Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica

Resumo

Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.

Resumo

Os princípios de dobramento do DNA no núcleo celular e suas transformações dinâmicas que ocorrem durante o cumprimento de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, segregação, etc.) permanecem mal compreendidos, em parte devido à falta de abordagens experimentais para visualização de alta resolução de locis de cromatina específica em núcleos estruturalmente preservados. Aqui apresentamos um protocolo para a visualização de domínios replicativos na cultura de células monocamadas in situ, combinando rotulagem EdU de DNA recém-sintetizado com posterior detecção de rótulo com amplificação ag de partículas nanogold e coloração chromEM de cromatina. Este protocolo permite a rotulagem pré-incorporação de alto contraste e alta eficiência, compatível com a fixação tradicional de glutaraldeído que fornece a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Outra vantagem da rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de pré-selecionar células de interesse para secção. Isso é especialmente importante para a análise de populações de células heterogêneas, bem como compatibilidade com abordagens de tomografia eletrônica para análise 3D de alta resolução da organização cromatina em locais de replicação, e a análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina e da segregação cromátide irmã na interfase.

Introdução

A replicação do DNA é um processo biológico básico necessário para cópia e transmissão fiel das informações genéticas durante a divisão celular. Em eucariotes mais altos, a replicação de DNA é submetida a uma regulação espátula-temporal apertada, que se manifesta na ativação sequencial das origens de replicação¹. Origens de replicação vizinhas disparando sincronizadamente formam aglomerados de replicons². Ao nível da microscopia óptica, locais de replicação contínua de DNA são detectados como focos de replicação de vários números e tamanhos. Os focos de replicação exibem padrões específicos de distribuição espacial dentro do núcleo celular, dependendo do tempo de replicação do DNA^{rotulado 3,4}, que, por sua vez, está fortemente correlacionado com sua atividade genética. Graças à sequência bem definida de replicação de DNA, estritamente ordenada no espaço e no tempo, a rotulagem replicativa é um método poderoso de rotulagem precisa de DNA não apenas para o estudo do processo de replicação em si, mas também para discriminar uma sub fração de DNA específica com atividade de transcrição definida e nível de compactação. A visualização da cromatina replicante é geralmente realizada através da detecção de componentes proteicos principais de máquinas de replicação de DNA (seja por imunostaining ou por expressão de marcas de proteína fluorescente ^5,6) ou pela incorporação de precursores de síntese de DNA modificados ^7,8,9,10 . Destes, apenas métodos baseados na incorporação de nucleotídeos modificados em DNA recém-replicado permitem a captura de alterações conformais na cromatina durante a replicação, e traçam o comportamento dos domínios replicativos após sua replicação ser concluída.

Em eucariotes mais altos, a embalagem de DNA em cromatina adiciona outro nível de complexidade à regulação de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, reparação, etc.). A dobra de cromatina afeta a acessibilidade do DNA a fatores transregulatórios e alterações conformais de DNA (duplo desenrolar de hélice) necessárias para a síntese do modelo. Portanto, é geralmente aceito que processos sintéticos dependentes de DNA no núcleo celular requerem uma transição estrutural da cromatina de seu estado condensado e repressivo para uma conformação mais acessível e aberta. Citologicamente, esses dois estados de cromatina são definidos como heterocromatina e eucromatina. No entanto, ainda não há consenso sobre o modo de dobramento de DNA no núcleo. As hipóteses variam de um modelo¹¹ de "derretimento de polímeros", onde a fibra nucleosômica se comporta como um polímero aleatório para o qual a densidade de embalagem é controlada por mecanismos de separação de fase, até modelos hierárquicos dobráveis postulando formação sequencial de estruturas de fibras de cromatina de espessura crescente^12,13. Modelos hierárquicos dobráveis recentemente ganharam apoio de abordagens moleculares com base na análise de contatos in situ DNA-DNA (captura de conformação cromossomo, 3C), demonstrando a existência da hierarquia dos domínios estruturais da cromatina¹⁴. É importante notar que as unidades de replicação se correlacionam muito bem com esses domínios de cromatina¹⁵. A maior crítica desses modelos baseia-se na potencial agregação artificial de cromatina causada por procedimentos de preparação de amostras, como permeabilização de membranas celulares e remoção de componentes não cromatinas, a fim de melhorar o contraste da cromatina para estudos ultraestruturais, melhorando a acessibilidade da cromatina para várias sondas (por exemplo, anticorpos). Os recentes avanços técnicos na coloração seletiva de DNA para microscopia eletrônica por foto-oxidação mediada por fluoroforino mediado pelo DNA de diaminobenzidina (ChromEMT⁶) permitiram a eliminação deste obstáculo. No entanto, as mesmas considerações são verdadeiras para a visualização da microscopia eletrônica da replicação do DNA^17,18. Aqui descrevemos uma técnica que permite o mapeamento ultraestrutural de alta resolução simultânea do DNA recém-sintetizado e cromatina total em células intactas cruzadas de aldeído. A técnica combina a detecção de DNA rotulado pela EdU por click-química com sondas biotiniladas e streptavidin-Nanogold, e ChromEMT.

Protocolo

O protocolo é otimizado para células aderentes e foi testado nas linhas celulares HeLa, HT1080 e CHO.

1. Rotulagem e fixação de células

1. Células de placa em tampas limpas com ácido em uma placa de Petri de 3 cm. Cultivar as células na mídia recomendadas para a linha celular sendo usada para 70% de confluência.
2. Adicione EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) de 10 mM de estoque para 10 μM de concentração final e coloque as células na incubadora por 10 minutos ou mais (dependendo do objetivo do experimento). Para pulsos mais curtos (até 2 minutos), prepare uma placa de Petri com mídia de cultura fresca pré-aquecida complementada com 10 μM EdU, e transfira tampas nele, em vez de adicionar EdU às células diretamente.
   NOTA: Todas as etapas subsequentes são realizadas à temperatura ambiente, se não for indicada de outra forma.
3. Fixar as células rotuladas com glutaraldeído de 2,5%, recém-feito pela diluição de 25% do estoque em tampão de cacodilato de 100 mM, por 1h.
   NOTA: As etapas subsequentes de detecção do EdU são sensíveis ao tempo de fixação. Tempos de fixação mais longos podem afetar negativamente a rotulagem edu, causando menor relação sinal-ruído.
4. Remova o glutaraldeído lavando as amostras com PBS complementado com 5 mM MgCl₂ (PBS* posteriormente). Lave três vezes com uma incubação de 10 minutos para cada lavagem.
5. Membranas plasmáticas permeabilize com 1% Triton X-100 em PBS* (PBS*T depois disso). Lave duas vezes com uma incubação de 5 minutos para cada lavagem.
6. Lave extensivamente a amostra com PBS*. Realize cinco alterações e incubar por 5 minutos em cada alteração.
7. Sacie os grupos de aldeído sem resíduos com 40 mM de glycina no PBS*, duas vezes por 10 minutos cada.
8. Bloqueie as amostras em 1% de BSA em PBS* por 30 minutos.

2. Reação de cliques

NOTA: Este procedimento é modificado a partir de um protocolo¹⁹ publicado anteriormente.

1. Imediatamente antes do uso, prepare a mistura de reação de clique para detecção de EdU: em um tubo de microcentrifutura, misturar 430 μL de 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL de 100 mM CuSO₄, 1,2 μL de biotin-azide (10 mM em DMSO) e 50 μL de 0,5 M ascor acidbic. Para o controle de qualidade da rotulagem replicativa e procedimento de clique ao nível de microscopia fluorescente, o biotin-azide pode ser substituído por AlexaFluor 488-azide.
   NOTA: A ordem de adição de componentes na reação acima é importante.
2. Realize a reação em uma câmara úmida para minimizar as mudanças de evaporação e concentração no coquetel de reação. Prepare a câmara úmida colocando uma folha molhada de papel filtro na parte inferior da placa de Petri e cobrindo-a com um filme de parafina. Coloque as tampas na superfície do filme com as células voltadas para cima e a camada 50-100 μL do coquetel de reação no deslizamento de cobertura. A reação leva 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Pare a reação lavando a amostra em 0,1% Triton X-100 em PBS* (PBS*T), cinco vezes por 5 min cada.
4. Bloqueie em 1% de BSA em PBS*T por 30 min a temperatura ambiente.
5. Prepare a solução streptavidin-Nanogold com PBS*T contendo 1% de BSA. Incubar a amostra com streptavidina, conjugada com partículas nanogold de 1,4 nm (Nanoprobes) em 1% BSA + PBS*T durante a noite a +4 °C na câmara úmida recém-preparada.
6. Pare a reação e lave a amostra em PBS*T, cinco vezes por 10 min cada.
7. Estabilize o complexo de biotina streptavidin por pós-fixação em 1% de glutaraldeído em PBS* por 30 min.
8. Remova o glutaraldeído por lavagem intensa com água deionizada e lave a amostra em PBS*, cinco vezes por 20 min cada.
9. Sacie grupos de aldeído gratuitos com 1 mg/mL nabh₄ em água, duas vezes por 10 min cada. Durante a incubação, são formadas bolhas de H₂ que podem levantar as tampas. Empurre-os cuidadosamente para baixo com a pinça.
10. Lave com água deionizada cinco vezes por 5 min cada.
    NOTA: Para o controle de qualidade na etapa de rotulagem, é aconselhável realizar rotulagem de controle com streptavidina fluorescentemente rotulado (Figura 2). Isso forneceria uma estimativa de intensidade de rotulagem e nível de fundo antes de mudar para passos subsequentes tediosos e propensos a artefatos.

3. Amplificação ag

NOTA: Este procedimento é modificado a partir de Gilerovitch et al., 1995 (ver ^20,21).

1. Resuspend 50 g de pó de acácia em 100 mL de água desionizada. Dissolva por 3 dias, degas e filtre através de quatro camadas de pano de queijo. Armazene as alíquotas congeladas em 5 mL em tubos de 50 mL. Descongele imediatamente antes do uso.
2. Adicione 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) a 5 mL de alíquota descongelada de solução em pó de acácia para fazer 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) em solução em pó de acácia. Misture balançando lentamente o tubo por 30 minutos. Enrole o tubo com papel alumínio para proteger da luz.
3. Simultaneamente com a etapa 3.2., lave as tampas com tampão de lavagem (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM de sacarose), três vezes por 10 min cada.
4. Prepare a nova solução de N-propyl gallate (NPG). Em um tubo de 15 mL, dissolva 10 mg de NPG em 250 μL de 96% de etanol, e ajuste para 5 mL com água deionizada.
5. Coloque 36 mg de lactato prateado em um tubo de 15 mL embrulhado em folha.
6. Depois do passo 3.2. é concluído, adicione 1,5 mL de solução NPG à mistura de pó de acácia e rocha por mais 3 minutos.
   NOTA: Todas as etapas subsequentes são realizadas em uma sala escura. Use luz segura não actínica (amarela ou vermelha).
7. Equilibre a amostra com tampão de lavagem e vá para a sala escura. Simultaneamente, adicione 5 mL de água deionizada ao lactato prateado e dissolva-se por um tremor vigoroso por 1-2 min.
8. Adicione 1,5 mL de solução de lactato prateado à mistura de pó de acácia, a rocha lentamente por 1 min. Evite a formação de bolhas, pois o oxigênio na mistura diminuirá a reação.
9. Escorra a solução do prato com tampas e despeje 3 mL de mistura de lactato-acácia de prata nas células. Balance o prato várias vezes e incubar por 2-5 min. O tempo de incubação depende do lote de pó de acácia e da temperatura. Isso deve ser definido experimentalmente.
   NOTA: Um tempo de incubação mais longo pode resultar em encadernação de prata inespecífica.
10. Para parar a reação, escorra a mistura de reação e lave o prato extensivamente com três a cinco mudanças de água desionizada, seguido por mais três mudanças por 5 minutos cada.
11. Verifique a mancha sob o microscópio de campo brilhante. Uma boa coloração deve ser clara para marrom escuro com um fundo amarelado muito fraco.
    NOTA: Se a coloração não estiver se desenvolvendo, é possível repetir imediatamente com a mistura já feita (a mistura está ativa por cerca de 15 minutos se mantida no escuro). No entanto, a coloração neste caso pode se desenvolver muito rápido.

4. Tonificação de ouro

NOTA: Para proteger as nanopartículas de prata da dissolução pela oxidação de OsO₄ nos procedimentos subsequentes, é utilizada uma impregnação com ouro nesta etapa (Sawada, Esaki, 1994)²².

1. Enxágüe tampas com água desionizada.
2. A fim de proteger as nanopartículas de prata da dissolução pela oxidação de OsO₄ , incubar as amostras em ácido tetracloroaurico de 0,05% por 2 min no escuro.
3. Lave bem com água deionizada por 10 minutos.
   NOTA: Nesta fase, o contraste adicional é adicionado ao DNA contendo material. A cor da amostra deve mudar de marrom para preto.

5. ChromEM

NOTA: Este protocolo foi modificado a partir de Ou et al., 2017¹⁶.

1. Incubar as tampas e saturar as amostras em 10 μM DRAQ5 em PBS por 10 min no escuro.
2. Prepare 0,2% de solução de tetrahidrocloide diaminobenzidina (DAB) em 50 mM Tris ou PBS:
   dissolver o DAB em 90% do volume final mexendo vigorosamente no escuro, depois ajuste o pH para 7,0-7,4 com NaOH. Ajuste o volume para 100% e filtre através de um filtro de 0,22 μM, armazene embrulhado em papel alumínio.
3. Adicione a solução DAB às células (2 mL por placa de Petri de 3 cm) e incubar por 1 min.
4. Mova a tampa para o fundo de vidro da placa de Petri e coloque-a no estágio de um microscópio invertido. Irradie a amostra (vários campos de visão) em um microscópio invertido com fonte de luz metal-halide e conjunto de filtro Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 no plano focal) através do Plano Apo λ 40ц (NA = 0,95) lente por 10 minutos.
   NOTA: Uma indicação de fotoconversão da DAB bem sucedida é a formação completa de fotobleaching DRAQ5 e dab escuro em núcleos irradiados. No entanto, este último nem sempre é aparente sobre o intenso sinal EdU-prata-ouro (especialmente quando pulsos EdU estendidos são utilizados).
5. Lave com água deionizada três vezes por 5 min cada.

6. Desidratação e resina epóxi incorporando

1. Em um tubo de microcentrifuge, prepare a solução de tetraóxido de ódio parcialmente reduzida misturando 2% de solução aquosa de K4Fe(CN)6 com uma quantidade igual de 2% de solução aquosa de OsO₄, para obter 1% de concentração final de ambos os componentes. Incubar tampas em OsO₄ reduzidos por 1h e lavar em água deionizada três vezes por 5 min cada.
   NOTA: Nesta fase, o composto de ósmio reduzido reage com deposições DAB e aumenta o contraste do DNA.
   ATENÇÃO: O ósmio é tóxico, trabalha sob um capô de fumaça e lida com resíduos de acordo com as normas locais de segurança.
2. Desidratar as amostras em uma série de soluções de etanol classificados em percentuais crescentes: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
3. Para infiltração e incorporação use a fórmula de resina com a razão volumosa do componente da seguinte forma: monômero de resina epóxi:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Esta fórmula é miscible com etanol.
   1. Incubar o deslizamento de cobertura no mix etanol-resina (3 partes 100% EtOH:1 parte resina epóxi) por 30 min.
   2. Incubar a tampa no mix etanol-resina (1 parte 100% EtOH:1 parte resina epóxi) por 2 h.
   3. Incubar o deslizamento de cobertura no mix etanol-resina (1 parte 100% EtOH:3 partes epóxi resina) durante a noite.
   4. Substitua a mistura etanol-resina por resina pura recém-preparada. Incubar em mistura de resina pura por 8 h. Abra o prato para deixar os restos de etanol evaporarem.
   5. Transfira as tampas em um novo prato com resina pura e incubar por 2h a 37-42 °C.
   6. Encha um molde de silicone com resina recém preparada. Coloque as tampas com as células voltadas para baixo no molde de silício apropriado preenchido com resina epóxi. Cure a resina por 24h a 37 °C, depois a 60 °C por pelo menos 2 dias.
      ATENÇÃO: Os componentes da mistura de resina epóxi são potenciais cancerígenos. Use luvas e trabalhe sob o capô da fumaça.
4. Remova a laje de resina do molde, limpe a superfície da mancha com o bisturi ou lâmina de barbear. Para remover a mancha de cobertura, solte a mancha de cobertura em nitrogênio líquido e, em seguida, transfira a laje para a água fervente. Repita se necessário.
5. Localize a área irradiada sob um estereómico e corte-a da laje com uma serra de corte ou qualquer outro instrumento adequado. Pré-aqueça a laje a 70 °C em uma placa quente, se necessário.
6. Fixe o recorte em um suporte de amostra ultramicrotome para aparamento final do bloco. Usando a navalha, prepare a amostra em forma de pirâmide. Monte o suporte com pirâmide no ultramicroome e instale a faca.
   1. Corte o bloco para que as células irradiadas com etiqueta EdU estejam incluídas. Prepare uma seção semifina (250 nm de espessura) adequada para tomografia eletrônica.
      NOTA: A espessura da seção pode ser ajustada para atender aos requisitos experimentais.
7. Desprender a seção da borda da faca e colocá-los nas grades de um único slot. Para a tomografia eletrônica, seções de 250 nm são colhidas em grades de um único slot de 1 mm e após a secagem dessas seções podem ser revestidas de carbono de ambos os lados. Não é necessário contraste adicional.
   NOTA: Como as seções já contêm partículas Au-Ag de alto contraste, não há necessidade de adicionar partículas de ouro fiduciário à superfície da seção.
8. Examine as redes em um microscópio eletrônico de transmissão em baixa ampliação (cerca de 600x) para localizar as células com padrões de replicação apropriados.
   NOTA: Este protocolo gera densidade de rotulagem alta o suficiente para fácil detecção de focos de replicação mesmo em baixa ampliação. É aconselhável primeiro criar um mapa da seção para posterior navegação e coleta de projeções angulares para tomografia. Mude para uma ampliação mais alta e pegue imagens de alta resolução.

7. Tomografia eletrônica

1. Insira a grade no microscópio eletrônico de transmissão com um suporte de alta inclinação. Carregue a amostra no microscópio eletrônico e localize a região de interesse.
2. Alinhe o microscópio no modo EFTEM no modo de iluminação quase paralelo. Sintonize o filtro de energia com 20 eV de seleção de energia colocado no pico de perda zero.
3. Pré-irradie a área de aquisição da tomografia a uma taxa de dose de 40 e/Ų/s por pelo menos 1,5-2 min, o que corresponde à dose total de pelo menos 3000 e/Ų.
4. Ajuste a altura eucêntrica com a tarefa automática no SerialEM. Verifique a tarefa de foco automático para garantir que ele esteja funcionando corretamente em ângulo de inclinação zero e -0,8 mkm de valor de desfoco de destino.
5. Incline o suporte da amostra para -60° com a tarefa Walk-Up.
6. Configure a aquisição da tomografia de -60 a +60° com etapa 2.0°. A exposição deve ser definida dependendo do ângulo de inclinação para manter a intensidade média na câmera. Limitar a mudança de imagem no caso de causar uma mudança de energia e, assim, cortar o desalinhamento. Os dados da tomografia devem ser salvos como arquivo .mrc.
7. Importe o arquivo .mrc em software IMOD para reconstrução da tomografia. Remova os valores de pixels outlier devido aos raios-X.
8. Alinhe a série de inclinação. Realize a correlação cruzada inicial, em seguida, marque manualmente 10-12 partículas de ouro como fiduciais. Rastreie o modelo fiduciário e inspecione se cada fiduciário é rastreado corretamente através da série de inclinação. Crie tomogramas de amostra (fatias) e marque manualmente as bordas finas da seção para evitar a possível inclinação da densidade reconstruída dentro do volume. O erro residual médio para alinhamento de multa foi inferior a 1,2 pix.
9. Reconstrua o tomograma com um algoritmo de projeção de costas filtrado e, em seguida, corte a saída para encaixar a região de interesse no volume final.

Resultados

Os focos de replicação nos núcleos de células mamíferas apresentam padrões distintos de distribuição dentro do núcleo, dependendo da progressão da fase S. Esses padrões se correlacionam com a atividade transcricional do loci sendo replicado. Uma vez que o método aqui apresentado utiliza um procedimento de fixação bastante forte, é bastante simples o uso de rotulagem de pulso replicativo para detecção específica de cromatina loci em vários estados transcricionais, mesmo em condições que oferecem melho...

Discussão

O método descrito aqui tem várias vantagens em relação aos protocolos publicados anteriormente. Primeiro, o uso de Click-química para rotular DNA replicado elimina a necessidade de pré-requisito de desnaturação de DNA para detecção de BrdU com anticorpos, preservando assim melhor a ultraestrutura de cromatina.

Em segundo lugar, a utilização da biotina como um ligante secundário que é gerado após a fixação do glutaraldeído e a sacieciação adequada de grupos de aldeído desv...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)	Thermo Fisher	A10044
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)	Fisher Scientific	BP300-100
AlexaFluor 555-azide	Termo Fisher	A20012
biotin-azide	Lumiprobe	C3730
Bovine Serum Albumine	Boval	LY-0080
DDSA	SPI-CHEM	26544-38-7
DMP-30	SPI-CHEM	90-72-2
DRAQ5	Thermo Scientific	62251
Epoxy resin monomer	SPI-CHEM	90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade)	TED PELLA, INC	18426
Gum arabic	ACROS Organics	258850010
Magnesium chloride	Panreac	141396.1209
NaBH4	SIGMA-ALDRICH	213462
NMA	SPI-CHEM	25134-21-8
N-propyl gallate	SIGMA-ALDRICH	P3130
PBS	MP Biomedicals	2810305
Silver lactate	ALDRICH	359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate	Termo Fisher	S11223
Streptavidin-Nanogold conjugate	Nanoprobes	2016
tetrachloroauric acid	SIGMA-ALDRICH	HT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	CHEM-IMPEX INT'L	298
Triton X-100	Fluka Chemica	93420
Instruments
Carbon Coater	Hitachi
Copper single slot grids	Ted Pella	1GC10H
Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75)	Nikon	Cy5 HQ	Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus
Diamond knife Ultra Wet 45o	Diatome	DU	Alternatives: Ted Pella
Fluorescent microscope	Nikon	Ti-E	Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt sample holder	Jeol
Rotator	Biosan	Multi Bio RS-24
Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer	Jeol	JEM-2100	Alternatives: FEI, Hitachi
Tweezers	Ted Pella	523
Ultramicrotome	Leica	UltraCut-E	Alternatives: RMC
Software
Image acquisition	Open Source	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Image processing	Open Source	IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)