Визуализация репликативных доменов в ультраструктурно сохраненном хроматине с помощью электронной томографии

Резюме

Этот протокол представляет собой метод картирования участков репликации с высоким разрешением в структурно сохраненном хроматине in situ , который использует комбинацию предварительного встраивания маркировки EdU-стрептавидин-Nanogold и ChromEMT.

Аннотация

Принципы сворачивания ДНК в ядре клетки и ее динамических превращений, происходящих при выполнении основных генетических функций (транскрипция, репликация, сегрегация и др.), остаются малоизученными, отчасти из-за отсутствия экспериментальных подходов к визуализации высокого разрешения специфических локусов хроматина в структурно сохранившихся ядрах. Здесь представлен протокол визуализации репликативных доменов в монослойной клеточной культуре in situ, путем объединения маркировки EdU вновь синтезированной ДНК с последующим обнаружением меток с Ag-амплификацией частиц Nanogold и окрашиванием ChromEM хроматина. Этот протокол обеспечивает высококонтрастную, высокоэффективную маркировку предварительного встраивания, совместимую с традиционной фиксацией глутаральдегида, которая обеспечивает наилучшую структурную сохранность хроматина для обработки образцов при комнатной температуре. Еще одним преимуществом маркировки предварительного встраивания является возможность предварительного выбора интересующих клеток для секционирования. Это особенно важно для анализа гетерогенных клеточных популяций, а также совместимости с электронно-томографическими подходами к 3D-анализу организации хроматина высокого разрешения в местах репликации и анализу пострепликативной перестройки хроматина и сестринского хроматидного разделения в интерфазе.

Введение

Репликация ДНК является основным биологическим процессом, необходимым для точного копирования и передачи генетической информации во время деления клеток. У высших эукариот репликация ДНК подвергается жесткой пространственно-временной регуляции, которая проявляется в последовательной активации истоков репликации¹. Соседние источники репликации, запускающие синхронно, образуют кластеры репликонов². На уровне оптической микроскопии участки продолжающейся репликации ДНК обнаруживаются как очаги репликации различного количества и размера. Репликационные очаги демонстрируют специфические закономерности пространственного распределения внутри ядра клетки в зависимости от сроков репликации меченой ДНК ^3,4, что, в свою очередь, тесно коррелирует с ее генной активностью. Благодаря четко определенной последовательности репликации ДНК, строго упорядоченной в пространстве и времени, репликативная маркировка является мощным методом точной маркировки ДНК не только для изучения процесса репликации как такового, но и для различения конкретной субфракции ДНК с определенной транскрипционной активностью и уровнем уплотнения. Визуализация реплицирующегося хроматина обычно выполняется путем обнаружения основных белковых компонентов механизма репликации ДНК (либо путем иммуноокрашивания, либо путем экспрессии флуоресцентных белковых меток ^5,6) или путем включения модифицированных предшественников синтеза ДНК ^7,8,9,10 . Из них только методы, основанные на включении модифицированных нуклеотидов во вновь реплицированную ДНК, позволяют улавливать конформационные изменения хроматина во время репликации и отслеживать поведение репликативных доменов после завершения их репликации.

У высших эукариот упаковка ДНК в хроматин добавляет еще один уровень сложности к регуляции основных генетических функций (транскрипция, репликация, репарация и т. Д.). Складчатость хроматина влияет на доступность ДНК к регуляторным транс-факторам и конформационным изменениям ДНК (размотка двойной спирали), необходимым для синтеза шаблона. Поэтому принято считать, что ДНК-зависимые синтетические процессы в ядре клетки требуют структурного перехода хроматина из его конденсированного, репрессивного состояния в более доступную, открытую конформацию. Цитологически эти два состояния хроматина определяются как гетерохроматин и эухроматин. Тем не менее, до сих пор нет единого мнения относительно способа складывания ДНК в ядре. Гипотезы варьируются от модели¹¹ «полимерного расплава», где нуклеосомное волокно ведет себя как случайный полимер, для которого плотность упаковки контролируется механизмами разделения фаз, до иерархических моделей складывания, постулирующих последовательное формирование хроматиновых волокнистых структур увеличивающейся толщины^12,13. Иерархические модели складывания недавно получили поддержку молекулярных подходов, основанных на анализе контактов ДНК-ДНК in situ (захват конформации хромосом, 3C), демонстрируя существование иерархии структурных доменов хроматина¹⁴. Важно отметить, что единицы репликации очень хорошо коррелируют с этими хроматиновыми доменами¹⁵. Основная критика этих моделей основана на потенциальной искусственной агрегации хроматина, вызванной процедурами пробоподготовки, такими как пермеабилизация клеточных мембран и удаление нехроматиновых компонентов, чтобы улучшить контраст хроматина для ультраструктурных исследований при одновременном улучшении доступности хроматина для различных зондов (например, антител). Последние технические достижения в области селективного окрашивания ДНК для электронной микроскопии путем ДНК-связывающего флуорофоро-опосредованного фотоокисления диаминобензидина (ChromEMT⁶) позволили устранить это препятствие. Тем не менее, те же соображения справедливы для электронной микроскопии визуализации реплицирующей днк^17,18. Здесь мы описываем технику, которая позволяет одновременно проводить ультраструктурное картирование с высоким разрешением вновь синтезированной ДНК и общего хроматина в интактных альдегидно-сшитых клетках. Метод сочетает в себе обнаружение меченой EdU ДНК с помощью Click-химии с биотинилированными зондами и стрептавидином-нанозолотом, а также ChromEMT.

протокол

Протокол оптимизирован для адгезивных клеток и был протестирован на клеточных линиях HeLa, HT1080 и CHO.

1. Маркировка и фиксация клеток

1. Пластинчатые ячейки на очищенных кислотой крышках в чашке Петри 3 см. Вырастите клетки в среде, рекомендуемой для используемой клеточной линии, до 70% слияния.
2. Добавьте EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) из запаса 10 мМ до конечной концентрации 10 мкМ и поместите клетки в инкубатор на 10 мин или дольше (в зависимости от цели эксперимента). Для более коротких импульсов (до 2 мин) приготовьте чашку Петри с предварительно нагретой свежей питательной средой, дополненной 10 мкМ EdU, и переложите в нее покровы, а не добавляйте EdU непосредственно в клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы проводятся при комнатной температуре, если не указано иное.
3. Зафиксируйте меченые клетки 2,5% глутаровым альдегидом, свежеприготовленным путем разбавления 25% запаса в 100 мМ какодилатного буфера, в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие шаги обнаружения EdU чувствительны к времени фиксации. Более длительное время фиксации может негативно повлиять на маркировку EdU, вызывая более низкое отношение сигнал/шум.
4. Удалите глутаровый альдегид, промыв образцы PBS, дополненным 5 мМ MgCl₂ (PBS* после этого). Мойте три раза с 10-минутной инкубацией для каждой стирки.
5. Пермеабилизируйте плазматические мембраны 1% Тритоном X-100 в PBS* (PBS*T впоследствии). Мойте два раза с 5-минутной инкубацией для каждой стирки.
6. Тщательно промывайте образец с помощью PBS*. Выполните пять изменений и инкубируйте в течение 5 минут в каждом изменении.
7. Гасить остаточные альдегидные группы глицином 20 мМ в PBS*, два раза по 10 мин каждая.
8. Блокируйте образцы в 1% BSA в PBS* в течение 30 мин.

2. Клик-реакция

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура изменена по сравнению с ранее опубликованным протоколом¹⁹.

1. Непосредственно перед применением приготовьте Click-реакционную смесь для обнаружения ЭдУ: в микроцентрифужной пробирке смешайте 430 мкл 100 мМ Tris-HCl (рН = 8,5), 20 мкл 100 мМ CuSO₄, 1,2 мкл биотин-азида (10 мМ в ДМСО) и 50 мкл 0,5 М аскорбиновой кислоты. Для контроля качества репликативной маркировки и Click-процедуры на уровне флуоресцентной микроскопии биотин-азид может быть заменен на AlexaFluor 488-азид.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важен порядок добавления компонентов в вышеуказанной реакции.
2. Выполняйте щелковые реакции во влажной камере, чтобы свести к минимуму испарение и сдвиги концентрации в реакционном коктейле. Подготовьте влажную камеру, поместив влажный лист фильтровальной бумаги на дно чашки Петри и покрыв его парафиновой пленкой. Поместите крышки на поверхность пленки ячейками вверх и наложите 50-100 мкл реакционного коктейля на крышку. Реакция занимает 30 мин при комнатной температуре.
3. Остановите реакцию, промыв образец в 0,1% Triton X-100 в PBS* (PBS*T), пять раз по 5 мин каждый.
4. Блокировать в 1% BSA в PBS*T в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Готовят раствор стрептавидина-нанозолоты с PBS*T, содержащим 1% BSA. Инкубируют образец стрептавидином, сопряженным с 1,4 нм нанозолотистыми частицами (нанозондами) в 1% BSA + PBS*T в течение ночи при +4 °C во вновь подготовленной влажной камере.
6. Остановите реакцию и промыть образец в PBS*T, пять раз по 10 мин каждый.
7. Стабилизируют комплекс биотина стрептавидина постфиксом в 1% глутаральдегиде в PBS* в течение 30 мин.
8. Удалите глутаровый альдегид путем интенсивного промывания деионизированной водой и промыть образец в PBS*, пять раз по 20 минут каждый.
9. Тушить свободные альдегидные группы свежеприготовленным 1 мг/мл NaBH₄ в воде, два раза по 10 мин каждая. Во время инкубации образуются пузырьки_Н2 , которые могут поднимать покровы. Осторожно толкайте их вниз пинцетом.
10. Промыть деионизированной водой пять раз по 5 мин каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля качества на этапе маркировки целесообразно проводить контрольную маркировку флуоресцентно меченым стрептавидином (рисунок 2). Это обеспечит оценку интенсивности маркировки и уровня фона перед переходом к утомительным и подверженным артефактам последующим шагам.

3. Ag-усиление

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура изменена из Gilerovitch et al., 1995 (см. ^20,21).

1. Повторно суспендировать 50 г порошка акации в 100 мл деионизированной воды. Растворить в течение 3 дней, деградировать и процедить через четыре слоя марли. Хранить замороженными в аликвотах по 5 мл в тубах по 50 мл. Разморозить непосредственно перед использованием.
2. Добавьте 2 мл 1 M MES (pH = 6,1) к 5 мл размороженной аликвоты порошкового раствора акации, чтобы получить 7 мл 0,28 M MES (pH = 6,1) в растворе порошка акации. Перемешайте, медленно раскачивая трубку в течение 30 минут. Оберните трубку фольгой для защиты от света.
3. Одновременно с шагом 3.2., стирайте крышки с промывочным буфером (50 мМ MES, рН = 5,8, 200 мМ сахарозы), трижды по 10 мин каждая.
4. Готовят свежий раствор N-пропилгаллата (НПГ). В пробирке объемом 15 мл растворите 10 мг НПГ в 250 мкл 96% этанола и доведите до 5 мл с деионизированной водой.
5. Поместите 36 мг лактата серебра в завернутую фольгой пробирку объемом 15 мл.
6. После шага 3.2. завершается, добавляют 1,5 мл раствора НПГ в смесь порошкового акации и породы еще 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги выполняются в темной комнате. Используйте неактинический безопасный свет (желтый или красный).
7. Уравновешивайте образец с помощью промывочного буфера и переходите в темное помещение. Одновременно добавляют 5 мл деионизированной воды в лактат серебра и растворяют путем энергичного встряхивания в течение 1-2 мин.
8. Добавьте 1,5 мл раствора лактата серебра в смесь порошка акации, медленно раскачивая в течение 1 мин. Избегайте образования пузырьков, так как кислород в смеси замедлит реакцию.
9. Слейте раствор из посуды с помощью обложек и вылейте на ячейки 3 мл смеси порошка лактата серебра и акации. Прокачайте блюдо несколько раз и высиживайте в течение 2-5 мин. Время инкубации зависит от партии порошка акации и температуры. Это должно быть определено экспериментально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время инкубации может привести к неспецифическому связыванию серебра.
10. Чтобы остановить реакцию, слейте реакционную смесь и тщательно вымойте посуду с тремя-пятью изменениями деионизированной воды, а затем еще тремя изменениями в течение 5 минут каждая.
11. Проверьте окрашивание под микроскопом Brightfield. Хорошее окрашивание должно быть от светло-коричневого до темно-коричневого с очень слабым желтоватым фоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивание не развивается, можно сразу же повторить с уже сделанной смесью (смесь активна около 15 минут, если ее держать в темноте). Однако окрашивание в этом случае может развиваться слишком быстро.

4. Золотая тонировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты наночастиц серебра от растворения путем окисления OsO₄ в последующих процедурах на этом этапе используется пропитка золотом (Sawada, Esaki, 1994)²².

1. Промойте крышки деионизированной водой.
2. Чтобы защитить наночастицы серебра от растворения путем окисления OsO₄ , инкубируйте образцы в 0,05% тетрахлорауровой кислоты в течение 2 мин в темноте.
3. Тщательно промойте деионизированной водой в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе к МАТЕРИАЛУ, содержащему ДНК, добавляется дополнительный контраст. Цвет образца должен измениться с коричневого на черный.

5. ХромЕМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был изменен из Ou et al., 2017¹⁶.

1. Инкубируйте крышки и насыщайте образцы 10 мкМ DRAQ5 в PBS в течение 10 мин в темноте.
2. Приготовьте 0,2% раствор диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB) в 50 мМ Tris или PBS:
   растворите DAB в 90% конечного объема, энергично перемешивая в темноте, затем отрегулируйте рН до 7,0-7,4 с NaOH. Отрегулируйте громкость до 100% и фильтруйте через фильтр 0,22 мкМ, храните завернутым в фольгу.
3. Добавить в клетки раствор DAB (2 мл на чашку Петри 3 см) и инкубировать в течение 1 мин.
4. Переместите крышку в стеклянную нижнюю чашку Петри и поместите ее в стадию перевернутого микроскопа. Облучение образца (несколько полей зрения) на перевернутом микроскопе с металлогалогенным источником света и набором фильтров Cy5 (640 нм, 1 Вт/см2 в фокальной плоскости) через объектив Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Показателем успешной фотоконверсии DAB является полное фотоотбеливание DRAQ5 и образование темных осадков DAB в облученных ядрах. Однако последнее не всегда проявляется над интенсивным сигналом EdU-серебро-золото (особенно при использовании расширенных импульсов EdU).
5. Промыть деионизированной водой три раза по 5 мин каждый.

6. Обезвоживание и встраивание эпоксидной смолы

1. В микроцентрифужной трубке готовят частично восстановленный раствор тетраоксида осмия путем смешивания 2% водного раствора K4Fe(CN)6 с равным количеством 2% водного раствора OsO₄, чтобы получить 1% конечную концентрацию обоих компонентов. Инкубировать крышки в уменьшенном OsO₄ в течение 1 ч и промывать в деионизированной воде три раза по 5 мин каждый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе восстановленное соединение осмия реагирует с отложениями DAB и увеличивает контраст ДНК.
   ВНИМАНИЕ: Осмий токсичен, работает под вытяжным капотом и обрабатывает отходы в соответствии с местными правилами безопасности.
2. Обезвоживают образцы в серии градуированных растворов этанола в возрастающих процентах: 50% EtOH - 3 х 10 мин; 70% EtOH - 3 x 10 мин, 80% EtOH - 3 x 10 мин, 96% EtOH - 3 x 10 мин, 100% EtOH - 3 x 10 мин.
3. Для инфильтрации и встраивания используют формулу смолы с объемным соотношением компонентов следующим образом: мономер эпоксидной смолы:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0,23 (w/w). Эта формула смешивается с этанолом.
   1. Инкубируйте крышку в смеси этанол-смола (3 части 100% EtOH:1 часть эпоксидной смолы) в течение 30 мин.
   2. Инкубировать крышку в смеси этанол-смола (1 часть 100% EtOH:1 часть эпоксидной смолы) в течение 2 ч.
   3. Инкубируйте крышку в смеси этанол-смола (1 часть 100% EtOH:3 части эпоксидной смолы) в течение ночи.
   4. Замените смесь этанол-смола свежеприготовленной чистой смолой. Инкубировать в чистой смоляной смеси в течение 8 ч. Откройте блюдо, чтобы остатки этанола испарились.
   5. Переложить крышки в новую посуду с чистой смолой и инкубировать в течение 2 ч при 37-42 °C.
   6. Заполните силиконовую форму свежеприготовленной смолой. Поместите крышки с ячейками лицом вниз на соответствующую силиконовую форму, заполненную эпоксидной смолой. Отверждают смолу в течение 24 ч при 37 °C, затем при 60 °C в течение не менее 2 дней.
      ВНИМАНИЕ: Компоненты смеси эпоксидных смол являются потенциальными канцерогенами. Надевайте перчатки и работайте под вытяжным капюшоном.
4. Снимите смоляную плиту с формы, очистите поверхность крышки скальпелем или лезвием бритвы. Чтобы удалить крышку, опустите крышку в жидкий азот, а затем переложите плиту в кипящую воду. При необходимости повторите.
5. Расположите облученную область под стереомикроскопом и вырежьте ее из плиты ножовкой или любым другим подходящим инструментом. При необходимости предварительно прогрейте плиту при температуре 70 °C на конфорке.
6. Закрепите вырез в держателе для ультрамикротомных образцов для окончательной обрезки блока. С помощью бритвы подготовьте образец пирамидальной формы. Установите держатель с пирамидой на ультрамикротом и установите нож.
   1. Обрежьте блок так, чтобы облученные ячейки с меткой EdU были включены. Подготовьте полутонкий срез (толщина 250 нм), пригодный для электронной томографии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина сечения может быть отрегулирована в соответствии с экспериментальными требованиями.
7. Отсоедините секции от края ножа и поместите их на однощелевые сетки. Для электронной томографии секции 250 нм подбираются на однощеловые сетки диаметром 1 мм и после высыхания эти участки могут быть покрыты углеродным покрытием с обеих сторон. Никаких дополнительных контрастов не требуется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку секции уже содержат высококонтрастные частицы Au-Ag, нет необходимости добавлять фидуциальные частицы золота на поверхность секции.
8. Исследуйте сетки в просвечивающем электронном микроскопе при низком увеличении (около 600x), чтобы найти клетки с соответствующими моделями репликации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол генерирует плотность маркировки, достаточно высокую для легкого обнаружения фокусов репликации даже при низком увеличении. Желательно сначала создать карту участка для последующей навигации и сбор угловых проекций для томографии. Переключитесь на более высокое увеличение и делайте изображения с высоким разрешением.

7. Электронная томография

1. Вставьте сетку в просвечивающий электронный микроскоп с помощью держателя с высоким наклоном. Загрузите образец в электронный микроскоп и найдите интересующую область.
2. Выровняйте микроскоп в режиме EFTEM в режиме почти параллельного освещения. Настройте энергетический фильтр с помощью щели 20 эВ, расположенной на пике с нулевыми потерями.
3. Предварительно облучают область получения томографии при мощности дозы 40 е/Ų/с в течение не менее 1,5-2 мин, что соответствует общей дозе не менее 3000 е/Ų.
4. Отрегулируйте высоту эйцентрика с помощью автоматической задачи в SerialEM. Проверьте задачу автофокусировки, чтобы убедиться, что она работает правильно при нулевом угле наклона и значении расфокусировки цели -0,8 мкм.
5. Наклоните держатель образца до -60° с помощью задачи Walk-Up.
6. Настройте томографию в диапазоне от -60 до +60° с шагом 2,0°. Экспозиция должна быть установлена в зависимости от угла наклона, чтобы сохранить среднюю интенсивность на камере. Ограничьте сдвиг изображения в случае, если он вызывает сдвиг энергии и, следовательно, смещение щели. Данные томографии должны быть сохранены в виде файла .mrc.
7. Импортируйте файл .mrc в программное обеспечение IMOD для реконструкции томографии. Удалите значения пикселей из-за рентгеновских лучей.
8. Выровняйте ряд наклона. Выполните начальную перекрестную корреляцию, затем вручную пометьте 10-12 частиц золота как фидуциалы. Отслеживайте фидуциальную модель и проверяйте, что каждый фидуциал отслеживается правильно через серии наклона. Создайте образцовые томограммы (срезы) и вручную пометьте тонкие границы сечения, чтобы предотвратить возможный наклон реконструированной плотности внутри объема. Средняя остаточная погрешность для точного выравнивания составляла менее 1,2 пикселя.
9. Реконструируйте томограмму с помощью отфильтрованного алгоритма обратной проекции, а затем обрежьте выходные данные, чтобы вписать интересующую область в конечный объем.

Результаты

Очаги репликации в ядрах клеток млекопитающих демонстрируют отчетливые закономерности распределения внутри ядра в зависимости от прогрессирования S-фазы. Эти паттерны коррелируют с транскрипционной активностью реплицируемых локусов. Поскольку метод, представленный здесь, использу?...

Обсуждение

Метод, описанный здесь, имеет ряд преимуществ перед ранее опубликованными протоколами. Во-первых, использование Click-химии для маркировки реплицированной ДНК устраняет необходимость в предпосылке денатурации ДНК для обнаружения BrdU антителами, тем самым лучше сохраняя ультраструктуру ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)	Thermo Fisher	A10044
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)	Fisher Scientific	BP300-100
AlexaFluor 555-azide	Termo Fisher	A20012
biotin-azide	Lumiprobe	C3730
Bovine Serum Albumine	Boval	LY-0080
DDSA	SPI-CHEM	26544-38-7
DMP-30	SPI-CHEM	90-72-2
DRAQ5	Thermo Scientific	62251
Epoxy resin monomer	SPI-CHEM	90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade)	TED PELLA, INC	18426
Gum arabic	ACROS Organics	258850010
Magnesium chloride	Panreac	141396.1209
NaBH4	SIGMA-ALDRICH	213462
NMA	SPI-CHEM	25134-21-8
N-propyl gallate	SIGMA-ALDRICH	P3130
PBS	MP Biomedicals	2810305
Silver lactate	ALDRICH	359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate	Termo Fisher	S11223
Streptavidin-Nanogold conjugate	Nanoprobes	2016
tetrachloroauric acid	SIGMA-ALDRICH	HT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	CHEM-IMPEX INT'L	298
Triton X-100	Fluka Chemica	93420
Instruments
Carbon Coater	Hitachi
Copper single slot grids	Ted Pella	1GC10H
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)	Nikon	Cy5 HQ	Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus
Diamond knife Ultra Wet 45o	Diatome	DU	Alternatives: Ted Pella
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E	Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt sample holder	Jeol
Rotator	Biosan	Multi Bio RS-24
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer	Jeol	JEM-2100	Alternatives: FEI, Hitachi
Tweezers	Ted Pella	523
Ultramicrotome	Leica	UltraCut-E	Alternatives: RMC
Software
Image acquisition	Open Source	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Image processing	Open Source	IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)