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要約

このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける 複製部位の高解像度マッピングのための技術を提示する。

要約

細胞核におけるDNAフォールディングの原理と、基本的な遺伝子機能(転写、複製、分離など)の充足中に起こるその動的形質転換は、構造的に保存された核における特定のクロマチン遺伝子座の高分解能可視化に対する実験的アプローチの欠如のために、ほとんど理解されていないままである。ここでは、新たに合成されたDNAのEdU標識と、その後の標識検出とナノ金粒子のAg増幅、クロマチンのChromEM染色を組み合わせることにより、単層細胞培養における複製ドメインを その場で可視化するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、室温サンプル処理のためのクロマチンの最良の構造保存を提供する従来のグルタルアルデヒド固定と互換性のある、高コントラスト、高効率の埋め込み前標識を可能にします。事前埋め込み標識の別の利点は、切片化のために目的の細胞を予め選択する可能性である。これは、不均一な細胞集団の分析、ならびに複製部位におけるクロマチン組織の高分解能3D分析に対する電子断層撮影アプローチとの適合性、および複製後のクロマチン再配列および相間における姉妹染色分体偏析の分析にとって特に重要である。

概要

DNA複製は、細胞分裂中の遺伝情報の忠実なコピーと伝達に必要な基本的な生物学的プロセスです。高等真核生物では、DNA複製は厳しい時空間調節を受け、これは複製起点1の逐次活性化に現れる。同期的に起動する隣接するレプリケーション オリジンは、レプリコン2 のクラスターを形成します。光学顕微鏡のレベルでは、進行中のDNA複製の部位は、様々な数およびサイズの複製病巣として検出される。複製病巣は、標識されたDNA 3,4の複製タイミングに応じて細胞核内の空間分布の特定のパターンを示し、これは次に、その遺伝子活性と密接に相関している。空間と時間で厳密に順序付けられた明確に定義されたDNA複製配列のおかげで、複製標識は、複製プロセス自体の研究だけでなく、定義された転写活性および圧縮レベルを有する特定のDNAサブフラクションを区別するためにも、正確なDNA標識の強力な方法である。複製クロマチンの可視化は、通常、DNA複製機構の主要タンパク質成分の検出(免疫染色または蛍光タンパク質タグ5,6の発現による)または修飾DNA合成前駆体の組み込みによって行われる7,8,9,10 .これらのうち、新しく複製されたDNAへの改変ヌクレオチドの組み込みに基づく方法のみが、複製中のクロマチンの立体構造変化の捕捉を可能にし、複製完了後の複製ドメインの挙動を追跡する。

高等真核生物では、クロマチンへのDNAパッケージングは、基本的な遺伝的機能(転写、複製、修復など)の調節にさらなるレベルの複雑さを加える。クロマチンフォールディングは、鋳型合成に必要な調節トランスファクターおよびDNA立体構造変化(二重らせん巻き戻し)に対するDNAのアクセス可能性に影響します。したがって、細胞核におけるDNA依存性の合成プロセスには、クロマチンの凝縮した抑制状態から、よりアクセスしやすく、開いた立体構造への構造遷移が必要であることが一般に受け入れられている。細胞学的には、これら2つのクロマチン状態は、ヘテロクロマチンおよびユークロマチンとして定義される。しかし、核内でDNAが折り畳まれる様式については、まだコンセンサスがない。この仮説は、ヌクレオソーム繊維が相分離機構によって充填密度が制御されるランダムなポリマーとして振る舞う「ポリマー溶融」モデル11から、厚さの増加12、13のクロマチン繊維様構造の逐次形成を仮定する階層折り畳みモデルまで及ぶ。階層フォールディングモデルは最近、in situDNA−DNA接触(染色体立体構造キャプチャ、3C)の解析に基づく分子アプローチから支持を得て、クロマチン構造ドメインの階層の存在を実証した14。複製単位は、これらのクロマチンドメイン15と非常によく相関していることに注意することが重要です。これらのモデルの主な批判は、細胞膜の透過処理や非クロマチン成分の除去などのサンプル調製手順によって引き起こされる潜在的な人工クロマチン凝集に基づいており、超構造研究のためのクロマチンコントラストを改善しながら、様々なプローブ(例えば、抗体)のクロマチンアクセシビリティを改善する。DNA結合性フルオロフォア媒介のジアミノベンジジン(ChromEMT6)の光酸化による電子顕微鏡検査のための選択的DNA染色における最近の技術的進歩は、この障害の排除を可能にした。しかし、複製DNAの電子顕微鏡可視化についても同じ考察が成り立つ17,18.ここでは、インタクトなアルデヒド架橋細胞において、新たに合成されたDNAとトータルクロマチンの同時高分解能超微細構造マッピングを可能にする技術について説明します。この技術は、クリックケミストリーによるEdU標識DNAの検出と、ビオチン化プローブ、ストレプトアビジン-ナノゴールド、およびChromEMTを組み合わせたものです。

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プロトコル

このプロトコルは、接着細胞用に最適化されており、HeLa、HT1080、およびCHO細胞株で試験されました。

1. 細胞標識と固定

  1. 酸洗浄されたカバースリップ上のプレートセルを3cmのペトリ皿に入れます。使用される細胞株に推奨される培地中の細胞を70%コンフルエントに増殖させる。
  2. EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)を10 mMストックから10 μM最終濃度に添加し、細胞をインキュベーター内に10分以上置きます(実験目的によって異なります)。短いパルス(最大2分)の場合は、10μM EdUを添加した予め加温した新鮮な培養培地でペトリ皿を準備し、EdUを細胞に直接加えるのではなく、その中にカバースリップを移します。
    注:その後のすべてのステップは、特に明記されていない場合は室温で実行されます。
  3. 標識細胞を2.5%グルタルアルデヒドで固定し、25%ストックを100mMカコジル酸緩衝液で希釈して作りたて、1時間固定する。
    メモ: 後続の EdU 検出ステップは、固定タイミングの影響を受けます。固定時間が長くなると、EdU ラベリングに悪影響を及ぼし、信号対雑音比が低くなる可能性があります。
  4. 5 mM MgCl2 を添加したPBSでサンプルを洗浄することによりグルタルアルデヒドを除去する(その後PBS*)。各洗浄について10分間のインキュベーションで3回洗浄する。
  5. PBS*中の1%Triton X-100(その後PBS * T)で原形質膜を透過処理する。各洗浄について5分間のインキュベーションで2回洗浄する。
  6. PBS*でサンプルを広範囲に洗浄します。5つの変更を行い、各変更で5分間インキュベートします。
  7. 残留物を含まないアルデヒド基をPBS*中の20mMグリシンでそれぞれ10分間2回クエンチする。
  8. PBS*中の1%BSAでサンプルを30分間ブロックします。

2. クリック反応

メモ: この手順は、以前に公開されたプロトコル19 から変更されています。

  1. 使用直前に、EdU検出用のクリック反応ミックスを調製する:微量遠心管内で、430 μLの100 mM Tris-HCl(pH = 8.5)、20 μLの100 mM CuSO4、1.2 μLのビオチン - アジド(DMSOで10 mM)、および50 μLの0.5 Mアスコルビン酸を混合する。蛍光顕微鏡のレベルでの複製標識およびクリック手順の品質管理のために、ビオチン - アジドはAlexaFluor 488-アジドに置き換えることができます。
    注:上記反応における成分の添加順序は重要である。
  2. 湿ったチャンバー内でクリック反応を行い、反応カクテルの蒸発と濃度の変化を最小限に抑えます。シャーレの底にろ紙の濡れたシートを置き、それをパラフィンフィルムで覆って湿ったチャンバーを準備する。細胞が上を向いた状態でフィルムの表面にカバースリップを置き、50~100μLの反応カクテルをカバースリップに重ねます。反応は室温で30分かかる。
  3. 1%Triton X-100中のサンプルをPBS*(PBS*T)中で、それぞれ5分間5回洗浄することにより、反応を停止した。
  4. PBS*T中の1%BSAを室温で30分間ブロックする。
  5. 1%BSAを含むPBS * Tでストレプトアビジン - ナノゴールド溶液を調製する。サンプルをストレプトアビジンと共にインキュベートし、1%BSA + PBS*T中の1.4nmナノゴールド粒子(ナノプローブ)と結合させ、新しく調製した湿ったチャンバー内で+4°Cで一晩インキュベートする。
  6. 反応を停止し、PBS*Tでサンプルを5回ずつ10分間洗浄します。
  7. ビオチンストレプトアビジン複合体をPBS*中の1%グルタルアルデヒド中で30分間後固定することにより安定化します。
  8. 脱イオン水で強烈に洗浄してグルタルアルデヒドを除去し、PBS*でサンプルを5回ずつ20分間洗浄します。
  9. 水に新しく調製した1mg/mLのNaBH4で遊離アルデヒド基を2回ずつ10分間クエンチする。インキュベーション中に、カバースリップを持ち上げることができるH2の気泡が形成される。ピンセットで慎重に押し下げます。
  10. 脱イオン水で5回ずつ5分間洗浄する。
    注:標識工程での品質管理のためには、蛍光標識されたストレプトアビジンで対照標識を実行することをお勧めします(図2)。これにより、退屈でアーチファクトが発生しやすい後続のステップに切り替える前に、ラベリング強度とバックグラウンドレベルの推定値が提供されます。

3. Ag増幅

注:この手順は、Gilerovitch et al., 1995から修正されている(20,21参照)。

  1. 50gのアカシア粉末を100mLの脱イオン水に再懸濁する。3日間溶解し、脱気し、4層のチーズクロスを通して濾過する。50 mL チューブ内の 5 mL アリコートで凍結して保存します。使用直前に解凍してください。
  2. アカシア粉末溶液の解凍したアリコート5mLに2mLの1 M MES(pH=6.1)を加え、アカシア粉末溶液中に7mLの0.28M MES(pH=6.1)を作る。チューブをゆっくりと30分間揺らして混ぜる。チューブをホイルで包み、光から保護します。
  3. ステップ3.2と同時に、洗浄緩衝液(50 mM MES、pH=5.8、200 mM スクロース)でカバースリップを、それぞれ10分間3回洗浄する。
  4. N-プロピル没食子酸塩(NPG)の新鮮な溶液を調製する。15 mLチューブに、10 mgのNPGを250 μLの96%エタノールに溶解し、イオン交換水で5 mLに調整する。
  5. ホイルで包んだ15mLチューブに乳酸銀36mgを入れる。
  6. ステップ 3.2 の後。完了したら、1.5mLのNPG溶液をアカシア粉末混合物に加え、さらに3分間ロックする。
    注:その後のすべてのステップは暗室で行われます。非活性セーフライト(黄色または赤)を使用してください。
  7. 洗浄バッファーでサンプルを平衡化し、暗室に進みます。同時に、乳酸銀に5mLの脱イオン水を加え、1〜2分間激しく振とうして溶解する。
  8. 乳酸銀溶液1.5mLをアカシア粉末混合物に加え、1分間ゆっくりと揺らす。混合中の酸素が反応を遅くするため、気泡の形成を避けてください。
  9. カバースリップで皿から溶液を排出し、3mLの乳酸銀 - アカシア粉末混合物を細胞に注ぐ。皿を数回揺らし、2〜5分間インキュベートする。インキュベーション時間は、アカシア粉末バッチおよび温度に依存する。これは実験的に定義する必要があります。
    注:インキュベーション時間が長くなると、不特定の銀結合が生じる可能性があります。
  10. 反応を止めるには、反応混合物を排水し、3〜5回の変化の脱イオン水で皿を広範囲に洗浄し、続いてさらに3回ずつ5分間洗浄する。
  11. 明視野顕微鏡で染色を確認します。良好な染色は、非常にかすかな黄色がかった背景を有する明るい茶色から暗褐色でなければならない。
    注:染色が発達していない場合は、すでに作られたミックスですぐに繰り返すことができます(ミックスは暗闇に保たれていれば約15分間アクティブです)。しかし、この場合の染色は速すぎる可能性があります。

4. ゴールドトーニング

注:その後の手順で銀ナノ粒子をOsO4 酸化による溶解から保護するために、この工程では金の含浸が使用される(Sawada, Esaki, 1994)22。

  1. カバースリップを脱イオン水ですすいでください。
  2. OsO4酸化による銀ナノ粒子の溶解から保護するために、サンプルを0.05%テトラクロロ金酸中で暗所で2分間インキュベートする。
  3. 脱イオン水で10分間十分に洗ってください。
    注:この段階では、DNA含有物質にさらなるコントラストが加えられる。サンプルの色は茶色から黒に変わるはずです。

5. クロム

注:このプロトコルは、Ou et al., 201716から変更されました。

  1. カバースリップをインキュベートし、PBS中の10μM DRAQ5中のサンプルを暗所で10分間飽和させます。
  2. 0.2%ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)溶液を50mMトリスまたはPBS中に調製する:
    暗所で激しく撹拌することによってDABを最終容量の90%に溶解し、次いでNaOHでpHを7.0〜7.4に調整する。体積を100%に調整し、0.22μMのフィルターでろ過し、ホイルで包んで保管します。
  3. DAB溶液を細胞(3cmペトリ皿あたり2mL)に加え、1分間インキュベートする。
  4. カバースリップをガラス底のペトリ皿に移動し、倒立顕微鏡のステージに置きます。メタルハライド光源とCy5フィルターセット(640nm、焦点面で1W/cm2)を備えた倒立顕微鏡で、プランアポλ40х(NA=0.95)レンズを介してサンプル(数視野)を10分間照射する。
    注:DAB光変換が成功したことを示す指標は、照射された核における完全なDRAQ5フォトブリーチングおよび暗いDAB沈殿物形成である。しかし、後者は、強烈なEdU-銀-金信号(特に拡張EdUパルスが利用される場合)では必ずしも明らかではない。
  5. 脱イオン水で3回ずつ5分間洗浄する。

脱水およびエポキシ樹脂包埋

  1. 微量遠心管内で、K4Fe(CN)6の2%水溶液と等量のOsO4の2%水溶液とを混合して部分還元四酸化オスミウム溶液を調製し、両成分の終濃度を1%とした。カバースリップを還元OsO4 中で1時間インキュベートし、脱イオン水で3回、それぞれ5分間洗浄する。
    注:この段階では、還元されたオスミウム化合物はDAB沈着と反応し、DNAのコントラストを高めます。
    警告:オスミウムは有毒で、ヒュームフードの下で作業し、地元の安全規制に従って廃棄物を処理します。
  2. 一連の段階的なエタノール溶液中のサンプルをより高い割合で脱水する:50%EtOH - 3 x 10分;70% EtOH - 3 x 10 分、80% EtOH - 3 x 10 分、96% EtOH - 3 x 10 分、100% EtOH - 3 x 10 分。
  3. 浸潤および埋め込みには、エポキシ樹脂モノマー:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23(w / w)の成分体積比を持つ樹脂式を使用してください。この式はエタノールと混和性である。
    1. カバースリップをエタノールレジンミックス(3部100%EtOH:1部エポキシ樹脂)に30分間インキュベートする。
    2. カバースリップをエタノールレジンミックス(1部100%EtOH:1部エポキシ樹脂)に2時間インキュベートする。
    3. カバースリップをエタノールレジンミックス(1部100%EtOH:エポキシ樹脂3部)で一晩インキュベートする。
    4. エタノール - レジンミックスを新しく調製した純粋な樹脂に置き換えます。純粋なレジンミックス中で8時間インキュベートする。皿を開けてエタノールの残りを蒸発させます。
    5. カバースリップを純樹脂で新しい皿に移し、37〜42°Cで2時間インキュベートする。
    6. シリコンモールドに作りたての樹脂を充填します。セルを下に向けてカバースリップを、エポキシ樹脂で満たされた適切なシリコンモールドの上に置きます。樹脂を37°Cで24時間、次いで60°Cで少なくとも2日間硬化させる。
      警告: エポキシ樹脂ミックスの成分は発癌物質の可能性があります。手袋を着用し、ヒュームフードの下で作業してください。
  4. 金型から樹脂スラブを取り外し、メスまたはカミソリの刃でカバースリップの表面を清掃します。カバースリップを取り外すには、カバースリップを液体窒素に落とし、スラブを沸騰水に移します。必要に応じて繰り返します。
  5. 実体顕微鏡で照射領域を見つけ、弓のこぎりやその他の適切な器具でスラブから切り取ります。必要に応じて、スラブをホットプレート上で70°Cで予備加熱する。
  6. 切り欠きをウルトラミクロトームサンプルホルダーに固定して、最終的なブロックトリミングを行います。カミソリを用いて、ピラミッド型のサンプルを調製する。ピラミッド付きのホルダーをウルトラミクロトームに取り付け、ナイフを取り付けます。
    1. EdUラベルを有する照射細胞が含まれるようにブロックをトリミングする。電子断層撮影に適した半薄切片(厚さ250nm)を用意する。
      メモ: 断面の厚さは、実験要件に合わせて調整できます。
  7. ナイフの端からセクションを取り外し、シングルスロットグリッドに配置します。電子断層撮影では、250nmの切片を1mmのシングルスロットグリッド上にピッキングし、乾燥後、両側からカーボンコーティングすることができます。追加の対比は必要ありません。
    注: セクションには既に高コントラストの Au-Ag 粒子が含まれているため、断面の表面に基準金粒子を追加する必要はありません。
  8. グリッドを低倍率(約600倍)の透過型電子顕微鏡で調べ、適切な複製パターンを有する細胞の位置を特定する。
    注: このプロトコルは、低倍率でも複製病巣を簡単に検出できるほど高い標識密度を生成します。最初に、その後のナビゲーションと断層撮影のための角度投影コレクションのためにセクションのマップを作成することをお勧めします。高倍率に切り替えて、高解像度の画像を撮影します。

7. 電子断層撮影

  1. 高傾斜ホルダーで透過型電子顕微鏡にグリッドを挿入します。試料を電子顕微鏡に装填し、関心領域を特定する。
  2. 顕微鏡をEFTEMモードでほぼ平行な照明モードで整列させます。ゼロ損失ピークに配置された20eVのエネルギー選択スリットでエネルギーフィルタを調整します。
  3. 断層撮影用領域に少なくとも1.5〜2分間、40e/Å2/sの線量率で予め照射し、これは少なくとも3000e/Å2の総線量に相当する。
  4. SerialEMの自動タスクでユーセントリック高さを調整します。オートフォーカスタスクをチェックして、ゼロチルト角と-0.8 mkmの目標デフォーカス値で正しく動作していることを確認します。
  5. ウォークアップタスクでサンプルホルダーを-60°に傾けます。
  6. 断層撮影取得をステップ2.0°で-60~+60°に設定します。露出は、カメラの平均強度を維持するために、傾斜角に応じて設定する必要があります。画像シフトを制限して、エネルギーシフトを引き起こしてスリットのミスアライメントが発生する場合に備えてください。断層撮影データは.mrcファイルとして保存する必要があります。
  7. .mrcファイルをIMODソフトウェアにインポートして、断層撮影を再構築します。X線による外れ値ピクセル値を削除します。
  8. チルト系列を揃えます。最初の相互相関を実行してから、10~12個の金粒子を基準として手動でマークします。基準モデルを追跡し、すべての基準が傾斜系列を通じて正しく追跡されていることを確認します。サンプル断層図(スライス)を作成し、細い断面の境界線を手動でマークして、ボリューム内の再構築された密度の傾きを防ぎます。ファインアライメントの平均残差誤差は1.2pix未満でした。
  9. フィルター処理された逆投影アルゴリズムを使用して断層画像を再構築し、目的の領域を最終的なボリュームに合わせるように出力をトリミングします。

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結果

哺乳動物細胞核における複製病巣は、S期進行に応じて核内の分布の明確なパターンを示す。これらのパターンは、複製される遺伝子座の転写活性と相関する。ここで提示された方法は、かなり強い固定手順を利用するので、室温化学固定によって得られたクロマチンの最良の構造保存を提供する条件下でも、様々な転写状態におけるクロマチン遺伝子座の特異的検出に複製パルス標識を使用...

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ディスカッション

ここで説明する方法には、以前に公開されたプロトコルに比べていくつかの利点があります。第一に、複製されたDNAを標識するためにClick-chemistryを使用することで、抗体によるBrdU検出のためのDNA変性の前提条件の必要性が排除され、クロマチンの超構造をよりよく保存できます。

第二に、グルタルアルデヒド固定および結合していないアルデヒド基の適切なクエンチ後...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません

謝辞

この作業は、RSF (助成金 #17-15-01290) と RFBR (助成金 #19-015-00273) によって部分的にサポートされました。著者らは、ロモノーソフ・モスクワ州立大学開発プログラム(PNR 5.13)とベロゼルスキー物理化学生物学研究所の相関イメージングにおけるニコン・センター・オブ・エクセレンスに、イメージング機器へのアクセスに感謝している。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)Thermo FisherA10044
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)Fisher ScientificBP300-100
AlexaFluor 555-azideTermo FisherA20012
biotin-azideLumiprobeC3730
Bovine Serum AlbumineBovalLY-0080
DDSASPI-CHEM26544-38-7
DMP-30SPI-CHEM90-72-2
DRAQ5Thermo Scientific62251
Epoxy resin monomerSPI-CHEM90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade)TED PELLA, INC18426
Gum arabicACROS Organics258850010
Magnesium chloridePanreac141396.1209
NaBH4SIGMA-ALDRICH213462
NMASPI-CHEM25134-21-8
N-propyl gallateSIGMA-ALDRICHP3130
PBSMP Biomedicals2810305
Silver lactateALDRICH359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugateTermo FisherS11223
Streptavidin-Nanogold conjugateNanoprobes2016
tetrachloroauric acidSIGMA-ALDRICHHT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)CHEM-IMPEX INT'L298
Triton X-100Fluka Chemica93420
Instruments
Carbon CoaterHitachi
Copper single slot gridsTed Pella1GC10H
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)NikonCy5 HQAlternatives: Zeiss, Leica, Olympus
Diamond knife Ultra Wet 45oDiatomeDUAlternatives: Ted Pella
Fluorescent microscopeNikonTi-EAlternatives: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt sample holderJeol
RotatorBiosanMulti Bio RS-24
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometerJeolJEM-2100Alternatives: FEI, Hitachi
TweezersTed Pella523
UltramicrotomeLeicaUltraCut-EAlternatives: RMC
Software
Image acquisitionOpen SourceSerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Image processingOpen SourceIMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)

参考文献

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