JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT'nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.

Özet

Hücre çekirdeğinde DNA katlanmasının prensipleri ve temel genetik fonksiyonların (transkripsiyon, replikasyon, ayrışma vb.) yerine getirilmesi sırasında meydana gelen dinamik dönüşümleri, kısmen yapısal olarak korunmuş çekirdeklerde spesifik kromatin lokuslarının yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine yönelik deneysel yaklaşımların bulunmaması nedeniyle tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, yeni sentezlenen DNA'nın EdU etiketlemesini, daha sonra Nanogold parçacıklarının Ag-amplifikasyonu ve kromatinin ChromEM boyaması ile sonraki etiket tespiti ile birleştirerek, tek katmanlı hücre kültüründe replikatif alanların in situ olarak görselleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, oda sıcaklığında numune işleme için kromatinin en iyi yapısal korumasını sağlayan geleneksel glutaraldehit fiksasyonu ile uyumlu, yüksek kontrastlı, yüksek verimli ön gömme etiketlemesine izin verir. Önceden gömme etiketlemenin bir diğer avantajı, bölümleme için ilgilenilen hücreleri önceden seçme olasılığıdır. Bu, özellikle heterojen hücre popülasyonlarının analizinin yanı sıra, replikasyon bölgelerinde kromatin organizasyonunun yüksek çözünürlüklü 3D analizine elektron tomografisi yaklaşımlarıyla uyumluluk ve replikatif sonrası kromatin yeniden düzenlenmesi ve ara fazda kardeş kromatid ayrışmasının analizi için önemlidir.

Giriş

DNA replikasyonu, hücre bölünmesi sırasında genetik bilginin sadık bir şekilde kopyalanması ve iletilmesi için gerekli olan temel bir biyolojik süreçtir. Daha yüksek ökaryotlarda, DNA replikasyonu, replikasyon kökenlerinin sıralı aktivasyonunda kendini gösteren sıkı uzaysal-zamansal düzenlemeye tabi tutulur1. Eşzamanlı olarak ateşlenen komşu çoğaltma kaynakları, replikon2 kümeleri oluşturur. Optik mikroskopi düzeyinde, devam eden DNA replikasyon bölgeleri, çeşitli sayı ve büyüklükte replikasyon odakları olarak tespit edilir. Replikasyon odakları, etiketli DNA 3,4'ün replikasyon zamanlamasına bağlı olarak hücre çekirdeği içindeki belirli uzamsal dağılım kalıplarını gösterir ve bu da gen aktivitesi ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Uzay ve zamanda kesin olarak sıralanmış iyi tanımlanmış DNA replikasyon dizisi sayesinde, replikatif etiketleme, sadece replikasyon sürecinin kendi başına incelenmesi için değil, aynı zamanda tanımlanmış transkripsiyon aktivitesi ve sıkıştırma seviyesi ile spesifik bir DNA alt fraksiyonunu ayırt etmek için de güçlü bir hassas DNA etiketleme yöntemidir. Replikasyon kromatininin görselleştirilmesi genellikle DNA replikasyon makinesinin ana protein bileşenlerinin tespiti yoluyla (immünoboyama veya floresan protein etiketlerinin ekspresyonu 5,6) veya modifiye DNA sentezi öncüllerinin dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilir 7,8,9,10 . Bunlardan sadece modifiye nükleotidlerin yeni kopyalanmış DNA'ya dahil edilmesine dayanan yöntemler, replikasyon sırasında kromatindeki konformasyonel değişikliklerin yakalanmasına izin verir ve replikasyonları tamamlandıktan sonra replikatif alanların davranışını izler.

Daha yüksek ökaryotlarda, kromatine DNA paketlemesi, temel genetik fonksiyonların (transkripsiyon, replikasyon, onarım vb.) düzenlenmesine başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Kromatin katlaması, DNA'nın düzenleyici trans-faktörlere ve şablon sentezi için gerekli DNA konformasyonel değişikliklerine (çift sarmal çözme) erişilebilirliğini etkiler. Bu nedenle, hücre çekirdeğindeki DNA'ya bağımlı sentetik süreçlerin, kromatinin yoğunlaşmış, baskıcı durumundan daha erişilebilir, açık bir konformasyona yapısal bir geçişini gerektirdiği genel olarak kabul edilmektedir. Sitolojik olarak, bu iki kromatin durumu heterokromatin ve ökromatin olarak tanımlanır. Bununla birlikte, çekirdekte DNA'nın katlanma şekli konusunda hala bir fikir birliği yoktur. Hipotezler, nükleozomal elyafın, ambalaj yoğunluğunun faz ayırma mekanizmaları tarafından kontrol edildiği rastgele bir polimer gibi davrandığı bir "polimer eriyik" model11'den, artan kalınlıkta kromatin lifi benzeri yapıların sıralı oluşumunu varsayan hiyerarşik katlanma modellerine kadar uzanmaktadır12,13. Hiyerarşik katlama modelleri son zamanlarda in situ DNA-DNA temaslarının (kromozom konformasyon yakalama, 3C) analizine dayanan moleküler yaklaşımlardan destek alarak, kromatin yapısal alanlarının hiyerarşisinin varlığını göstermiştir14. Replikasyon birimlerinin bu kromatin alanları15 ile çok iyi ilişkili olduğunu belirtmek önemlidir. Bu modellerin başlıca eleştirisi, çeşitli problar (örneğin, antikorlar) için kromatin erişilebilirliğini artırırken, ultrayapısal çalışmalar için kromatin kontrastını iyileştirmek amacıyla, hücre zarlarının geçirgenleştirilmesi ve kromatin olmayan bileşenlerin çıkarılması gibi numune hazırlama prosedürlerinin neden olduğu potansiyel yapay kromatin agregasyonuna dayanmaktadır. Diaminobenzidinin (ChromEMT6) DNA bağlayıcı florofor aracılı foto-oksidasyonu ile elektron mikroskobu için seçici DNA boyamadaki son teknik gelişmeler, bu engelin ortadan kaldırılmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, aynı hususlar, DNA 17,18'i kopyalayan elektron mikroskobu görselleştirmesi için de geçerlidir. Burada, bozulmamış aldehit çapraz bağlı hücrelerde yeni sentezlenen DNA ve toplam kromatinin eşzamanlı yüksek çözünürlüklü ultrastrüktürel haritalanmasına izin veren bir tekniği açıklıyoruz. Teknik, EdU etiketli DNA'nın Click-kimyası ile biyotinile problar ve streptavidin-Nanogold ve ChromEMT ile tespitini birleştirir.

Protokol

Protokol, yapışkan hücreler için optimize edilmiştir ve HeLa, HT1080 ve CHO hücre hatları üzerinde test edilmiştir.

1. Hücre etiketleme ve sabitleme

  1. Asitle temizlenmiş kapaklar üzerindeki plaka hücreleri 3 cm'lik bir Petri kabında kayar. Kullanılan hücre hattı için önerilen ortamdaki hücreleri% 70 akıcılığa kadar büyütün.
  2. 10 mM stoktan 10 μM nihai konsantrasyona EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin) ekleyin ve hücreleri inkübatöre 10 dakika veya daha uzun süre yerleştirin (deney amacına bağlı olarak). Daha kısa darbeler için (2 dakikaya kadar), 10 μM EdU ile desteklenmiş önceden ısıtılmış taze kültür ortamı içeren bir Petri kabı hazırlayın ve doğrudan hücrelere EdU eklemek yerine kapakları aktarın.
    NOT: Sonraki tüm adımlar, aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
  3. Etiketli hücreleri, 100 mM kakodilat tamponunda% 25 stok seyreltilerek taze yapılan% 2.5 glutaraldehit ile 1 saat boyunca sabitleyin.
    NOT: Sonraki EdU algılama adımları sabitleme zamanlamasına duyarlıdır. Daha uzun sabitleme süreleri, EdU etiketlemesini olumsuz yönde etkileyerek daha düşük sinyal-gürültü oranına neden olabilir.
  4. Glutaraldehiti 5 mM MgCl2 (PBS* ile desteklenmiş PBS ile yıkayarak çıkarın. Her yıkama için 10 dakikalık bir inkübasyonla üç kez yıkayın.
  5. PBS'de* %1 Triton X-100 ile plazma membranlarını geçirgenleştirin (bundan sonra PBS*T). Her yıkama için 5 dakikalık bir inkübasyonla iki kez yıkayın.
  6. Numuneyi PBS* ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Beş değişiklik yapın ve her değişiklikte 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  7. Kalıntı içermeyen aldehit gruplarını PBS'de* 20 mM glisin ile her biri 10 dakika boyunca iki kez söndürün.
  8. Numuneleri PBS'de* %1 BSA'da 30 dakika boyunca bloke edin.

2. Tıklama reaksiyonu

NOT: Bu yordam daha önce yayımlanmış bir protokol19'dan değiştirilir.

  1. Kullanımdan hemen önce, EdU tespiti için Click-reaksiyon karışımını hazırlayın: bir mikrosantrifüj tüpünde, 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL 100 mM CuSO4, 1.2 μL biyotin-azid (DMSO'da 10 mM) ve 50 μL 0.5 M askorbik asit karışımı. Floresan mikroskopi düzeyinde replikatif etiketleme ve Tıklama prosedürünün kalite kontrolü için, biyotin-azid AlexaFluor 488-azid ile değiştirilebilir.
    NOT: Yukarıdaki reaksiyondaki bileşenlerin eklenme sırası önemlidir.
  2. Reaksiyon kokteylindeki buharlaşmayı ve konsantrasyon kaymalarını en aza indirmek için nemli bir odada tıklama reaksiyonu gerçekleştirin. Petri kabının dibine ıslak bir filtre kağıdı tabakası yerleştirerek ve bir parafin filmle kaplayarak nemli odayı hazırlayın. Kapak kaymalarını, hücreler yukarı bakacak şekilde filmin yüzeyine yerleştirin ve reaksiyon kokteylinin 50-100 μL'sini kapak kapağına yerleştirin. Reaksiyon oda sıcaklığında 30 dakika sürer.
  3. Numuneyi PBS* (PBS*T) içinde %0,1 Triton X-100'de, her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkayarak reaksiyonu durdurun.
  4. PBS*T'de %1 BSA'da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edin.
  5. % 1 BSA içeren PBS * T ile streptavidin-Nanogold çözeltisi hazırlayın. Numuneyi, yeni hazırlanan nemli odada +4 ° C'de% 1 BSA + PBS * T'de 1.4 nm Nanogold parçacıkları (Nanoproblar) ile konjuge edilmiş streptavidin ile inkübe edin.
  6. Reaksiyonu durdurun ve numuneyi PBS*T'de, her biri 10 dakika boyunca beş kez yıkayın.
  7. PBS'de* %1 glutaraldehit içine 30 dakika boyunca son sabitleme yaparak biyotin streptavidin kompleksini stabilize edin.
  8. Deiyonize suyla yoğun bir şekilde yıkayarak glutaraldehiti çıkarın ve numuneyi PBS'de* her biri 20 dakika boyunca beş kez yıkayın.
  9. Serbest aldehit gruplarını taze hazırlanmış 1 mg/mL NaBH4 ile suda her biri 10 dakika boyunca iki kez söndürün. Kuluçka sırasında, kapak kaymalarını kaldırabilenH2 kabarcıkları oluşur. Onları cımbızla dikkatlice aşağı itin.
  10. Her biri 5 dakika boyunca beş kez deiyonize su ile yıkayın.
    NOT: Etiketleme adımında kalite kontrolü için, floresan etiketli streptavidin ile kontrol etiketlemesinin yapılması önerilir (Şekil 2). Bu, sıkıcı ve artefakta eğilimli sonraki adımlara geçmeden önce etiketleme yoğunluğunun ve arka plan seviyesinin bir tahminini sağlayacaktır.

3. Ag-amplifikasyonu

NOT: Bu prosedür Gileroviç ve ark., 1995'ten değiştirilmiştir (bkz. 20,21).

  1. 100 mL deiyonize suda 50 g akasya tozunu tekrar askıya alın. 3 gün boyunca çözün, gazı çözün ve dört kat tülbent ile süzün. 50 mL tüplerde 5 mL alikotlarda dondurulmuş olarak saklayın. Kullanmadan hemen önce çözün.
  2. Akasya tozu çözeltisinde 7 mL'lik 0.28 M MES (pH = 6.1) yapmak için 2 mL'lik 1 M MES (pH = 6.1) ila 5 mL çözülmüş akasya tozu çözeltisi aliquot ekleyin. Tüpü 30 dakika boyunca yavaşça sallayarak karıştırın. Işıktan korumak için tüpü folyo ile sarın.
  3. Adım 3.2. ile eşzamanlı olarak, kapakları yıkama tamponu (50 mM MES, pH = 5.8, 200 mM sakaroz) ile yıkayın, her biri 10 dakika boyunca üç kez.
  4. Taze N-propil galat (NPG) çözeltisini hazırlayın. 15 mL'lik bir tüpte, 10 mg NPG'yi 250 μL% 96 etanol içinde çözün ve deiyonize su ile 5 mL'ye ayarlayın.
  5. Folyo sarılı 15 mL'lik bir tüpe 36 mg gümüş laktat koyun.
  6. Adım 3.2'den sonra. tamamlandığında, akasya tozu karışımına 1,5 mL NPG çözeltisi ekleyin ve 3 dakika daha sallayın.
    NOT: Sonraki tüm adımlar karanlık bir odada gerçekleştirilir. Aktinik olmayan güvenli ışık kullanın (sarı veya kırmızı).
  7. Numuneyi yıkama tamponu ile dengeleyin ve karanlık odaya geçin. Aynı zamanda, gümüş laktat üzerine 5 mL deiyonize su ekleyin ve 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak çözün.
  8. Akasya tozu karışımına 1,5 mL gümüş laktat çözeltisi ekleyin, 1 dakika boyunca yavaşça sallayın. Kabarcık oluşumundan kaçının, çünkü karışımdaki oksijen reaksiyonu yavaşlatır.
  9. Çözeltiyi kapaklarla tabaktan boşaltın ve hücrelere 3 mL gümüş laktat-akasya tozu karışımı dökün. Yemeği birkaç kez sallayın ve 2-5 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresi akasya tozu partisine ve sıcaklığa bağlıdır. Bu deneysel olarak tanımlanmalıdır.
    NOT: Daha uzun bir inkübasyon süresi, spesifik olmayan gümüş bağlanmaya neden olabilir.
  10. Reaksiyonu durdurmak için, reaksiyon karışımını boşaltın ve bulaşığı üç ila beş deiyonize su değişikliği ile kapsamlı bir şekilde yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca üç değişiklik daha yapın.
  11. Parlak alan mikroskobu altında lekelenmeyi kontrol edin. İyi boyama, çok soluk sarımsı bir arka plan ile açık ila koyu kahverengi olmalıdır.
    NOT: Boyama gelişmiyorsa, önceden yapılmış karışımla hemen tekrarlamak mümkündür (karışım karanlıkta tutulursa yaklaşık 15 dakika boyunca aktiftir). Bununla birlikte, bu durumda lekelenme çok hızlı gelişebilir.

4. Altın tonlama

NOT: Sonraki prosedürlerde gümüş nanopartikülleri OsO4 oksidasyonu ile çözünmeye karşı korumak için, bu adımda altın ile emprenye edilmesi kullanılır (Sawada, Esaki, 1994)22.

  1. Deiyonize su ile kapakları durulayın.
  2. Gümüş nanopartikülleri OsO4 oksidasyonu ile çözünmeye karşı korumak için, numuneleri karanlıkta 2 dakika boyunca% 0.05 tetrakloroaurik asit içinde inkübe edin.
  3. 10 dakika boyunca deiyonize su ile iyice yıkayın.
    NOT: Bu aşamada, DNA içeren materyale ek kontrast eklenir. Numunenin rengi kahverengiden siyaha değişmelidir.

5. KromEM

NOT: Bu protokol Ou ve ark., 201716'dan değiştirilmiştir.

  1. Kapakları inkübe edin ve numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca PBS'de 10 μM DRAQ5'te doyurun.
  2. 50 mM Tris veya PBS'de% 0.2 diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi hazırlayın:
    DAB'ı karanlıkta kuvvetlice karıştırarak nihai hacmin% 90'ında çözün, ardından pH'ı NaOH ile 7.0-7.4'e ayarlayın. Ses seviyesini% 100'e ayarlayın ve 0,22 μM'lik bir filtreden süzün, folyoya sarılı olarak saklayın.
  3. Hücrelere DAB çözeltisi ekleyin (3 cm Petri kabı başına 2 mL) ve 1 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Kapak kapağını cam alt Petri kabına taşıyın ve ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Metal halojenür ışık kaynağı ve Cy5 filtre seti (640 nm, odak düzleminde 1 W/cm2) ile ters çevrilmiş bir mikroskopta numuneyi (birkaç görüş alanı) Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) lensle 10 dakika boyunca ışınlayın.
    NOT: Başarılı DAB fotodönüşümünün bir göstergesi, ışınlanmış çekirdeklerde tam DRAQ5 fotobeyazlatma ve koyu DAB çökelti oluşumudur. Bununla birlikte, ikincisi yoğun EdU-gümüş-altın sinyali üzerinde her zaman belirgin değildir (özellikle genişletilmiş EdU darbeleri kullanıldığında).
  5. Her biri 5 dakika boyunca üç kez deiyonize su ile yıkayın.

6. Dehidrasyon ve epoksi reçine gömme

  1. Bir mikrosantrifüj tüpünde, her iki bileşenin% 1'lik nihai konsantrasyonunu elde etmek için,% 2'lik sulu K4Fe (CN) 6 çözeltisini% 2'lik eşit miktarda% 2'lik sulu OsO4 çözeltisi ile karıştırarak kısmen indirgenmiş osmiyum tetraoksit çözeltisi hazırlayın. Kapakları indirgenmiş OsO4'te 1 saat boyunca inkübe edin ve her biri 5 dakika boyunca üç kez deiyonize suda yıkayın.
    NOT: Bu aşamada, indirgenmiş ozmiyum bileşiği DAB birikimleri ile reaksiyona girer ve DNA'nın kontrastını arttırır.
    DİKKAT: Osmiyum zehirlidir, bir duman davlumbazının altında çalışır ve atıkları yerel güvenlik düzenlemelerine göre işler.
  2. Numuneleri bir dizi derecelendirilmiş etanol çözeltisinde artan yüzdelerde kurutun:% 50 EtOH - 3 x 10 dakika; %70 EtOH - 3 x 10 dakika, %80 EtOH - 3 x 10 dakika, %96 EtOH - 3 x 10 dakika, %100 EtOH - 3 x 10 dk.
  3. Sızma ve gömme için, bileşen hacimsel oranına sahip reçine formülünü aşağıdaki gibi kullanın: epoksi reçine monomeri: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (w / w). Bu formül etanol ile karışabilir.
    1. Kapak kaymasını 30 dakika boyunca etanol-reçine karışımında (3 parça% 100 EtOH: 1 parça epoksi reçine) inkübe edin.
    2. Kapak kaymasını 2 saat boyunca etanol-reçine karışımında (1 kısım% 100 EtOH: 1 kısım epoksi reçine) inkübe edin.
    3. Kapak kaymasını etanol-reçine karışımında (1 kısım% 100 EtOH: 3 parça epoksi reçine) gece boyunca inkübe edin.
    4. Etanol-reçine karışımını taze hazırlanmış saf reçine ile değiştirin. 8 saat boyunca saf reçine karışımında inkübe edin. Etanol kalıntılarının buharlaşmasına izin vermek için çanağı açın.
    5. Transfer kapakları saf reçineli yeni bir kaba koyun ve 37-42 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
    6. Bir silikon kalıbı taze hazırlanmış reçine ile doldurun. Kapak kapaklarını, hücreler aşağı bakacak şekilde epoksi reçine ile doldurulmuş uygun silikon kalıba yerleştirin. Reçineyi 37 ° C'de 24 saat, daha sonra 60 ° C'de en az 2 gün boyunca kürleyin.
      DİKKAT: Epoksi reçine karışımının bileşenleri potansiyel kanserojenlerdir. Eldiven giyin ve duman başlığının altında çalışın.
  4. Reçine levhayı kalıptan çıkarın, kapak kapağının yüzeyini neşter veya tıraş bıçağı ile temizleyin. Kapak kaymasını çıkarmak için, kapak kaymasını sıvı azot içine bırakın ve ardından levhayı kaynar suya aktarın. Gerekirse tekrarlayın.
  5. Işınlanan alanı bir stereomikroskop altında bulun ve demir testeresi veya başka bir uygun aletle levhadan kesin. Gerekirse, levhayı 70 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde önceden ısıtın.
  6. Son blok kırpma için kesimi ultramikrotomlu bir numune tutucuya sabitleyin. Jileti kullanarak, piramit şeklindeki örneği hazırlayın. Tutucuyu piramitle ultramikrotom üzerine monte edin ve bıçağı takın.
    1. Bloğu, EdU etiketini taşıyan ışınlanmış hücreler dahil edilecek şekilde kırpın. Elektron tomografisi için uygun yarı ince bir kesit (250 nm kalınlığında) hazırlayın.
      NOT: Kesit kalınlığı deneysel gerekliliklere uyacak şekilde ayarlanabilir.
  7. Bölümü bıçağın kenarından ayırın ve tek yuvalı ızgaralara yerleştirin. Elektron tomografisi için 1 mm tek yuvalı ızgaralara 250 nm kesitler alınır ve kuruduktan sonra bu kesitler her iki taraftan da karbon kaplamalı olabilir. Ek bir kontrast gerekmez.
    NOT: Bölümler zaten yüksek kontrastlı Au-Ag parçacıkları içerdiğinden, bölümün yüzeyine güvenilir altın parçacıkları eklemeye gerek yoktur.
  8. Uygun replikasyon modellerine sahip hücreleri bulmak için ızgaraları bir iletim elektron mikroskobunda düşük büyütmede (yaklaşık 600x) inceleyin.
    NOT: Bu protokol, düşük büyütmede bile çoğaltma odaklarının kolayca algılanması için yeterince yüksek etiketleme yoğunluğu oluşturur. Öncelikle sonraki navigasyon için bölümün bir haritasının oluşturulması ve tomografi için açısal projeksiyon toplanması önerilir. Daha yüksek büyütmeye geçin ve yüksek çözünürlüklü görüntüler çekin.

7. Elektron tomografisi

  1. Izgarayı, yüksek eğimli bir tutucu ile iletim elektron mikroskobuna yerleştirin. Numuneyi elektron mikroskobuna yükleyin ve ilgilenilen bölgeyi bulun.
  2. EFTEM modunda mikroskobu neredeyse paralel aydınlatma modunda hizalayın. Enerji filtresini, sıfır kayıp zirvesine yerleştirilmiş 20 eV enerji seçici yarıkla ayarlayın.
  3. Tomografi edinim alanını en az 1.5-2 dakika boyunca 40 e/ş2/s doz hızında ışınlayın, bu da toplam doza en az 3000 e/Å2 karşılık gelir.
  4. SerialEM'deki otomatik görevle ösentrik yüksekliği ayarlayın. Sıfır eğim açısında ve -0,8 mkm hedef bulanıklaştırma değerinde doğru çalıştığından emin olmak için otomatik odaklama görevini kontrol edin.
  5. Walk-Up görevi ile numune tutucuyu -60°'ye eğin.
  6. Tomografi alımını adım 2.0° ile -60 ila +60° arasında ayarlayın. Pozlama, kameradaki ortalama yoğunluğu korumak için eğim açısına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Bir enerji kaymasına neden olması ve dolayısıyla yanlış hizalamayı kesmesi ihtimaline karşı görüntü kaymasını sınırlayın. Tomografi verileri .mrc dosyası olarak kaydedilmelidir.
  7. Tomografi rekonstrüksiyonu için .mrc dosyasını IMOD yazılımına aktarın. X-ışınları nedeniyle aykırı piksel değerlerini kaldırın.
  8. Eğim serisini hizalayın. İlk çapraz korelasyonu gerçekleştirin, ardından 10-12 altın parçacığını referans olarak manuel olarak işaretleyin. Referans modelini izleyin ve her referansın eğim serisi boyunca doğru şekilde izlendiğini kontrol edin. Örnek tomogramlar (dilimler) oluşturun ve yeniden yapılandırılmış yoğunluğun hacim içinde olası eğimini önlemek için ince kesit kenarlıklarını manuel olarak işaretleyin. İnce hizalamada ortalama kalıntı hata 1.2 pix'ten azdı.
  9. Tomogramı filtrelenmiş bir geri projeksiyon algoritmasıyla yeniden yapılandırın ve ardından çıktıyı, ilgilenilen bölgeyi son birime sığdıracak şekilde kırpın.

Sonuçlar

Memeli hücre çekirdeklerindeki replikasyon odakları, S-fazı ilerlemesine bağlı olarak çekirdek içinde farklı dağılım paternleri gösterir. Bu modeller, çoğaltılan lokusların transkripsiyonel aktivitesi ile ilişkilidir. Burada sunulan yöntem oldukça güçlü bir sabitleme prosedürü kullandığından, oda sıcaklığında kimyasal fiksasyon ile elde edilen kromatinin en iyi yapısal korumasını sunan koşullar altında bile, çeşitli transkripsiyonel durumlarda kromatin lokuslarının spesifik tespit...

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntemin daha önce yayımlanmış protokollere göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, replika DNA'yı etiketlemek için Click-kimyasının kullanılması, antikorlarla BrdU tespiti için DNA denatürasyon ön koşulunun gerekliliğini ortadan kaldırır, böylece kromatin ultrayapısını daha iyi korur.

İkincisi, glutaraldehit fiksasyonundan sonra üretilen ikincil bir ligand olarak biyotinin kullanılması ve bağlanmamış aldehit gruplarının uygun şekilde s...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen RSF (hibe #17-15-01290) ve RFBR (hibe #19-015-00273) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, görüntüleme enstrümantasyonuna erişim için Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü'nde Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi geliştirme programına (PNR 5.13) ve Nikon Mükemmeliyet Merkezi'ne korelasyon görüntülemede teşekkür ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)Thermo FisherA10044
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)Fisher ScientificBP300-100
AlexaFluor 555-azideTermo FisherA20012
biotin-azideLumiprobeC3730
Bovine Serum AlbumineBovalLY-0080
DDSASPI-CHEM26544-38-7
DMP-30SPI-CHEM90-72-2
DRAQ5Thermo Scientific62251
Epoxy resin monomerSPI-CHEM90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade)TED PELLA, INC18426
Gum arabicACROS Organics258850010
Magnesium chloridePanreac141396.1209
NaBH4SIGMA-ALDRICH213462
NMASPI-CHEM25134-21-8
N-propyl gallateSIGMA-ALDRICHP3130
PBSMP Biomedicals2810305
Silver lactateALDRICH359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugateTermo FisherS11223
Streptavidin-Nanogold conjugateNanoprobes2016
tetrachloroauric acidSIGMA-ALDRICHHT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)CHEM-IMPEX INT'L298
Triton X-100Fluka Chemica93420
Instruments
Carbon CoaterHitachi
Copper single slot gridsTed Pella1GC10H
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)NikonCy5 HQAlternatives: Zeiss, Leica, Olympus
Diamond knife Ultra Wet 45oDiatomeDUAlternatives: Ted Pella
Fluorescent microscopeNikonTi-EAlternatives: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt sample holderJeol
RotatorBiosanMulti Bio RS-24
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometerJeolJEM-2100Alternatives: FEI, Hitachi
TweezersTed Pella523
UltramicrotomeLeicaUltraCut-EAlternatives: RMC
Software
Image acquisitionOpen SourceSerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Image processingOpen SourceIMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)

Referanslar

  1. Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
  2. Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
  3. Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
  4. Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
  5. Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
  6. Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
  7. Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
  8. Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
  9. Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
  10. Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
  11. Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
  12. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
  13. Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
  14. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
  15. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  16. Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
  17. Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
  18. Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
  19. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  20. Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
  21. Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
  22. Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
  23. He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
  24. Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır