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要約

ANSはCa2+-ATPase組換えNドメインに結合する。蛍光スペクトルは、295nmの波長で励起時にFRET様パターンを表示します。TrpのNBS媒介化学修飾は、Nドメインの蛍光を発し、Trp残基とANSとの間のエネルギー移動(FRET)の欠如をもたらす。

要約

サルコ/小胞体Ca2+-ATPase(SERCA)は、様々な立体構造で結晶化されたP型ATPaseです。それにもかかわらず、詳細な機能情報は、分離組換えドメインから得ることができる。この組み換えヌクレオチド結合ドメイン(N-ドメイン)は、リガンド結合時に蛍光消光を表示する(Trp552LeuおよびTyr587Trp)。外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、アルグ、ヒス、アラ、ルー、およびPhe残基との静電および疎水性相互作用を介してヌクレオチド結合部位に結合する。ANS結合は、370nmの波長(λ)で励起された場合の蛍光強度の増加によって証明される。しかし、295nmのλで励起すると、蛍光強度の増加は、Nドメイン固有蛍光の急行に結合されるようである。蛍光スペクトルは、フェスター共鳴エネルギー伝達(FRET)様のパターンを示し、Trp-ANS FRETペアの存在を示唆し、Tyr587TrpとANSの間の短距離(〜20Å)によって支持されているように見える。本研究では、N-ブロモスハクイミド(NBS)によって媒介されるTrp化学修飾(および蛍光焼入れ)によるTrp-ANS FRET対の分析について説明する。化学修飾N-ドメインでは、ANS蛍光は295nmのλで励起されると増加し、λ370nmで励起された場合と同様である。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、TrpとANSの間のFRETの不在をプローブするために使用することができる。Trp蛍光がない場合、ANS蛍光の増加を観察すべきではありません。NBSによるタンパク質中のTrp残基の化学修飾は、結合ANSに近いTrp残基間のFRETを調べるのに有用であり得る。このアッセイは、他の蛍光ホルを使用する場合にも有用である可能性が高い。

概要

フェスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質構造および機能研究1、2、3、4における結合または相互作用後の分子構造間の距離を決定するための標準的な技術となっている。P型ATPAでは、FRETはサルコ・エンデュラム・Ca2+-ATPase(SERCA)2、5、6、7、8、例えば、FRET7によってタンパク質全体の構造と機能を調べるのに用いられている。

FRETドナーは多様であり、小さな蛍光(外因性)分子から蛍光タンパク質9,10まで多岐にわたります。トリプトファン(Trp)残基(蛍光による)は、タンパク質アミノ酸配列11,12の構造変化を同定するのに有用である。Trpの蛍光強度は、周囲の環境13,14の極性に大きく依存する。リガンド結合は通常、タンパク質/酵素15,16において構造的な再配置を生じさせる。Trpがタンパク質結合部位に存在するか、または近くに位置する場合、構造変動は水性媒体13、14へのTrp曝露の程度にしばしば影響を及ぼす。したがって、極性の変化は、Trp蛍光強度13、14の焼入れをもたらす。したがって、Trpの蛍光特性は、酵素のリガンド結合研究を行う上で有用である。他の物理現象は、Trp蛍光17、18、19、20、例えば、FRETおよび中極性の変化を導く可能性がある。Trpの励起状態からフルオロフォアへのエネルギー伝達も潜在的な用途を有し、例えば、タンパク質21における小さなリガンドの親和性決定も可能である。実際、Trpは主にタンパク質22、23、24、例えばテルビウム(Tb3+)FRET研究においてFRET研究において蛍光ドナーとして使用されてきたが、Trp残基はTb3+25、26、27へのエネルギー伝達のためのアンテナとして頻繁に使用されている。Trpは、タンパク質構造におけるその固有の構成的特徴に起因する他のFRETドナーに対して様々な利点を示し、研究したタンパク質24の機能/構造に影響を与える可能性のある予備プロセスの必要性を排除する。したがって、放射崩壊の同定(エネルギー移動およびタンパク質構造再構成によって誘導される中極性の変化)は、タンパク質構造研究13、14、19、28におけるリガンド結合に関する正確な結論を導き出す上で重要である。

タンパク質構造研究において、外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、タンパク質のフォールディング/展開28,29に関連する実験に主に使用されてきた。ANSは、天然の状態でタンパク質/酵素に結合します, 通常、基質の結合部位で 31,32,33;ANS蛍光量子収量(ΦF)の増加(すなわち、蛍光強度の増加)は、疎水性ポケット内のArgおよびHis残基とのANSの適切な相互作用が34、35、36、37に生じたときにλ=370nmでタンパク質を励起することによって誘導される。様々な研究では、Trp残基(ドナー)とANS(アクセプター)の間のFRET(280-295 nm以内のλでエキサイティングな場合)の発生が報告されており、これは以下に基づいている:1)Trpの蛍光発光スペクトルとANSの励起スペクトルの重複、2)1つ以上のTrp残基(s)とANSの間の適切な距離の同定 3)タンパク質ポケットに結合したときの高いANS量子収率、および4)ANS3、17、27、37、38の存在下でタンパク質の蛍光スペクトルにおける特徴的なFRETパターン。

最近、SERCAおよび他のP型ATPasesにおけるヌクレオチド結合ドメイン(Nドメイン)へのリガンド結合は、40、41、42、43、44、45、46の組換え組換えNドメインを用いて検討されている。SERCA Nドメインの分子工学は、唯一のTrp残基(Trp552Leu)をヌクレオチド結合部位に近いより動的な構造(Tyr587Trp)に移動するために使用され、そこでは、リガンド結合時の構造変化(クエンチング)を使用して、リガンド結合時の構造変化を監視することができる。実験結果は、ANSが精製組換えSERCA N-domain34中のヌクレオチド結合部位に(ATPとして)結合することを実証した。興味深いことに、ANS蛍光は295nmのλで励起時にNドメインに結合すると増加し、Nドメインの固有蛍光は34を減少させ、それによってTrp-ANS FRETペアの形成を示唆するFRETパターンを産生する。

NBSの使用は、改変タンパク質の吸光度アッセイによりタンパク質47中のTrp残基の含有量を決定するために提案されている。NBSは、Trpの吸収性の高いインドール基を、吸収性の低いオキシインドール47、48に変更する。これは、Trp蛍光性40の損失(クエンチング)をもたらす。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、FRETが仮説を立てられたときのTrp(ドナーとしての)役割を定義するアッセイとして使用され得る。

このプロトコルは、タンパク質モデルとしてSERCAの組換えN-ドメインを設計したN-ドメインにおけるNBSによる唯一のTrp残基の化学修飾を記述する。実験結果は、ANS蛍光強度が、本質的な蛍光を欠いている化学的にNBS修飾Nドメイン34において依然として増加することを示す。したがって、このアッセイは、N-ドメイン34、40、49に結合した場合にTrp残基とANSの間にFRETの欠如を実証するのに有用である。したがって、このアッセイ(TRPのNBS化学修飾)は、タンパク質中のTrp-ANS FRETペアの存在を証明するのに有用である。

プロトコル

1. ANSとSERCA Nドメイン相互作用の決定(インシリコで)

  1. 好ましいタンパク質モデリングソフトウェア50を用いて分子モデリングによりタンパク質の3次元(3D)構造を生成する。
  2. 好ましい分子構造ソフトウェア51を用いてヌクレオチド結合部位を形成するアミノ酸残基を特定し、ArgおよびLys残基35の存在を決定する。これらは、ANS結合および蛍光強度(量子収率)を増加させるために必要とされる。
  3. 分子ドッキング(好ましいドッキングソフトウェアを使用して)52、53、54を用いてATP、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(ヌクレオチド結合部位を標識するLys515との共有結合を形成する)と、ヌクレオチド結合部位におけるアミノ酸残基を有するANSとの相互作用を決定する(図1)。
  4. 好ましいソフトウェアの測定ツールを使用して、Trp残基と結合ANSの間の分子距離(Å)を計算します。
  5. ANS-N-ドメイン複合体の分子動力学シミュレーションを行い、相互作用の安定性を決定する52,54.次いで、複合体の安定性が確認された場合にインビトロ実験を行う。

2. 組換えNドメインの発現と精製

  1. N-ドメイン40の遺伝子コードを合成する。
  2. N-ドメイン40をコードする合成遺伝子を含むプラスミドを設計し、構築する。
  3. アフィニティークロマトグラフィー(Ni-NTA)によって発現精製し、組換えN-ドメインを設計した。精製したタンパク質のSDS-PAGEを行い、純度を決定する(図2)40。
  4. N-ドメインの消滅係数(ε= 11,960 M-1・cm-1)40で280nmのλでの吸光度を調べてタンパク質濃度を決定する。

3. ANSとN-ドメインの蛍光強度変化に基づいて、ANS-N-ドメイン複合体の形成を監視します。

  1. N、N-ジメチルホルムアミドでANSストック溶液を調製する。
    1. 少量(1〜5mg)のANSを秤量し、最終体積のN、N-ジメチルホルムアミド、例えば3.2mg(10.69mM最終濃度)の1mLに溶解する。
    2. N、N-ジメチルフォルマミド、例えばpH 8.0の990.6 μLの50 mMリン酸緩衝液に10.69 mM ANS溶液の9.4 μLを加えて、100μM ANS水溶液を調製し、最終体積1mLを得る。
    3. 15 sの場合は3~5回のボルテックスで溶液を混ぜます。
      注: 次の実験では、ANS 水溶液溶液のみを使用します。実験を開始する前に、ANS水性ストック溶液を新たに調製してください。
  2. NBSストック溶液をN,N-ジメチルホルムアミドで調製する。
    1. 少量(1〜5mg)のNBSを秤量し、それを1mLのN、N-ジメチルホルムアミド、例えば1mL(29.78 mM最終濃度)で5.3mgに溶解する。
    2. N、N-ジメチルフォルマミド、例えば、pH 8.0の90.64 μLの90mリン酸緩衝液に29.78 mM NBS溶液の3.36 μLを加えて、最終容積0.1mLを得るために、N、N-ジメチルフォルマミドのNBS溶液を使用して1 mM NBS水性ストック溶液を調製します。
    3. 15 sの場合は3~5回のボルテックスで溶液を混ぜます。
      注:実験を開始する前に、NBS水溶液を新たに準備してください。
  3. N-ドメインをANSで評価し、25°Cでλ=295nmで励起して蛍光スペクトルを記録する。
    1. 蛍光スペクトルベースラインを取得する。
      1. 1 mL の蛍光クオーツ キュベットに pH 8.0 と 50 mM リン酸バッファーの 1 mL を入れます。
      2. 分光フルオロメーターの熱述式セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。
      3. 蛍光スペクトル(305-550nm)を記録する。
        注: pH 8.0 の 50 mM リン酸バッファーの蛍光スペクトルは、pH 8.0 で、得られたすべての蛍光スペクトルから差し引かれます。
    2. Nドメインの本来の蛍光スペクトルを取得する。
      1. 蛍光クォーツキュベットにpH 8.0の50 mMリン酸バッファーの900 μLを入れます。
      2. N-ドメイン(10 μM)のサスペンションを100 μL加えて、1 mL最終ボリュームに1μM Nドメイン最終濃度を得ます。
      3. 溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを20回使用して穏やかに均質化する。
        注:タンパク質は、高品質の固有蛍光スペクトルを得るために精製されたばかりで、例えば、精製組換えNドメインは、精製後1週間だけ使用することができる。
      4. 分光フルオロメーターの熱述式セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。
      5. Nドメイン固有蛍光スペクトル(305〜550nm)を記録する。
    3. ANSを追加し、λ=295 nmで励起して蛍光スペクトルを得る。
      1. 100 μM ANS水系ストック溶液の2 μL アリコートを、懸濁 N ドメイン(1 μM)に加え、0.2 μM ANS 最終濃度を得ます。
      2. 溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを20回使用して穏やかに均質化する。
      3. 分光フルオロメーターの熱安定セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。
      4. 蛍光スペクトル(305-550 nm)を記録する。
      5. ANSの追加と蛍光スペクトル記録を1:1モル関係ANS:Nドメイン以上に繰り返します。
      6. 適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。
      7. すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。
      8. スペクトルがFRETのようなパターンを形成しているかどうかを判断します。ANS-N-ドメイン蛍光スペクトルは、FRET様パターンを形成する(図3A)。

4. N-ドメイン内の蛍光の組み込み Trp 化学修飾による NBS.

  1. ステップ 3.3.1 と 3.3.2 を繰り返します。
  2. 1 mM NBS水性ストック溶液の1 μLアリコートを懸濁Nドメイン(1 μM)に加え、1 μM NBSの最終濃度を得ます。
  3. 溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを20回使用して穏やかに均質化する。
  4. 分光フルオロメーターの熱安定セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。
  5. 蛍光スペクトル(305-550 nm)を記録する(図3B)。
  6. N-domain固有蛍光クエンチが40を観察するまで、NBS付加および蛍光スペクトル記録を繰り返す。N ドメインでは、通常、この現象は 5-6 NBS/N ドメイン40のモル比で発生します。
    注:NBSは急速に(<5 s)Nドメインの内在蛍光をクエンチ;蛍光強度の低下が観察される。NBSが他のアミノ酸残基47と反応し得るように、直ちに次のステップに進む。
  7. 適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。
  8. すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします (図 3B)。

5. 蛍光スペクトルを25°Cで記録することにより、NBS修飾NドメインをANSで活性化する。

  1. ステップ 4 で生成された NBS 変更 N ドメインを使用して、ステップ 3.3.3 を実行します。
  2. 適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。
  3. すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします (図 3C)。
  4. 生成された蛍光スペクトル(図3C)は、FRETの発生を支持または反論する、すなわち、FRETが発生した場合、ANS蛍光は増加しないし、その逆もまた同様である。

6. λ=370 nmでの励起により化学修飾NドメインにANS結合の証拠。

  1. ステップ 4 で生成された NBS 修正 N ドメインを使用してステップ 3.3.3 を実行しますが、励起 λを 370 nm に変更します。
  2. 適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。
  3. すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします (図 3D)。
  4. ANS蛍光強度の増加を観察することにより、Nドメインに結合するANSを確認する。Nドメインに結合するANSは、λ=370nmで励起されると蛍光増加を示す(図3D)。対照として、pH 8.0を有する50mMリン酸緩衝液中のANS(単独)の蛍光スペクトルは、λ295および370nmでエキサイティングな取得された(図4、ビデオには示されていない)。
    注:化学修飾に必要なNBS:Trpの化学論的関係は、研究46、47、55、56の下でタンパク質中のTrp残基の埋め込みの程度に依存します。したがって、事前にNBS:タンパク質/(Trp)モル比を決定することをお勧めします。

結果

分子ドッキングは、静電および疎水性相互作用を介したNドメインのヌクレオチド結合部位へのANSの結合を示す(図1)。Trp残基とANS(ヌクレオチド結合部位に結合)との間の分子距離(20Å)は、FRETの発生をサポートする(図1)。この設計された(設計された)組換えN-ドメインは、アフィニティークロマトグラフィー(図2)により高純度で?...

ディスカッション

ANS-Nドメイン複合体の蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された場合にFRET様パターンを表示し、一方、Trp残基とANSとの間の分子距離(20Å)はFRETの発生を支持しているようだ(図1)。NBSによるTrp化学修飾は、蛍光Nドメインの低下をもたらす(図3B、スペクトラムf)。したがって、エネルギー転送は不可能です。ANS蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された非?...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

この作品は、FAI-UASLP助成金番号C19-FAI-05-89.89およびCONACYT助成金番号316463(アポヨス・ア・ラ・シエンシア・デ・フロンテーラ:フォルタレシミエント・イ・マンテニミエント・デ・インシュタエンストラス・デ・インベスティガシオン・デ・ウソ・コンン・イ・カパシタシオン・テクニツァン)によって部分的に資金提供されました。著者らは、ビデオ版でジュリアン・E・マタ・モラレスの技術的支援に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcrylamideBio-Rad1610107SDS-PAGE
Ammonium persulfateBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acidSigma-AldrichA1028Fluorophore
Bis-acrylamideBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimideSigma-AldrichB81255Chemical modification
N,N-dimethylformamideJ.T. Baker9213-12Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvetteHellmaZ801291Fluorescence assay
Fluorescence SpectrofluorometerShimadzuRF 5301PCFluorescence assay
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Protein purification
IPTG, Dioxane freeAmerican BionalyticalAB00841-00010Protein expression
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25GProtein purification
LB mediaFisher Scientific10000713Cell culture
Pipetman L P10LGilsonFA10002MFluorescence assay
Pipetman L P100LGilsonFA10004MFluorescence assay
Pipetman L P200LGilsonFA10005MFluorescence assay
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MFluorescence assay
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Fluorescence assay
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphateBio-Rad1610302SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasicJ.T. Baker3828-19Buffer preparation
Sodium phosphate monobasicJ.T. Baker3818-01Buffer preparation
Syringe filter 0.2 umMilliporeGVWP04700Solution filtration
TemedBio-Rad1610801SDS-PAGE
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE

参考文献

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -. J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. . Protein Structure Prediction. , (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -. J., He, P. -. Y., Li, Y. -. M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).

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