重组卡2 +- 研究色氨酸 - ANS FRET 的色氨酸残留物的化学修饰 - ATPase N 域

摘要

ANS 与 Ca²⁺- ATPase 重组 N 域绑定。荧光光谱在激发时以 295 nm 的波长显示类似 FRET 的图案。NBS 调解的 Trp 化学修饰抑制了 N 域的荧光，这导致 Trp 残留物和 ANS 之间没有能量转移 （FRET）。

摘要

沙科/内质 Ca²⁺-ATPase （SERCA） 是一种 P 型 ATPase，在各种构象中结晶。尽管如此，仍可从孤立的重组域获取详细的功能信息。工程 （Trp552Leu 和 Tyr587Trp） 重组核苷酸绑定域 （N 域） 显示配体绑定后荧光淬火。一种外在的氟磷，即8-阿尼利诺-1-纳布他烯硫酸盐（ANS），通过静电和疏水性与阿格、赫斯、阿拉、卢和菲残留物的相互作用，与核苷酸结合。当兴奋的波长（+）为370纳米时，荧光强度的增加就证明了ANS的结合。然而，当兴奋在 \295 nm 时，荧光强度的增加似乎与 N 域内在荧光的淬火相伴而生。荧光光谱显示一个类似Föster共振能量转移（FRET）的模式，从而暗示了Trp-ANS FRET对的存在，这似乎由Tyr587Trp和ANS之间的短距离（+20+）支撑。本研究描述了由 N-溴素酰胺 （NBS）调解的 Trp-ANS FRET 对的 Trp 化学修饰（和荧光淬火）分析。在化学改性 N 域中，ANS 荧光在 295 nm 的兴奋时增加，类似于在 370 nm 时兴奋时增加。因此，NBS 调解的 Trp 残留物的化学修饰可用于探索 Trp 和 ANS 之间缺乏 FRET。在没有TRP荧光的情况下，不应观察ANS荧光的增加。NBS 对蛋白质中的 Trp 残留物进行化学修饰可能有助于检查接近绑定 ANS 的 Trp 残留物之间的 FRET。这种检测在使用其他氟化物时可能也很有用。

引言

Füster共振能量转移（FRET）已成为确定分子结构之间的距离后，结合或相互作用的蛋白质结构和功能研究^{1，2，3，4}的标准技术。在P型ATPases中，FRET被用来研究SARCO内质视网膜Ca 2+-ATPase（SERCA）2、5、6、7、8的结构波动，例如，FRET⁷对整个蛋白质的结构波动进行了分析。

FRET捐赠者是多种多样的，从小荧光（外在）分子到荧光蛋白^9，10。色氨酸（Trp）残留物（由于其荧光）有助于识别蛋白质氨基酸序列^11，12....

研究方案

1. 确定（在西里科）的ANS和SERCAN域互动

1. 使用首选的蛋白质建模软件⁵⁰进行分子建模，生成蛋白质（SERCA N-Domain）的三维（3D）结构。
2. 使用首选分子结构软件⁵¹识别形成核苷酸结合位点的氨基酸残留物，确定Arg和Lys残留物^的存在：这些是ANS结合和增加荧光强度（量子产量）所必需的。
3. 执行分子对接（使用首选对接软件）52，53，54，以确定ATP，荧光素异氰酸酯（FITC）（与Lys515标记核苷酸结合站点）和ANS与氨基酸残留物在核苷酸结合场（图1）的相互作用。
4. 使用首选软件中的测量工具计算 Trp 残留物和绑定 ANS 之间的分子距离 （+） 。
5. 对ANS-N域复合物进行分子动力学模拟，以确定相互作用的稳定性52，54。然后，在确认复合物的稳定性时进行体外实验。
....

结果

分子对接显示ANS通过静电和疏水相互作用与N域核苷酸结合部位的结合（图1）。Trp 残留物和 ANS（与核苷酸结合部位）之间的分子距离 （20+） 支持 FRET 的发生（图1）。设计（工程）重组N域通过亲和色谱仪（图2）获得高纯度，适合荧光实验。ANS-N 域复合物的荧光光谱在激发时显示类似 FRET 的图案，频率为 ±295 nm（?.......

讨论

ANS-N 域复合物的荧光光谱在 295 nm 的兴奋时显示类似 FRET 的模式，而 Trp 残留物和 ANS 之间的分子距离 （20 +） 似乎支持 FRET 的发生（图1）。NBS 的 Trp 化学修饰导致荧光 N 域变小（图 3B，频谱 f）：因此，能量转移是不可能的。ANS 荧光光谱与未修改的 N 域相似，当兴奋在 295 nm （图 3A 和 C）时。

因.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Bio-Rad	1610107	SDS-PAGE
Ammonium persulfate	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid	Sigma-Aldrich	A1028	Fluorophore
Bis-acrylamide	Bio-Rad	1610125	SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide	Sigma-Aldrich	B81255	Chemical modification
N,N-dimethylformamide	J.T. Baker	9213-12	Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F7250	Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette	Hellma	Z801291	Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer	Shimadzu	RF 5301PC	Fluorescence assay
HisTrap™ FF	GE Healtcare	11-0004-59	Protein purification
IPTG, Dioxane free	American Bionalytical	AB00841-00010	Protein expression
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G	Protein purification
LB media	Fisher Scientific	10000713	Cell culture
Pipetman L P10L	Gilson	FA10002M	Fluorescence assay
Pipetman L P100L	Gilson	FA10004M	Fluorescence assay
Pipetman L P200L	Gilson	FA10005M	Fluorescence assay
Pipetman L P1000L	Gilson	FA10006M	Fluorescence assay
Pipetman L P5000L	Gilson	FA10007	Fluorescence assay
Precision plus std	Bio-Rad	1610374	SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate	Bio-Rad	1610302	SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic	J.T. Baker	3828-19	Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic	J.T. Baker	3818-01	Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um	Millipore	GVWP04700	Solution filtration
Temed	Bio-Rad	1610801	SDS-PAGE
Tris	Bio-Rad	1610719	SDS-PAGE