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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

ANS si lega al dominio N ricombinante Ca2+-ATPasi. Gli spettri di fluorescenza mostrano un modello simile a FRET all'eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nm. La modifica chimica mediata da NBS di Trp spegne la fluorescenza del dominio N, che porta all'assenza di trasferimento di energia (FRET) tra il residuo Trp e ANS.

Abstract

Il reticolo sarco/endoplasmatico Ca2+-ATPasi (SERCA) è un'ATPasi di tipo P che è stata cristallizzata in varie conformazioni. Informazioni funzionali dettagliate possono tuttavia essere ottenute da domini ricombinanti isolati. Il dominio di legame nucleotidico ricombinante (Trp552Leu e Tyr587Trp) ingegnerizzato (dominio N) mostra una tempra di fluorescenza al legame del ligando. Un fluoroforo estrinseco, vale a dire 8-anilino-1-naftalene solfonato (ANS), si lega al sito di legame nucleotidico tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche con residui di Arg, His, Ala, Leu e Phe. Il legame ANS è evidenziato dall'aumento dell'intensità di fluorescenza quando eccitato ad una lunghezza d'onda (λ) di 370 nm. Tuttavia, quando eccitato a λ di 295 nm, l'aumento dell'intensità della fluorescenza sembra essere accoppiato alla tempra della fluorescenza intrinseca del dominio N. Gli spettri di fluorescenza mostrano un modello simile al trasferimento di energia di risonanza di Föster (FRET), suggerendo così la presenza di una coppia Trp-ANS FRET, che sembra essere supportata dalla breve distanza (~ 20 Å) tra Tyr587Trp e ANS. Questo studio descrive un'analisi della coppia Trp-ANS FRET mediante modificazione chimica Trp (e tempra a fluorescenza) mediata da N-bromosuccinimide (NBS). Nel dominio N chimicamente modificato, la fluorescenza ANS aumentava quando eccitata a λ di 295 nm, simile a quando eccitata a λ di 370 nm. Quindi, la modifica chimica mediata da NBS del residuo Trp può essere utilizzata per sondare l'assenza di FRET tra Trp e ANS. In assenza di fluorescenza Trp, non si dovrebbe osservare un aumento della fluorescenza ANS. La modifica chimica dei residui di Trp nelle proteine da parte di NBS può essere utile per esaminare FRET tra residui di Trp che sono vicini all'ANS legato. Questo test sarà probabilmente utile anche quando si utilizzano altri fluorofori.

Introduzione

Il trasferimento di energia di risonanza di Föster (FRET) è diventato una tecnica standard per determinare la distanza tra le strutture molecolari dopo il legame o l'interazione negli studi di struttura e funzione delle proteine1,2,3,4. Nelle ATPasi di tipo P, FRET è stato utilizzato per studiare la struttura e la funzione del reticolo sarco-endoplasmatico Ca2+-ATPasi (SERCA)2,5,6,7,8, ad esempio, le fluttuazioni strutturali durante il ciclo catalitico sono state analizzate nell'intera proteina da FRET7.

I donatori di FRET sono diversi e vanno da piccole molecole fluorescenti (estrinseche) a proteine fluorescenti9,10. I residui di triptofano (Trp) (dovuti alla loro fluorescenza) sono utili per identificare i cambiamenti strutturali nelle sequenze di aminoacidi proteici11,12. L'intensità di fluorescenza del Trp dipende sostanzialmente dalla polarità dell'ambientecircostante13,14. Il legame del ligando di solito genera riarrangiamenti strutturali inproteine/enzimi 15,16. Se Trp è presente o situato vicino al sito di legame proteico, le fluttuazioni strutturali influenzano frequentemente il grado di esposizione di Trp ai mezzi acquosi13,14; quindi, il cambiamento di polarità provoca l'tempra dell'intensità di fluorescenza Trp13,14. Quindi, la proprietà fluorescente di Trp è utile per eseguire studi di legame del ligando per gli enzimi. Altri fenomeni fisici possono anche portare alla tempra di fluorescenza Trp17,18,19,20, ad esempio, FRET e cambiamenti nella polarità media. Il trasferimento di energia dallo stato eccitato di Trp a un fluoroforo ha anche potenziali applicazioni, ad esempio la determinazione dell'affinità di piccoli ligandi nelle proteine21. Infatti, Trp è stato utilizzato principalmente come donatore di fluorescenza negli studi FRET nelle proteine22,23,24, ad esempio, negli studi FRET sul terbio (Tb3 +),un residuo Trp viene utilizzato frequentemente come antenna per il trasferimento di energia a Tb3 +25,26,27. Trp mostra vari vantaggi rispetto ad altri donatori di FRET a causa del suo carattere costitutivo intrinseco nella struttura proteica, che elimina la necessità di processi preparativi che possono influenzare la funzione / struttura della proteina24studiata. Pertanto, l'identificazione dei decadimenti radiativi (trasferimento di energia e cambiamenti nella polarità media indotti da riarrangiamenti strutturali proteici) è importante per trarre conclusioni accurate sul legame del ligando negli studi strutturali sulle proteine13,14,19,28.

Negli studi strutturali sulle proteine, un fluoroforo estrinseco, vale a dire 8-anilino-1-naftalene solfonato (ANS), è stato utilizzato principalmente in esperimenti relativi al ripiegamento / dispiegamento delle proteine28,29. ANS si lega a proteine/enzimi allo stato nativo, solitamente nei siti di legame dei substrati31,32,33; un aumento della resa quantistica di fluorescenza ANS (ΦF) (vale a dire, un aumento dell'intensità di fluorescenza) è indotto dall'eccitante proteina a λ = 370 nm quando si verificano interazioni adeguate di ANS con Arg e i suoi residui in tasche idrofobiche34,35,36,37. In vari studi, è stata segnalata la presenza di FRET (quando eccitante a λ entro 280-295 nm) tra residui di Trp (donatori) e ANS (accettore), che si basa su quanto segue: 1) sovrapposizione dello spettro di emissione di fluorescenza di Trp e spettro di eccitazione di ANS, 2) identificazione di una distanza adeguata tra uno o più residui di Trp e ANS per il trasferimento di energia, 3) elevata resa quantistica ANS quando legata in sacche proteiche, e 4) pattern FRET caratteristico negli spettri di fluorescenza della proteina in presenza di ANS3,17,27,37,38.

Recentemente, il legame del ligando al dominio di legame nucleotidico (dominio N) in SERCA e altre ATPasi di tipo P sono stati studiati utilizzando N-domini N ricombinanti ingegnerizzati40,41,42,43,44,45,46. L'ingegneria molecolare del dominio N SERCA è stata utilizzata per spostare l'unico residuo Trp (Trp552Leu) in una struttura più dinamica (Tyr587Trp) che è vicina al sito di legame nucleotidico, dove le variazioni di fluorescenza (tempra) possono essere utilizzate per monitorare i cambiamenti strutturali sul legame del ligando34. I risultati sperimentali hanno dimostrato che ANS si lega (come ATP) al sito di legame nucleotidico nel ricombinante purificato SERCA N-domain34. È interessante notare che la fluorescenza ANS aumenta quando si lega al dominio N all'eccitazione a un λ di 295 nm, mentre la fluorescenza intrinseca del dominio N diminuiscedi 34, producendo così un modello FRET che suggerisce la formazione di una coppia Trp-ANS FRET.

L'uso di NBS è stato proposto per determinare il contenuto di residui di Trp nelle proteine47 mediante il saggio di assorbanza di proteine modificate. NBS modifica il gruppo indolo altamente assorbente di Trp al meno assorbenteossindolo 47,48. Ciò si traduce nella perdita (spegnimento) della proprietà fluorescente Trp40. Quindi, la modifica chimica mediata da NBS dei residui di Trp può essere utilizzata come saggio per definire il ruolo di Trp (come donatore) quando si ipotizza FRET.

Questo protocollo descrive la modifica chimica dell'unico residuo di Trp da parte di NBS nel dominio N ricombinante ingegnerizzato di SERCA come modello proteico. I risultati sperimentali dimostrano che l'intensità di fluorescenza ANS aumenta ancora nel dominio N34modificato chimicamente NBS, che manca di fluorescenza intrinseca. Pertanto, il saggio è utile per dimostrare l'assenza di FRET tra il residuo Trp e ANS quando legato al dominio N34,40,49. Quindi, questo test (modifica chimica NBS di Trp) è utile per dimostrare la presenza della coppia Trp-ANS FRET nelle proteine.

Protocollo

1. Determinazione (in silico) dell'interazione ANS e SERCA N-dominio

  1. Generare una struttura tridimensionale (3D) della proteina (SERCA N-domain) mediante modellazione molecolare utilizzando il software di modellazione proteica preferito50.
  2. Identificare i residui di amminoacidi che formano il sito di legame nucleotidico utilizzando il software di struttura molecolarepreferito 51e determinare la presenza di residui di Arg e Lys35; questi sono necessari per il legame ANS e per aumentare l'intensità di fluorescenza (resa quantistica).
  3. Eseguire l'attracco molecolare (utilizzando il software di docking preferito)52,53,54 per determinare le interazioni di ATP, isotiocianato di fluoresceina (FITC) (che forma un legame covalente con Lys515 che etichetta il sito di legame nucleotidico) e ANS con residui di amminoacidi nel sito di legame nucleotidico ( Figura1).
  4. Calcolare la distanza molecolare (Å) tra il residuo Trp e l'ANS legato utilizzando lo strumento di misurazione nel software preferito.
  5. Eseguire simulazioni di dinamica molecolare del complesso ANS-N-dominio per determinare la stabilità dell'interazione52,54. Quindi, eseguire gli esperimenti in vitro quando la stabilità del complesso è stata confermata.

2. Espressione e purificazione del dominio N ricombinante

  1. Sintetizzare il gene che codifica per il dominio N40.
  2. Progettare e costruire il plasmide che contiene il gene sintetico che codifica per il dominio N40.
  3. Esprimere e purificare mediante cromatografia di affinità (Ni-NTA), il dominio N ricombinante ingegnerizzato. Eseguire una SDS-PAGE della proteina purificata per determinarne la purezza (Figura 2)40.
  4. Determinare la concentrazione proteica studiando l'assorbanza a λ di 280 nm con il coefficiente di estinzione del dominio N (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.

3. Monitorare la formazione del complesso ANS-N-dominio in base alle variazioni di intensità di fluorescenza ANS e N-dominio.

  1. Preparare una soluzione stock ANS in N,N-dimetilformammide.
    1. Pesare una piccola quantità (1-5 mg) di ANS e scioglierla in 1 mL del volume finale di N,N-dimetilformammide, ad esempio 3,2 mg (concentrazione finale di 10,69 mM).
    2. Preparare una soluzione stock acquosa ANS da 100 μM utilizzando la soluzione ANS in N,N-dimetilformammide, ad esempio, aggiungere 9,4 μL della soluzione ANS da 10,69 mM a 990,6 μL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 per ottenere un volume finale di 1 mL.
    3. Mescolare le soluzioni vorticosamente 3 - 5 volte per 15 s.
      NOTA: nell'esperimento seguente, utilizzare solo la soluzione stock acquosa ANS. Preparare al fresco la soluzione stock acquosa ANS prima di iniziare gli esperimenti.
  2. Preparare la soluzione stock NBS in N,N-dimetilformammide.
    1. Pesare una piccola quantità (1-5 mg) di NBS e scioglierla in 1 mL di N,N-dimetilformammide, ad esempio 5,3 mg in 1 mL (29,78 mM di concentrazione finale).
    2. Preparare una soluzione stock acquosa NBS da 1 mM utilizzando la soluzione NBS in N,N-dimetilformammide, ad esempio, aggiungere 3,36 μL della soluzione NBS da 29,78 mM a 96,64 μL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 per ottenere un volume finale di 0,1 mL.
    3. Mescolare le soluzioni vorticosamente 3 - 5 volte per 15 s.
      NOTA: Preparare nuovamente la soluzione stock acquosa NBS prima di iniziare gli esperimenti.
  3. Titolare il dominio N con ANS e registrare gli spettri di fluorescenza per eccitazione a λ=295 nm a 25 °C.
    1. Ottenere la linea di base dello spettro di fluorescenza.
      1. Posizionare 1 mL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 in una cuvetta di quarzo a fluorescenza da 1 mL.
      2. Posizionare la cella nella camera cellulare termo-dichiarata (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.
      3. Registrare lo spettro di fluorescenza (305 - 550 nm).
        NOTA: Lo spettro di fluorescenza del tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0, che funge da campione in bianco, viene sottratto da tutti gli spettri di fluorescenza ottenuti.
    2. Ottenere lo spettro di fluorescenza intrinseco del dominio N.
      1. Posizionare 900 μL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 in una cuvetta di quarzo a fluorescenza.
      2. Aggiungere 100 μL di sospensione di N-dominio (10 μM) per ottenere una concentrazione finale di 1 μM N-dominio in un volume finale di 1 mL.
      3. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta 20 volte per garantire l'omogeneità della soluzione.
        NOTA: La proteina deve essere purificata di fresco per ottenere spettri di fluorescenza intrinseca di alta qualità, ad esempio, il dominio N ricombinante purificato può essere utilizzato solo per una settimana dopo la purificazione.
      4. Posizionare la cella nella camera cellulare termo-dichiarata (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.
      5. Registrare lo spettro di fluorescenza intrinseca del dominio N (305-550 nm).
    3. Aggiungere ANS e ottenere lo spettro di fluorescenza per eccitazione a λ=295 nm.
      1. Aggiungere un'aliquota di 2 μL di soluzione acquosa acquosa di 100 μM al dominio N sospeso (1 μM) per ottenere una concentrazione finale di ANS di 0,2 μM.
      2. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta 20 volte per garantire l'omogeneità della soluzione.
      3. Posizionare la cella nella camera cellulare termostudente (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.
      4. Registrare lo spettro di fluorescenza (305-550 nm).
      5. Ripetere le aggiunte ANS e gli spettri di fluorescenza registrando sopra la relazione molare 1:1 ANS:N-dominio.
      6. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.
      7. Traccia tutti gli spettri in un unico grafico.
      8. Determinare se gli spettri formano un modello simile a FRET. Gli spettri di fluorescenza del dominio ANS-N formano un modello simile a FRET (Figura 3A).

4. Titolazione a fluorescenza intrinseca N-dominio mediante modificazione chimica Trp con NBS.

  1. Ripetere i passaggi 3.3.1 e 3.3.2.
  2. Aggiungere un'aliquota di 1 μL di 1 mM NBS soluzione acquosa allo S-dominio N sospeso (1 μM) per ottenere una concentrazione finale di 1 μM NBS.
  3. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta 20 volte per garantire l'omogeneità della soluzione.
  4. Posizionare la cella nella camera cellulare termostudente (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.
  5. Registrare lo spettro di fluorescenza (305-550 nm) (Figura 3B).
  6. Ripetere l'addizione NBS e la registrazione degli spettri di fluorescenza fino a quando non si osserva una minima tempra intrinseca di fluorescenza del dominio N40. Nel dominio N, questo di solito si verifica ad un rapporto molare di 5-6 NBS / N-dominio40.
    NOTA: NBS spegne rapidamente (<5 s) la fluorescenza intrinseca del dominio N; si osserva una diminuzione dell'intensità di fluorescenza. Procedere immediatamente al passaggio successivo, poiché NBS può anche reagire con altri residui di amminoacidi47.
  7. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.
  8. Tracciare tutti gli spettri in un unico grafico (Figura 3B).

5. Titolare il dominio N modificato da NBS con ANS registrando spettri di fluorescenza a 25 °C.

  1. Eseguire il passaggio 3.3.3 utilizzando il dominio N modificato NBS generato nel passaggio 4.
  2. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.
  3. Tracciare tutti gli spettri in un unico grafico (Figura 3C).
  4. Gli spettri di fluorescenza generati (Figura 3C) supportano o confutano il verificarsi di FRET, cioè quando si verifica FRET, la fluorescenza ANS non aumenta e viceversa.

6. Evidenza del legame di ANS al dominio N chimicamente modificato mediante eccitazione a λ=370 nm.

  1. Eseguire il passaggio 3.3.3 utilizzando il dominio N modificato NBS generato nel passaggio 4, ma modificando l'eccitazione λ in 370 nm.
  2. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.
  3. Tracciare tutti gli spettri in un unico grafico (Figura 3D).
  4. Confermare il legame ANS al dominio N osservando l'aumento dell'intensità di fluorescenza ANS. Il legame ANS al dominio N mostra un aumento della fluorescenza quando eccitato a λ=370 nm (Figura 3D). Come controllo, lo spettro di fluorescenza di ANS (da solo) in tampone fosfato 50 mM con pH 8,0 è stato ottenuto eccitante a λ di 295 e 370 nm (Figura 4, non mostrato in video).
    NOTA: La relazione stechiometrica di NBS:Trp necessaria per la modifica chimica dipende dal grado di interramento dei residui di Trp nella proteina in studio46,47,55,56. Pertanto, si raccomanda di determinare in anticipo il rapporto molare NBS:proteina/(Trp).

Risultati

L'attracco molecolare mostra il legame di ANS al sito di legame nucleotidico del dominio N tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche (Figura 1). La distanza molecolare (20 Å) tra il residuo di Trp e ANS (legato al sito di legame nucleotidico) supporta la presenza di FRET (Figura 1). Il dominio N ricombinante progettato (ingegnerizzato) è stato ottenuto ad alta purezza mediante cromatografia ad affinità (Figura 2) ed era a...

Discussione

Gli spettri di fluorescenza del complesso ANS-N-domain mostrano un pattern simile a FRET quando eccitati ad un λ di 295 nm, mentre la distanza molecolare (20 Å) tra il residuo Trp e ANS sembra supportare l'insorgenza di FRET (Figura 1). La modifica chimica Trp da parte di NBS si traduce in un dominio N meno fluorescente (Figura 3B, Spettro f); quindi, il trasferimento di energia non è possibile. Gli spettri di fluorescenza ANS sono simili a quelli del dominio...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal numero di sovvenzione FAI-UASLP C19-FAI-05-89.89 e dal numero di sovvenzione CONACYT 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Gli autori ringraziano l'assistenza tecnica di Julian E. Mata-Morales in edizione video.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideBio-Rad1610107SDS-PAGE
Ammonium persulfateBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acidSigma-AldrichA1028Fluorophore
Bis-acrylamideBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Chemical modification
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker9213-12Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvetteHellmaZ801291Fluorescence assay
Fluorescence SpectrofluorometerShimadzuRF 5301PCFluorescence assay
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Protein purification
IPTG, Dioxane freeAmerican BionalyticalAB00841-00010Protein expression
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25GProtein purification
LB mediaFisher Scientific10000713Cell culture
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescence assay
Pipetman L P100LGilsonFA10004MFluorescence assay
Pipetman L P200LGilsonFA10005MFluorescence assay
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MFluorescence assay
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Fluorescence assay
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphateBio-Rad1610302SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasicJ.T. Baker3828-19Buffer preparation
Sodium phosphate monobasicJ.T. Baker3818-01Buffer preparation
Syringe filter 0.2 umMilliporeGVWP04700Solution filtration
TemedBio-Rad1610801SDS-PAGE
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE

Riferimenti

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