JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنية لرسم خرائط عالية الدقة لمواقع النسخ المتماثل في الكروماتين المحفوظ هيكليا في الموقع والذي يستخدم مزيجا من التضمين المسبق لوضع العلامات على EdU-streptavidin-Nanogold و ChromEMT.

Abstract

لا تزال مبادئ طي الحمض النووي في نواة الخلية وتحولاتها الديناميكية التي تحدث أثناء تحقيق الوظائف الجينية الأساسية (النسخ ، النسخ ، التكرار ، الفصل ، إلخ) غير مفهومة بشكل جيد ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود مناهج تجريبية للتصور عالي الدقة لمواقع كروماتين محددة في النوى المحفوظة هيكليا. نقدم هنا بروتوكولا لتصور المجالات التكرارية في زراعة الخلايا أحادية الطبقة في الموقع ، من خلال الجمع بين وضع العلامات EdU للحمض النووي المركب حديثا مع الكشف اللاحق عن الملصقات مع تضخيم Ag لجزيئات Nanogold وتلطيخ ChromEM للكروماتين. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات قبل التضمين عالية التباين والكفاءة العالية ، والمتوافقة مع تثبيت الجلوتارالدهيد التقليدي الذي يوفر أفضل حفظ هيكلي للكروماتين لمعالجة العينات في درجة حرارة الغرفة. ميزة أخرى لوضع العلامات قبل التضمين هي إمكانية التحديد المسبق للخلايا ذات الأهمية للتقسيم. هذا مهم بشكل خاص لتحليل مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، وكذلك التوافق مع نهج التصوير المقطعي الإلكتروني لتحليل 3D عالي الدقة لتنظيم الكروماتين في مواقع النسخ المتماثل ، وتحليل إعادة ترتيب الكروماتين بعد النسخ المتماثل وفصل الكروماتيد الشقيق في الطور البيني.

Introduction

تكرار الحمض النووي هو عملية بيولوجية أساسية مطلوبة للنسخ الأمين ونقل المعلومات الوراثية أثناء انقسام الخلايا. في حقيقيات النوى الأعلى ، يخضع تكرار الحمض النووي لتنظيم مكاني وزماني ضيق ، والذي يتجلى في التنشيط المتسلسل لأصول النسخ المتماثل1. تشكل أصول النسخ المتماثل المجاورة التي تطلق بشكل متزامن مجموعات من النسخ المتماثلة2. على مستوى المجهر الضوئي ، يتم الكشف عن مواقع تكرار الحمض النووي المستمر كبؤر تكرار مختلفة العدد والأحجام. تعرض بؤر النسخ المتماثل أنماطا محددة من التوزيع المكاني داخل نواة الخلية اعتمادا على توقيت تكرار الحمض النووي المسمى 3,4 ، والذي بدوره يرتبط ارتباطا وثيقا بنشاط جيناته. بفضل التسلسل المحدد جيدا لتكرار الحمض النووي ، الذي يتم ترتيبه بدقة في المكان والزمان ، يعد وضع العلامات التكرارية طريقة قوية لوضع العلامات الدقيقة على الحمض النووي ليس فقط لدراسة عملية النسخ المتماثل في حد ذاتها ، ولكن أيضا للتمييز بين جزء فرعي معين من الحمض النووي مع نشاط نسخ محدد ومستوى ضغط. عادة ما يتم تنفيذ تصور تكرار الكروماتين من خلال الكشف عن مكونات البروتين الرئيسية لآلات تكرار الحمض النووي (إما عن طريق التلطيخ المناعي أو عن طريق التعبير عن علامات البروتين الفلورسنت5,6) أو عن طريق دمج سلائف تخليق الحمض النووي المعدلة 7,8,9,10 . من بين هذه الطرق ، فقط الطرق القائمة على دمج النيوكليوتيدات المعدلة في الحمض النووي المكرر حديثا تسمح بالتقاط التغيرات التوافقية في الكروماتين أثناء النسخ المتماثل ، وتتبع سلوك المجالات التكرارية بعد اكتمال تكرارها.

في حقيقيات النوى الأعلى ، يضيف تغليف الحمض النووي في الكروماتين مستوى آخر من التعقيد إلى تنظيم الوظائف الوراثية الأساسية (النسخ ، النسخ المتماثل ، الجبر ، إلخ). يؤثر طي الكروماتين على إمكانية وصول الحمض النووي إلى العوامل التنظيمية العابرة والتغيرات التوافقية للحمض النووي (فك الحلزون المزدوج) المطلوبة لتوليف القالب. لذلك ، من المقبول عموما أن العمليات الاصطناعية المعتمدة على الحمض النووي في نواة الخلية تتطلب انتقالا هيكليا للكروماتين من حالته القمعية المكثفة إلى تشكيل أكثر سهولة وانفتاحا. من الناحية الخلوية ، يتم تعريف هاتين الحالتين الكروماتين على أنهما heterochromatin و euchromatin. ومع ذلك ، لا يوجد حتى الآن توافق في الآراء بشأن طريقة طي الحمض النووي في النواة. تتراوح الفرضيات من نموذج "ذوبان البوليمر"11 ، حيث تتصرف الألياف النووية كبوليمر عشوائي يتم التحكم في كثافة التعبئة له بواسطة آليات فصل الطور ، إلى نماذج قابلة للطي هرمية تفترض التكوين المتسلسل للهياكل الشبيهة بألياف الكروماتين ذات السماكة المتزايدة12,13. اكتسبت نماذج الطي الهرمي مؤخرا دعما من النهج الجزيئية القائمة على تحليل اتصالات الحمض النووي والحمض النووي في الموقع (التقاط تشكيل الكروموسومات ، 3C) ، مما يدل على وجود التسلسل الهرمي للمجالات الهيكلية للكروماتين14. من المهم ملاحظة أن وحدات النسخ المتماثل ترتبط ارتباطا جيدا بمجالات الكروماتين هذه15. ويستند النقد الرئيسي لهذه النماذج إلى تجميع الكروماتين الاصطناعي المحتمل الناجم عن إجراءات إعداد العينات، مثل تخلل أغشية الخلايا وإزالة المكونات غير الكروماتينية، من أجل تحسين تباين الكروماتين للدراسات فوق الهيكلية مع تحسين إمكانية الوصول إلى الكروماتين لمختلف المجسات (مثل الأجسام المضادة). وقد سمحت التطورات التقنية الحديثة في تلطيخ الحمض النووي الانتقائي للفحص المجهري الإلكتروني عن طريق الأكسدة الضوئية بوساطة الفلوروفور المرتبطة بالحمض النووي للديامينوبينزيدين (ChromEMT6) بإزالة هذه العقبة. ومع ذلك ، فإن نفس الاعتبارات تنطبق على تصور المجهر الإلكتروني لتكرار الحمض النووي17,18. هنا نصف تقنية تسمح برسم خرائط فوق هيكلية عالية الدقة في وقت واحد للحمض النووي المركب حديثا والكروماتين الكلي في الخلايا المتقاطعة مع الألدهيد السليمة. تجمع هذه التقنية بين الكشف عن الحمض النووي المسمى EdU بواسطة Click-chemistry مع مجسات البيوتينيل والستربتافيدين نانوغولد و ChromEMT.

Protocol

تم تحسين البروتوكول للخلايا الملتصقة وتم اختباره على خطوط خلايا HeLaو HT1080 و CHO.

1. وضع العلامات على الخلايا وتثبيتها

  1. ضعي خلايا الطبق على أغطية مطحوضة التنظيف في طبق بتري بطول 3 سم. تنمو الخلايا في الوسائط الموصى بها لخط الخلية المستخدم في التقاء بنسبة 70٪.
  2. أضف EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) من مخزون 10 mM إلى التركيز النهائي 10 μM ووضع الخلايا في الحاضنة لمدة 10 دقائق أو أكثر (اعتمادا على هدف التجربة). للحصول على بقول أقصر (حتى 2 دقيقة) ، قم بإعداد طبق بتري مع وسائط استزراع طازجة تم تسخينها مسبقا مع استكمال 10 ميكرومتر EdU ، ونقل الأغطية فيه ، بدلا من إضافة EdU إلى الخلايا مباشرة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة إذا لم تتم الإشارة إلى خلاف ذلك.
  3. قم بإصلاح الخلايا المصنفة بنسبة 2.5٪ glutaraldehyde ، المصنوع حديثا عن طريق تخفيف مخزون 25٪ في مخزن مؤقت cacodylate 100 mM ، لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: خطوات الكشف عن EdU اللاحقة حساسة لتوقيت التثبيت. قد تؤثر أوقات التثبيت الأطول سلبا على وضع العلامات على EdU ، مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  4. قم بإزالة الجلوتارالدهيد عن طريق غسل العينات باستخدام PBS المكمل ب 5 mM MgCl2 (PBS * بعد ذلك). يغسل ثلاث مرات مع حضانة لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
  5. تخلل أغشية البلازما بنسبة 1٪ Triton X-100 في PBS * (PBS * T بعد ذلك). يغسل مرتين مع حضانة لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
  6. اغسل العينة على نطاق واسع باستخدام PBS*. قم بإجراء خمسة تغييرات واحتضن لمدة 5 دقائق في كل تغيير.
  7. قم بإخماد مجموعات الألدهيد الخالية من البقايا باستخدام 20 ملليمتر من الجلايسين في PBS * ، مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  8. قم بحظر العينات بنسبة 1٪ BSA في PBS * لمدة 30 دقيقة.

2. رد فعل النقر

ملاحظة: يتم تعديل هذا الإجراء من بروتوكول19 منشور مسبقا.

  1. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد مزيج تفاعل النقر للكشف عن EdU: في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، امزج 430 ميكرولتر من 100 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.5) ، و 20 ميكرولتر من 100 mM CuSO4 ، و 1.2 ميكرولتر من البيوتين أزيد (10 mM في DMSO) ، و 50 ميكرولتر من 0.5 M حمض الأسكوربيك. لمراقبة جودة وضع العلامات التكرارية وإجراء النقر على مستوى الفحص المجهري الفلوري ، يمكن استبدال البيوتين-أزيد ب AlexaFluor 488-azide.
    ملاحظة: ترتيب إضافة المكونات في التفاعل أعلاه مهم.
  2. قم بإجراء تفاعل النقر في غرفة رطبة لتقليل التبخر وتحولات التركيز في كوكتيل التفاعل. قم بإعداد الغرفة الرطبة عن طريق وضع ورقة مبللة من ورق الترشيح في الجزء السفلي من طبق بتري وتغطيته بفيلم بارافين. ضع الغطاء على سطح الفيلم مع توجيه الخلايا لأعلى ووضع طبقة 50-100 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل على الغطاء. يستغرق التفاعل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. أوقف التفاعل عن طريق غسل العينة بنسبة 0.1٪ Triton X-100 في PBS * (PBS * T) ، خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  4. كتلة في 1٪ BSA في PBS * T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تحضير محلول ستربتافيدين-نانوغولد مع PBS * T يحتوي على 1٪ BSA. احتضن العينة بالستربتافيدين ، مقترنا بجزيئات نانو جولد 1.4 نانومتر (Nanoprobes) في 1٪ BSA + PBS * T بين عشية وضحاها عند +4 درجة مئوية في الغرفة الرطبة المعدة حديثا.
  6. أوقف التفاعل واغسل العينة في PBS * T ، خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
  7. قم بتثبيت مركب ستربتافيدين البيوتين عن طريق التثبيت في 1٪ glutaraldehyde في PBS * لمدة 30 دقيقة.
  8. قم بإزالة الجلوتارالدهيد عن طريق الغسيل المكثف بالماء منزوع الأيونات واغسل العينة في PBS * ، خمس مرات لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
  9. قم بإخماد مجموعات الألدهيد الحرة مع 1 مجم / مل من NaBH4 الطازج في الماء ، مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما. أثناء الحضانة ، يتم تشكيل فقاعات من H2 والتي يمكن أن ترفع الغطاء. ادفعها بعناية لأسفل باستخدام الملقط.
  10. يغسل بالماء منزوع الأيونات خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: لمراقبة الجودة في خطوة وضع العلامات ، من المستحسن إجراء وضع العلامات الرقابية باستخدام الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت (الشكل 2). وهذا من شأنه أن يوفر تقديرا لكثافة وضع العلامات ومستوى الخلفية قبل التحول إلى الخطوات اللاحقة المملة والمعرضة للقطع الأثرية.

3. Ag-تضخيم

ملاحظة: تم تعديل هذا الإجراء من Gilerovitch et al.، 1995 (انظر 20،21).

  1. أعد تعليق 50 جم من مسحوق السنط في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. تذوب لمدة 3 أيام ، وتتحلل ، وترشح من خلال أربع طبقات من القماش القطني. تخزين المجمدة في 5 مل أليكوتس في أنابيب 50 مل. تذوب مباشرة قبل الاستخدام.
  2. أضف 2 مل من 1 M MES (الرقم الهيدروجيني = 6.1) إلى 5 مل من الأليكوت المذاب من محلول مسحوق السنط لصنع 7 مل من 0.28 M MES (الرقم الهيدروجيني = 6.1) في محلول مسحوق السنط. اخلطي المزيج عن طريق هز الأنبوب ببطء لمدة 30 دقيقة. لف الأنبوب بورق القصدير للحماية من الضوء.
  3. بالتزامن مع الخطوة 3.2.، يتم غسل الأغطية مع مخزن مؤقت للغسيل (50 mM MES، الرقم الهيدروجيني = 5.8، 200 mM sucrose)، ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  4. تحضير محلول جديد من N-propyl gallate (NPG). في أنبوب 15 مل ، قم بإذابة 10 ملغ من NPG في 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 96٪ ، واضبط على 5 مل بالماء منزوع الأيونات.
  5. ضع 36 ملغ من لاكتات الفضة في أنبوب 15 مل ملفوف بورق القصدير.
  6. بعد الخطوة 3.2. اكتمل ، أضف 1.5 مل من محلول NPG إلى مزيج مسحوق السنط والصخور لمدة 3 دقائق أخرى.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في غرفة مظلمة. استخدم الضوء الآمن غير الأكتيني (الأصفر أو الأحمر).
  7. قم بموازنة العينة مع مخزن الغسيل المؤقت وانتقل إلى الغرفة المظلمة. في الوقت نفسه ، أضف 5 مل من الماء منزوع الأيونات إلى لاكتات الفضة وتذوب عن طريق الاهتزاز القوي لمدة 1-2 دقيقة.
  8. أضف 1.5 مل من محلول اللاكتات الفضي إلى مزيج مسحوق السنط ، والصخور ببطء لمدة دقيقة واحدة. تجنب تكوين الفقاعات ، لأن الأكسجين في المزيج سيبطئ التفاعل.
  9. صفي المحلول من الطبق بأغطية واسكبي 3 مل من مزيج مسحوق اللاكتات والأكاسيا الفضي على الخلايا. اهز الطبق عدة مرات واحتضنه لمدة 2-5 دقائق. يعتمد وقت الحضانة على دفعة مسحوق السنط ودرجة الحرارة. يجب تعريف هذا تجريبيا.
    ملاحظة: قد يؤدي وقت الحضانة الأطول إلى ربط الفضة بشكل غير محدد.
  10. لوقف التفاعل ، استنزف مزيج التفاعل واغسل الطبق على نطاق واسع بثلاثة إلى خمسة تغييرات في الماء منزوع الأيونات ، تليها ثلاثة تغييرات أخرى لمدة 5 دقائق لكل منها.
  11. تحقق من تلطيخ تحت المجهر برايتفيلد. يجب أن يكون التلطيخ الجيد فاتحا إلى بني داكن مع خلفية صفراء باهتة للغاية.
    ملاحظة: إذا لم يتطور التلطيخ ، فمن الممكن تكراره على الفور مع المزيج المصنوع بالفعل (يكون المزيج نشطا لمدة 15 دقيقة تقريبا إذا تم الاحتفاظ به في الظلام). ومع ذلك ، قد يتطور التلطيخ في هذه الحالة بسرعة كبيرة.

4. الذهب التنغيم

ملاحظة: من أجل حماية جسيمات الفضة النانوية من الذوبان بواسطة أكسدة OsO4 في الإجراءات اللاحقة ، يتم استخدام التشريب بالذهب في هذه الخطوة (Sawada، Esaki، 1994)22.

  1. شطف الأغطية بالماء منزوع الأيونات.
  2. من أجل حماية جزيئات الفضة النانوية من الذوبان بواسطة أكسدة OsO4 ، احتضن العينات في 0.05٪ من حمض رباعي كلورو اليوريك لمدة 2 دقيقة في الظلام.
  3. يغسل جيدا بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة يضاف تباين إضافي إلى المواد التي تحتوي على الحمض النووي. يجب أن يتغير لون العينة من البني إلى الأسود.

5. كروم إي إم

ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من Ou et al., 201716.

  1. احتضان الأغطية وتشبع العينات في 10 ميكرومتر DRAQ5 في PBS لمدة 10 دقائق في الظلام.
  2. تحضير 0.2 ٪ ديامينوبينزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB) محلول في 50 mM Tris أو PBS:
    قم بإذابة DAB في 90٪ من الحجم النهائي عن طريق التحريك بقوة في الظلام ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0-7.4 باستخدام NaOH. اضبط مستوى الصوت إلى 100٪ وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وقم بتخزينه ملفوفا في رقائق معدنية.
  3. أضف محلول DAB إلى الخلايا (2 مل لكل طبق بتري 3 سم) واحتضنه لمدة 1 دقيقة.
  4. حرك الغطاء إلى الجزء السفلي الزجاجي من طبق بتري وضعه على مرحلة المجهر المقلوب. قم بتشعيع العينة (عدة مجالات رؤية) على مجهر مقلوب مع مصدر ضوء هاليد معدني ومجموعة مرشحات Cy5 (640 نانومتر ، 1 واط / سم 2 في المستوى البؤري) من خلال عدسة Plan Apo λ 40х (NA = 0.95) لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: مؤشر على نجاح التحويل الضوئي DAB هو التبييض الضوئي الكامل DRAQ5 وتكوين راسب DAB الداكن في النوى المشععة. ومع ذلك ، فإن هذا الأخير ليس واضحا دائما على إشارة EdU-silver-gold المكثفة (خاصة عند استخدام نبضات EdU الموسعة).
  5. يغسل بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.

6. الجفاف وراتنجات الايبوكسي تشبه

  1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، قم بتحضير محلول رابع أكسيد الأوزميوم المختزل جزئيا عن طريق خلط محلول مائي بنسبة 2٪ من K4Fe(CN)6 مع كمية متساوية من محلول مائي بنسبة 2٪ من OsO4، للحصول على تركيز نهائي بنسبة 1٪ لكلا المكونين. احتضن الأغطية في OsO4 المخفض لمدة 1 ساعة واغسلها في الماء منزوع الأيونات ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
    ملاحظة: في هذه المرحلة يتفاعل مركب الأوزميوم المنخفض مع ترسبات DAB ويزيد من تباين الحمض النووي.
    تنبيه: الأوزميوم سام، ويعمل تحت غطاء الدخان ويتعامل مع النفايات وفقا للوائح السلامة المحلية.
  2. تجفيف العينات في سلسلة من محاليل الإيثانول المتدرجة بنسب متزايدة: 50٪ EtOH - 3 × 10 دقائق ؛ 70٪ EtOH - 3 × 10 دقائق ، 80٪ EtOH - 3 × 10 دقائق ، 96٪ EtOH - 3 × 10 دقائق ، 100٪ EtOH - 3 × 10 دقائق.
  3. للتسلل والتضمين ، استخدم صيغة الراتنج مع النسبة الحجمية للمكون على النحو التالي: مونومر راتنج الإيبوكسي: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (W / W). هذه الصيغة قابلة للامتزاج مع الإيثانول.
    1. احتضن الغطاء في مزيج راتنجات الإيثانول (3 أجزاء 100٪ EtOH: 1 جزء راتنجات الايبوكسي) لمدة 30 دقيقة.
    2. احتضن الغطاء في مزيج راتنجات الإيثانول (1 جزء 100٪ EtOH: 1 جزء راتنجات الايبوكسي) لمدة 2 ساعة.
    3. احتضان الغطاء في مزيج راتنجات الإيثانول (1 جزء 100٪ EtOH: 3 أجزاء راتنجات الايبوكسي) بين عشية وضحاها.
    4. استبدل مزيج راتنج الإيثانول بالراتنج النقي الطازج. احتضان في مزيج الراتنج النقي لمدة 8 ساعات. افتح الطبق للسماح لبقايا الإيثانول بالتبخر.
    5. انقل الأغطية إلى طبق جديد مع راتنج نقي واحتضنها لمدة 2 ساعة عند 37-42 درجة مئوية.
    6. املأ قالب السيليكون بالراتنج الطازج. ضع الأغطية مع الخلايا التي تواجه لأسفل على قالب السيليكون المناسب المملوء براتنجات الإيبوكسي. علاج الراتنج لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم عند 60 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل.
      تحذير: مكونات مزيج راتنجات الايبوكسي هي مواد مسرطنة محتملة. ارتداء القفازات والعمل تحت غطاء الدخان.
  4. قم بإزالة لوح الراتنج من القالب ، وقم بتنظيف سطح الغطاء باستخدام المشرط أو شفرة الحلاقة. لإزالة الغطاء ، قم بإسقاط الغطاء في النيتروجين السائل ثم انقل البلاطة إلى الماء المغلي. كرر إذا لزم الأمر.
  5. حدد موقع المنطقة المشععة تحت المجهر المجسم واقطعها من البلاطة باستخدام منشارا أو أي أداة مناسبة أخرى. قم بتسخين البلاطة مسبقا على حرارة 70 درجة مئوية على صفيحة ساخنة ، إذا لزم الأمر.
  6. اربط القطع في حامل عينة فائق الميكروتوم لتشذيب الكتلة النهائي. باستخدام الحلاقة ، قم بإعداد عينة على شكل هرم. قم بتركيب الحامل مع الهرم على ultramicrotome وتثبيت السكين.
    1. قم بقص الكتلة بحيث يتم تضمين الخلايا المشععة التي تحمل ملصق EdU. تحضير مقطع شبه رقيق (سمك 250 نانومتر) مناسب للتصوير المقطعي الإلكتروني.
      ملاحظة: يمكن تعديل سمك القسم ليناسب المتطلبات التجريبية.
  7. افصل القسم عن حافة السكين وضعه على الشبكات ذات الفتحة الواحدة. بالنسبة للتصوير المقطعي الإلكتروني ، يتم التقاط مقاطع 250 نانومتر على شبكات أحادية الفتحة مقاس 1 مم وبعد التجفيف يمكن طلاء هذه الأقسام بالكربون من كلا الجانبين. لا حاجة إلى تباين إضافي.
    ملاحظة: نظرا لأن الأقسام تحتوي بالفعل على جسيمات Au-Ag عالية التباين ، فليست هناك حاجة لإضافة جزيئات الذهب الائتمانية إلى سطح القسم.
  8. افحص الشبكات في المجهر الإلكتروني الناقل عند تكبير منخفض (حوالي 600x) لتحديد موقع الخلايا بأنماط تكرار مناسبة.
    ملاحظة: يقوم هذا البروتوكول بإنشاء كثافة وضع العلامات عالية بما يكفي لسهولة اكتشاف بؤر النسخ المتماثل حتى عند التكبير المنخفض. من المستحسن أولا إنشاء خريطة للقسم للملاحة اللاحقة ومجموعة الإسقاطات الزاوية للتصوير المقطعي. قم بالتبديل إلى تكبير أعلى والتقط صورا عالية الدقة.

7. التصوير المقطعي الإلكتروني

  1. أدخل الشبكة في المجهر الإلكتروني الناقل باستخدام حامل عالي الإمالة. قم بتحميل العينة في المجهر الإلكتروني وحدد المنطقة محل الاهتمام.
  2. قم بمحاذاة المجهر في وضع EFTEM في وضع الإضاءة المتوازية تقريبا. اضبط فلتر الطاقة باستخدام فتحة اختيار الطاقة 20 eV الموضوعة في ذروة الخسارة الصفرية.
  3. قبل تشعيع منطقة اكتساب التصوير المقطعي بمعدل جرعة 40 e / Å 2 / s لمدة 1.5-2 دقيقة على الأقل ، وهو ما يتوافق مع الجرعة الإجمالية التي لا تقل عن 3000 e / Å2.
  4. اضبط الارتفاع المتمركز مع المهمة التلقائية في SerialEM. تحقق من مهمة التركيز البؤري التلقائي للتأكد من أنها تعمل بشكل صحيح عند زاوية إمالة صفر وقيمة إلغاء التركيز البؤري المستهدف -0.8 mkm.
  5. قم بإمالة حامل العينة إلى -60 درجة باستخدام مهمة المشي.
  6. قم بإعداد اقتناء التصوير المقطعي من -60 إلى +60 درجة مع الخطوة 2.0 درجة. يجب ضبط التعريض الضوئي اعتمادا على زاوية الإمالة للحفاظ على متوسط الكثافة على الكاميرا. الحد من تحول الصورة في حالة حدوثه في تحول الطاقة وبالتالي شق الاختلال. يجب حفظ بيانات التصوير المقطعي كملف .mrc.
  7. استيراد ملف .mrc إلى برنامج IMOD لإعادة بناء التصوير المقطعي. قم بإزالة قيم البكسل المتطرفة بسبب الأشعة السينية.
  8. محاذاة سلسلة الإمالة. قم بإجراء ارتباط متقاطع أولي ، ثم ضع علامة يدويا على 10-12 جسيمات الذهب كفيديوهات. تتبع النموذج الائتماني وتحقق من أن كل fiducial يتم تتبعه بشكل صحيح من خلال سلسلة الإمالة. قم بإنشاء نماذج مقطعية (شرائح) ووضع علامة يدويا على حدود المقطع الرفيع لمنع الميل المحتمل للكثافة المعاد بناؤها داخل وحدة التخزين. كان متوسط الخطأ المتبقي للمحاذاة الدقيقة أقل من 1.2 بكسل.
  9. أعد بناء التصوير المقطعي باستخدام خوارزمية إسقاط خلفي تمت تصفيتها ثم قم بقص الإخراج ليناسب المنطقة ذات الاهتمام في الحجم النهائي.

النتائج

تعرض بؤر النسخ المتماثل في نوى خلايا الثدييات أنماطا متميزة من التوزيع داخل النواة اعتمادا على تقدم الطور S. ترتبط هذه الأنماط بنشاط النسخ للمواقع التي يتم تكرارها. نظرا لأن الطريقة المعروضة هنا تستخدم إجراء تثبيت قوي إلى حد ما ، فمن السهل إلى حد ما استخدام وسم النبض التكراري للكشف المحدد ?...

Discussion

تتميز الطريقة الموضحة هنا بالعديد من المزايا مقارنة بالبروتوكولات المنشورة مسبقا. أولا ، إن استخدام Click-chemistry لوضع العلامات على الحمض النووي المكرر يلغي الحاجة إلى شرط تمسخ الحمض النووي للكشف عن BrdU بالأجسام المضادة ، وبالتالي الحفاظ على البنية الفائقة للكروماتين بشكل أفضل.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مراسلون بلا حدود (المنحة #17-15-01290) و RFBR (المنحة #19-015-00273). يشكر المؤلفون برنامج تطوير جامعة لومونوسوف الحكومية في موسكو (PNR 5.13) ومركز نيكون للتميز في التصوير المرتبط في معهد بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية للوصول إلى أجهزة التصوير.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)Thermo FisherA10044
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)Fisher ScientificBP300-100
AlexaFluor 555-azideTermo FisherA20012
biotin-azideLumiprobeC3730
Bovine Serum AlbumineBovalLY-0080
DDSASPI-CHEM26544-38-7
DMP-30SPI-CHEM90-72-2
DRAQ5Thermo Scientific62251
Epoxy resin monomerSPI-CHEM90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade)TED PELLA, INC18426
Gum arabicACROS Organics258850010
Magnesium chloridePanreac141396.1209
NaBH4SIGMA-ALDRICH213462
NMASPI-CHEM25134-21-8
N-propyl gallateSIGMA-ALDRICHP3130
PBSMP Biomedicals2810305
Silver lactateALDRICH359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugateTermo FisherS11223
Streptavidin-Nanogold conjugateNanoprobes2016
tetrachloroauric acidSIGMA-ALDRICHHT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)CHEM-IMPEX INT'L298
Triton X-100Fluka Chemica93420
Instruments
Carbon CoaterHitachi
Copper single slot gridsTed Pella1GC10H
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)NikonCy5 HQAlternatives: Zeiss, Leica, Olympus
Diamond knife Ultra Wet 45oDiatomeDUAlternatives: Ted Pella
Fluorescent microscopeNikonTi-EAlternatives: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt sample holderJeol
RotatorBiosanMulti Bio RS-24
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometerJeolJEM-2100Alternatives: FEI, Hitachi
TweezersTed Pella523
UltramicrotomeLeicaUltraCut-EAlternatives: RMC
Software
Image acquisitionOpen SourceSerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Image processingOpen SourceIMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)

References

  1. Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
  2. Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
  3. Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
  4. Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
  5. Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
  6. Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
  7. Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
  8. Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
  9. Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
  10. Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
  11. Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
  12. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
  13. Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
  14. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
  15. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  16. Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
  17. Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
  18. Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
  19. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  20. Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
  21. Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
  22. Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
  23. He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
  24. Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved