של Föster (FRET), ובכך מרמז על נוכחות של זוג Trp-ANS FRET, שנראה נתמך על ידי המרחק הקצר (~ 20 Å) בין Tyr587Trp ו- ANS. מחקר זה מתאר ניתוח של זוג Trp-ANS FRET על ידי שינוי כימי Trp (ומרווה פלואורסצנטיות) המתווך על ידי N-bromosuccinimide (NBS). בתחום N שונה כימית, פלואורסצנטיות ANS גדל כאשר נרגש ב λ של 295 ננומטר, בדומה כאשר נרגש ב λ של 370 ננומטר. לפיכך, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp יכול לשמש כדי לחקור את היעדר FRET בין Trp ו ANS. בהיעדר פלואורסצנטיות Trp, אין לראות עלייה בפלואורסצנטיות ANS. השינוי הכימי של שאריות Trp בחלבונים על ידי NBS עשוי להיות שימושי לבדיקת FRET בין שאריות Trp שקרובות ל- ANS הכבול. סביר להניח כי ניתן יהיה להשתמש ב- Assay זה גם בעת שימוש בפלואורופורים אחרים.

Introduction

העברת אנרגיית התהודה של Föster (FRET) הפכה לטכניקה סטנדרטית לקביעת המרחק בין מבנים מולקולריים לאחר כריכה או אינטראקציה במבנה החלבון ובמחקריפונקציות 1,2,3,4. ב- ATPases מסוג P, FRET שימש כדי לחקור את המבנה והתפקוד של רטיקולום סרקו-אנדופלסמי Ca2 +- ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, למשל, תנודות מבניות במהלך המחזור הקטליטי נותחו בחלבון כולו על ידי FRET7.

תורמי FRET הם מגוונים, והם נעים בין מולקולות פלואורסצנטיות קטנות (קיצוניות) לחלבונים פלואורסצנטיים9,10. שאריות טריפטופן (Trp) (בשל הפלואורסצנטיות שלהם) שימושיות לזיהוי שינויים מבניים ברצפי חומצות אמינו חלבוניות11,12. עוצמת הפלואורסצנטיות של Trp תלויה באופן משמעותי בקוטביות שלסביבתו 13,14. כריכת ליגנד מייצרת בדרך כלל סידורים מבניים בחלבונים/אנזימים15,16. אם Trp קיים או ממוקם קרוב לאתר כריכת החלבון, תנודות מבניות משפיעות לעתים קרובות על מידת החשיפה ל- Trp למדיה מימית13,14; לכן, השינוי בקוטביות גורם להרוות את עוצמת הפלואורסצנטיות של Trp13,14. לפיכך, המאפיין הפלואורסצנטי של Trp שימושי לביצוע מחקרי כריכת ליגנד עבור אנזימים. תופעות פיזיות אחרות עלולות גם להוביל לפלואורסצנטיות של Trp המשתוות17,18,19,20, למשל, FRET ושינויים בקוטביות בינונית. העברת אנרגיה מהמצב הנרגש של Trp לפלורופור יש גם יישומים פוטנציאליים, למשל, קביעת זיקה של ליגנדים קטנים בחלבונים21. ואכן, Trp שימש בעיקר כתורם פלואורסצנטי במחקרי FRET בחלבונים22,23,24, למשל, במחקרי טרביום (Tb3+) FRET, שאריות Trp משמש לעתים קרובות כאנטנה להעברת אנרגיה ל- Tb3 +25,26,27. Trp מציג יתרונות שונים על פני תורמי FRET אחרים בשל אופיו המכונן המובנה במבנה החלבון, אשר מבטל את הצורך בתהליכי הכנה שעשויים להשפיע על התפקוד / המבנה של החלבון הנחקר24. לכן, זיהוי של ריקבון קרינה (העברת אנרגיה ושינויים בקוטביות הבינונית הנגרמים על ידי סידורים מבניים של חלבון) חשוב להסיק מסקנות מדויקות לגבי כריכת ליגנד במחקרים מבניים חלבונים13,14,19,28.

במחקרים מבניים חלבון, פלואורופור חיצוני, כלומר, 8-אנילינו-1-נפטלין סולפונט (ANS), שימש בעיקר בניסויים הקשורים קיפול חלבון / התגלגלות28,29. ANS נקשר חלבונים / אנזימים במדינת האם, בדרך כלל באתרים מחייבים שלמצעים 31,32,33; עלייה בתפוקה קוונטית פלואורסצנטית ANS (ΦF) (כלומר, עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות) מושרה על ידי מרגש את החלבון ב λ = 370 ננומטר כאשר אינטראקציות מתאימות של ANS עם ארג ושאריות שלו בכיסים הידרופוביים להתרחש34,35,36,37. במחקרים שונים, דווח על התרחשותו של FRET (כאשר מרגש ב λ בתוך 280-295 ננומטר) בין שאריות Trp (תורמים) ו- ANS (מקבל), אשר מבוסס על הדברים הבאים: 1) חפיפה של ספקטרום פליטת פלואורסצנטיות של Trp ו ספקטרום עירור של ANS, 2) זיהוי של מרחק מתאים בין שאריות Trp אחד או יותר (ים) ו- ANS להעברת אנרגיה, 3) תשואה קוונטית ANS גבוהה כאשר כבול בכיסי חלבון, ו 4) דפוס FRET אופייני בספקטרום הפלואורסצנטיות של החלבון בנוכחות ANS3,17,27,37,38.

לאחרונה, איגוד ליגנד לתחום איגוד הנוקלאוטידים (N-domain) ב- SERCA ו- ATPases אחרים מסוג P נחקרו באמצעות N-domains רקומביננטי מהונדס40,41,42,43,44,45,46. הנדסה מולקולרית של SERCA N-domain שימשה להעברת שאריות Trp הבלעדיות (Trp552Leu) למבנה דינמי יותר (Tyr587Trp) הקרוב לאתר כריכת הנוקלאוטידים, שבו ניתן להשתמש בווריאציות פלואורסצנטיות (מרווה) לניטור שינויים מבניים על כריכת ליגנד34. תוצאות הניסוי הוכיחו כי ANS נקשר (כ- ATP) לאתר כריכת הנוקלאוטידים ב- SERCA N-domainהמטוהר 34. מעניין, פלואורסצנטיות ANS גדל על כריכה לתחום N על עירור ב λ של 295 ננומטר, בעוד הפלואורסצנטיות המהותית של N-דומיין פוחתת34, ובכך לייצר דפוס FRET המציע היווצרות של זוג Trp-ANS FRET.

השימוש ב- NBS הוצע כדי לקבוע את התוכן של שאריות Trp בחלבונים47 על ידי בדיקת ספיגה של חלבונים מותאמים. NBS משנה את קבוצת האינדולה הסופגת ביותר של Trp לאוקסינדול פחות סופג47,48. התוצאה היא אובדן (מרווה) של מאפיין פלואורסצנטי Trp40. לפיכך, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp עשוי לשמש בדיקה כדי להגדיר את התפקיד של Trp (כתורם) כאשר FRET הוא שיער.

פרוטוקול זה מתאר את השינוי הכימי של שאריות Trp הבלעדיות על ידי NBS בתחום N רקומביננטי מהונדס של SERCA כמודל חלבון. תוצאות הניסוי מראות כי עוצמת הפלואורסצנטיות של ANS עדיין עולה ב- N-domain34שעבר שינוי כימי NBS , חסר פלואורסצנטיות מהותית. לכן, הניסיון שימושי להדגמת היעדר FRET בין שאריות Trp ו- ANS כאשר הוא קשור ל- N-domain34,40,49. לפיכך, בדיקה זו (שינוי כימי NBS של Trp) שימושית בהוכחת נוכחותם של זוג Trp-ANS FRET בחלבונים.

Protocol

1. נחישות (בסיליקו) של אינטראקציית ה- ANS ו- SERCA N-domain

  1. צור מבנה תלת מימדי (3D) של החלבון (SERCA N-domain) על ידי מידול מולקולרי באמצעות תוכנת מידול החלבון המועדפת50.
  2. זהה את שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת הנוקלאוטיד באמצעות תוכנת המבנה המולקולרי המועדפת51, ולקבוע את נוכחותם של שאריות ארג וליס35; אלה נדרשים עבור איגוד ANS ולהגדיל את עוצמת הפלואורסצנטיות (תשואה קוונטית).
  3. בצע עגינה מולקולרית (באמצעות תוכנת העגינה המועדפת)52,53,54 כדי לקבוע את האינטראקציות של ATP, פלואורסצין איזוטיוצינט (FITC) (אשר יוצר קשר קוולנטי עם Lys515 תיוג האתר כריכת נוקלאוטיד), ו ANS עם שאריות חומצות אמינו באתר כריכת נוקלאוטידים ( איור1).
  4. חשב את המרחק המולקולרי (Å) בין שאריות Trp ו- ANS קשור באמצעות כלי המדידה בתוכנה המועדפת.
  5. בצע סימולציה דינמית מולקולרית של קומפלקס ANS-N-תחום כדי לקבוע את היציבות של האינטראקציה52,54. לאחר מכן, לבצע את הניסויים במבחנה כאשר היציבות של המתחם אושרה.

2. ביטוי וטיהור של N-תחום רקומביננטי

  1. לסנתז את קידוד הגן עבור N-תחום40.
  2. לעצב ולבנות את plasmid המכיל את הגן הסינתטי כי קודים עבור N-תחום40.
  3. לבטא ולטהר על ידי כרומטוגרפיה זיקה (Ni-NTA), N-תחום רקומביננטי מהונדס. בצע SDS-PAGE של החלבון המטוהר כדי לקבוע את הטוהר (איור 2)40.
  4. לקבוע את ריכוז החלבון על ידי לימוד הספיגה ב λ של 280 ננומטר עם מקדם ההכחדה N-תחום (ε = 11,960 M-1·ס"מ-1)40.

3. נטר את היווצרותו של קומפלקס התחום ANS-N המבוסס על שינויי עוצמת הפלורסצנטיות של ANS ו- N-domain.

  1. הכן פתרון מלאי ANS ב N,N-דימתילפורמיד.
    1. שקול כמות קטנה (1-5 מ"ג) של ANS, ולהמיס אותו ב 1 מ"ל של הנפח הסופי של N,N-דימתילפורמיד, למשל, 3.2 מ"ג (10.69 mM ריכוז סופי).
    2. הכן פתרון מלאי מימי 100μM ANS באמצעות פתרון ANS ב N,N-דימתילפורמיד, למשל, להוסיף 9.4 μL של פתרון ANS 10.69 mM ל 990.6 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 כדי להשיג נפח סופי של 1 מ"ל.
    3. מערבבים את הפתרונות על ידי מערבולת 3 - 5 פעמים עבור 15 s.
      הערה: בניסוי הבא, השתמש רק בפתרון המניה המ מימי ANS. הכן טרי את פתרון המניה הממית ANS לפני תחילת הניסויים.
  2. הכן את פתרון המניות של NBS ב- N,N-דימתילפורמיד.
    1. שקול כמות קטנה (1-5 מ"ג) של NBS, ולהמיס אותו 1 מ"ל של N,N-דימתילפורמיד, למשל, 5.3 מ"ג ב 1 מ"ל (29.78 mM ריכוז סופי).
    2. הכן פתרון מלאי מימי 1 mM NBS באמצעות פתרון NBS ב N,N-דימתילפורמיד, למשל, להוסיף 3.36 μL של פתרון NBS 29.78 mM ל 96.64 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 כדי להשיג נפח סופי 0.1 מ"ל.
    3. מערבבים את הפתרונות על ידי מערבולת 3 - 5 פעמים עבור 15 s.
      הערה: הכן טרי את פתרון המלאי המומי של NBS לפני תחילת הניסויים.
  3. לתמצת את N-הדומיין עם ANS, ולתעד את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור ב λ = 295 ננומטר ב 25 °C (70 °F).
    1. להשיג את בסיס ספקטרום הפלואורסצנטיות.
      1. מקם 1 מ"ל של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 ב 1 מ"ל פלואורסצנטי קוורץ cuvette.
      2. מקם את התא בתא התא המוצהר התרמו -state (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
      3. להקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305 - 550 ננומטר).
        הערה: ספקטרום הפלואורסצנטיות של חיץ הפוספט של 50 מ"מ עם pH 8.0, המשמש כדגימה ריקה, מופחת מכל ספקטרום הפלואורסצנטי שהושג.
    2. להשיג את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-תחום.
      1. מניחים 900 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 ב cuvette קוורץ פלואורסצנטי.
      2. הוסף 100 μL של השעיית N-domain (10 μM) כדי לקבל ריכוז סופי N-domain 1 בנפח סופי של 1 מ"ל.
      3. הומוגניזציה בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.
        הערה: החלבון צריך להיות מטוהר טרי כדי לקבל ספקטרום פלואורסצנטיות מהותית באיכות גבוהה, למשל, N-domain רקומביננטי מטוהר ניתן להשתמש רק במשך שבוע לאחר הטיהור.
      4. מקם את התא בתא התא המוצהר התרמו -state (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
      5. הקלט את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית של N-domain (305-550 ננומטר).
    3. הוסף ANS, ולקבל את ספקטרום הפלואורסצנטיות על ידי עירור ב λ = 295 ננומטר.
      1. הוסף 2 μL aliquot של 100 μM ANS פתרון מלאי מימית N-domain מושעה (1 μM) כדי לקבל ריכוז סופי ANS 0.2 μM.
      2. הומוגניזציה בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.
      3. מקם את התא בתא התא התרמו-יציב (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
      4. להקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305-550 ננומטר).
      5. חזור על תוספות ANS וספקטרום פלואורסצנטיות הקלטה מעל 1:1 קשר טוחן ANS:N-domain.
      6. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
      7. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד.
      8. קבעו אם הספקטרום יוצר תבנית דמוית FRET. ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS-N-domain יוצר תבנית דמוית FRET(איור 3A).

4. Titration פלואורסצנטיות מהותית של N-domain על ידי שינוי כימי Trp עם NBS.

  1. חזור על שלבים 3.3.1 ו- 3.3.2.
  2. הוסף 1 μL aliquot של 1 mM NBS פתרון מלאי מימי ל- N-domain מושעה (1 μM) כדי להשיג ריכוז סופי של 1 μM NBS.
  3. הומוגני בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.
  4. מקם את התא בתא התא התרמו-יציב (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
  5. תעד את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305-550 ננומטר)(איור 3B).
  6. חזור על הקלטת ספקטרום התוספת והפלואורסצנטיות של NBS עד שנצפו40מרווה פלואורסצנטיות מהותית מינימלית של N-domain . ב- N-domain, פעולה זו מתרחשת בדרך כלל ביחס טחון של 5-6 NBS / N-domain40.
    הערה: NBS מרווה במהירות (<5 s) את הפלואורסצנטיות המהותית של ה- N-domain; נצפתה ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות. המשך מיד לשלב הבא, כמו NBS עשוי גם להגיב עם שאריות חומצת אמינו אחרות47.
  7. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
  8. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3B).

5. טיטרט N-דומיין שונה NBS עם ANS על ידי הקלטת ספקטרום פלואורסצנטי ב 25 °C (70 °F).

  1. בצע את שלב 3.3.3 באמצעות N-domain שהשתנה על-ידי NBS שנוצר בשלב 4.
  2. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
  3. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3C).
  4. ספקטרום הפלואורסצנטיות שנוצר (איור 3C) תומך או מפריך את המופע של FRET, כלומר, כאשר FRET מתרחש, פלואורסצנטיות ANS אינה גדלה ולהיפך.

6. ראיות של ANS מחייב לתחום N שונה כימית על ידי עירור ב λ = 370 ננומטר.

  1. בצע את שלב 3.3.3 באמצעות N-domain שהשתנה על-ידי NBS שנוצר בשלב 4 אך שינה את העירור ל- 370 ננומטר.
  2. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
  3. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3D).
  4. אשר איגוד ANS לתחום N על-ידי התבוננות בעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של ANS. איגוד ANS לתחום N מראה עלייה פלואורסצנטית כאשר נרגשים ב- λ = 370 ננומטר (איור 3D). כפקד, ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS (לבד) במאגר פוספט של 50 מ"מ עם pH 8.0 הושג מרגש ב λ של 295 ו 370 ננומטר(איור 4,לא מוצג בסרטון).
    הערה: היחסים הסטויצ'יומטריים של NBS:Trp הנדרש לשינוי כימי תלוי במידת הקבורה של שאריות Trp בחלבון על פי מחקר46,47,55,56. לכן, מומלץ לקבוע את יחס הטוחנת NBS:חלבון/(Trp), מראש.

תוצאות

עגינה מולקולרית מציגה את הכריכה של ANS לאתר כריכת הנוקלאוטידים של ה- N-domain באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות (איור 1). המרחק המולקולרי (20 Å) בין שאריות Trp ל- ANS (מאוגד לאתר כריכת הנוקלאוטיד) תומך במופע של FRET (איור 1). תחום ה-N המתוכננת (המהונדסת) התקבל בט...

Discussion

ספקטרום פלואורסצנטיות של קומפלקס ה- ANS-N-domain מציג תבנית דמוית FRET כאשר נרגשים במהירות של 295 ננומטר, בעוד שהמרחק המולקולרי (20 Å) בין שאריות הטרפ ל- ANS נראה תומך בהתרחשות של FRET (איור 1). שינוי כימי Trp על ידי NBS תוצאות פחות פלואורסצנטי N-תחום (איור 3B, ספקטרום f); לפיכך, הע?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה חלקית על ידי FAI-UASLP grant number C19-FAI-05-89.89 and CONACYT grant number 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). המחברים מודים לסיוע הטכני של ג'וליאן א. מאטה-מוראלס במהדורת וידאו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideBio-Rad1610107SDS-PAGE
Ammonium persulfateBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acidSigma-AldrichA1028Fluorophore
Bis-acrylamideBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Chemical modification
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker9213-12Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvetteHellmaZ801291Fluorescence assay
Fluorescence SpectrofluorometerShimadzuRF 5301PCFluorescence assay
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Protein purification
IPTG, Dioxane freeAmerican BionalyticalAB00841-00010Protein expression
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25GProtein purification
LB mediaFisher Scientific10000713Cell culture
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescence assay
Pipetman L P100LGilsonFA10004MFluorescence assay
Pipetman L P200LGilsonFA10005MFluorescence assay
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MFluorescence assay
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Fluorescence assay
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphateBio-Rad1610302SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasicJ.T. Baker3828-19Buffer preparation
Sodium phosphate monobasicJ.T. Baker3818-01Buffer preparation
Syringe filter 0.2 umMilliporeGVWP04700Solution filtration
TemedBio-Rad1610801SDS-PAGE
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE

References

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -. J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. . Protein Structure Prediction. , (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -. J., He, P. -. Y., Li, Y. -. M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved