JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.

Abstract

نظم التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة العمليات البيولوجية. يمكن لأنظمة التعبير البصري أن توفر تحكما دقيقا في توقيت التعبير الجيني وموقعه وسعته باستخدام الضوء كعامل محفز. في هذا البروتوكول، يتم استخدام نظام التعبير البصري لتحقيق التعبير الجيني الخفيف القابل للانزدحام في أجنة حمار وحشي. يعتمد هذا النظام على عامل نسخ هندسي يسمى TAEL استنادا إلى عامل نسخ نشط للضوء بشكل طبيعي من بكتيريا E. litoralis. عندما تضيء مع الضوء الأزرق، TAEL dimerizes، يربط إلى عنصرها التنظيمي cognate يسمى C120، وينشط النسخ. يستخدم هذا البروتوكول أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا تعبر عن عامل نسخ TAEL تحت سيطرة مروج ubb في كل مكان. وفي الوقت نفسه، فإن العنصر التنظيمي C120 يدفع التعبير عن جين المراسل الفلوري (GFP). باستخدام لوحة LED بسيطة لتقديم الضوء الأزرق المنشط ، يمكن أولا اكتشاف تحريض تعبير GFP بعد 30 دقيقة من الإضاءة ويصل إلى ذروة التعريفي أكثر من 130 ضعفا بعد 3 ساعة من العلاج الخفيف. يمكن تقييم تحريض التعبير عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ومجهر الفلورسينس. هذه الطريقة هي نهج متعدد الاستخدامات وسهل الاستخدام للتعبير الجيني البصري.

Introduction

تساعد أنظمة التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك في التحكم في كمية التعبير الجيني وتوقيته وموقعه. ومع ذلك، كان تحقيق السيطرة المكانية والزمنية الدقيقة في الكائنات متعددة الخلايا أمرا صعبا. ويتحقق التحكم الزمني الأكثر شيوعا عن طريق إضافة مركبات جزيء صغير1 أو تفعيل المروجين صدمة الحرارة2. ومع ذلك، فإن كلا النهجين عرضة لقضايا التوقيت، وقوة الحث، والاستجابات الإجهادية خارج الهدف. ويتحقق التحكم المكاني بشكل رئيسي باستخدام المروجين3الخاصين بالأنسجة ، ولكن هذا النهج يتطلب مروجا مناسبا أو عنصرا تنظيميا ، وهو غير متوفر دائما ، ولا يؤدي إلى تحريض مستوى الأنسجة الفرعية.

وعلى النقيض من هذه النهج التقليدية، فإن المنشطات البصرية البصرية المنشطة للضوء لديها القدرة على التحكم المكاني والزمني الدقيق في التعبير الجيني4. تم تطوير نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء وتحسينه للاستخدام في أجنة حمار وحشي5،6. ويستند هذا النظام على عامل النسخ ضوء تنشيط الذاتية من البكتيريا E. litoralis7,8. يتكون نظام TAEL/C120 من منشط نسخي يسمى TAEL يحتوي على مجال تحويل Kal-TA4 ، ومجال LOV الأزرق المستجيب للضوء (استشعار الجهد الخفيف الأكسجين) ، ومجال ربط الحمض النووي الحلزوني (HTH)5. عندما مضيئة، والمجالات LOV الخضوع لتغيير تشكيلي يسمح اثنين من جزيئات TAEL لتعتيم، وربط إلى المروج C120 تستجيب TAEL، والشروع في نسخ من جين المصب منالفائدة 5،8. يعرض نظام TAEL/C120 تحريضا سريعا وقويا بأقل قدر من السمية ، ويمكن تنشيطه من خلال العديد من طرائق التسليم الخفيف المختلفة. وفي الآونة الأخيرة، أدخلت تحسينات على نظام TAEL/C120 بإضافة إشارة توطين نووية إلى TAEL (TAEL-N) وباقتران العنصر التنظيمي C120 بجهة تسويق أساسية cFos (C120F)(الشكل 1A). هذه التعديلات تحسين مستويات التعريفي بأكثر من 15 أضعاف6.

في هذا البروتوكول، يتم استخدام لوحة LED بسيطة لتنشيط نظام TAEL/C120 والحث على التعبير في كل مكان عن جين المراسل، GFP. يمكن رصد تحريض التعبير نوعيا من خلال مراقبة كثافة الفلورسينس أو كميا عن طريق قياس مستويات النسخ باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). هذا البروتوكول سوف تظهر نظام TAEL/C120 كأداة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام التي تمكن تنظيم قوي للتعبير الجيني في الجسم الحي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا ميرسيد.

1. عبور حمار وحشي وجمع الأجنة

  1. الحفاظ على خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا منفصلة تحتوي إما على المنشط النسخ TAEL أو الجين مراسل C120 التي تسيطر عليها للحد من التنشيط زائفة.
  2. عبر 6-8 حمار وحشي الكبار من كل خط باستخدام أساليب قياسية9 لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة التي تحتوي على كل من TAEL و C120 المكونات (الشكل 1B).
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن كلا المكونين بشكل عابر من خلال الميكروينيكشن الحمض النووي مرنا أو البلازميد باستخدام الأساليب القياسية10.
  3. جمع الأجنة في أطباق بيتري التي تحتوي على ماء البيض (60 ميكروغرام / مل ملح البحر الفوري المحيط المذاب في الماء المقطر)، مع ما يقرب من 30 جنينا لكل حالة ليتم اختبارها.
  4. ضع الأطباق في صندوق مقاوم للضوء أو غطيها بورق الألومنيوم لتقليل التنشيط غير المقصود بواسطة الضوء المحيط (انظر الجدول 1).

2. تحريض الضوء العالمي

  1. استخدم لوحة LED ذات الضوء الأزرق (465 نانومتر) لتوصيل الضوء الأزرق المنشط إلى عدة أجنة في وقت واحد.
  2. ضع لوحة LED نسبة إلى أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة بحيث تكون القوة الفعلية للضوء التي تتلقاها الأجنة حوالي 1.5 كيلوواط /سم2 كما تقاس بالطاقة الخفيفة ومقياس الطاقة(الشكل 2A).
  3. نبض الضوء على فترات من 1 ساعة على / 1 ساعة قبالة باستخدام تتابع مؤقت إذا مضيئة لأكثر من 3 ساعة للحد من خطر photodamage إلى المنشط النسخ TAEL5،8.
    ملاحظة: قد تحتاج المدة الدقيقة للإضاءة إلى تحسينها لتطبيقات معينة. في هذا البروتوكول، يتم توفير أمثلة لمدة الإضاءة من 30 دقيقة، 1 ساعة، 3 ساعة، و 6 ساعة.
  4. إزالة أغطية طبق بيتري لتقليل تشتت الضوء من التكثيف.
  5. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة التحكم في صندوق مقاوم للضوء أو تغطيها بورق الألومنيوم للتحكم في الظلام.

3. التقييم الكمي للتحريض بواسطة qRT-PCR

  1. إزالة الأجنة من الإضاءة بعد مدة التنشيط المطلوبة.
  2. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من 30-50 ضوء تنشيط و 30-50 الأجنة الداكنة باستخدام عدة العزل الجيش الملكي النيبالي بعد تعليمات عدة.
    1. نقل الأجنة إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وإزالة ماء البيض الزائد. إضافة تحلل العازلة وتجانس الأجنة مع الآفات البلاستيكية.
    2. نقل lysate إلى عمود مجموعة المقدمة ومتابعة مع تعليمات المجموعة. انتقل فورا إلى الخطوة 3.3 أو تخزين الحمض النووي الريبي المنقى عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية.
  3. استخدام 1 ميكروغرام مجموع الحمض النووي الريبي لتركيب cDNA باستخدام مجموعة توليف cDNA بعد تعليمات عدة.
    1. خذ أنبوب PCR ذو الجدران الرقيقة 0.2 مل ، وأضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى 4 ميكرولتر من مزيج التفاعل الرئيسي 5x cDNA (يحتوي على المخزن المؤقت الأمثل ، وoligo-dT والمبرمجين العشوائيين ، وdNTPs) ، و1 ميكرولتر من محلول النسخ العكسي 20x ، والمياه الخالية من النيوكلياز إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
    2. ضع الأنبوب في دراجة حرارية مبرمجة على النحو التالي: 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم اضغط على 4 درجات مئوية. انتقل فورا إلى الخطوة 3.4 أو تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية.
  4. إعداد ردود فعل qPCR التي تحتوي على مزيج رئيسي الإنزيم الأخضر SYBR، 5 أضعاف CDNA المخفف (الخطوة 3.3)، و 325 nM من كل التمهيدي لGFP.
    ملاحظة: التمهيديات المستخدمة في هذا البروتوكول كما يلي. GFP إلى الأمام: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'؛ GFP عكس: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGGATGC-3'; ef1a إلى الأمام 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a عكس: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. نفذ ردود فعل qPCR في جهاز PCR في الوقت الحقيقي.
    ملاحظة: برنامج PCR: التنشيط الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يليه 40 دورة من 30 s عند 95 درجة مئوية، و 30 درجة مئوية عند 60 درجة مئوية، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  6. إجراء تحليل منحنى ذوبان مرة واحدة يتم الانتهاء من PCR لتحديد خصوصية رد الفعل. إجراء ثلاث نسخ متماثلة تقنية لكل عينة.
  7. حساب التعريفي الضوء تنشيط كما تغيير أضعاف بالنسبة للأجنة أبقى في الظلام باستخدام 2-ΔΔCt طريقة11. يمكن تحديد الأهمية الإحصائية من خلال حزمة برامج الإحصاءات.

4. التقييم النوعي للتحريض بواسطة المجهر الفلوري

  1. إزالة الأجنة من الإضاءة بعد المدة المطلوبة من التنشيط.
  2. شل حركة الأجنة للتصوير في 3٪ ميثيلسليلوز تحتوي على 0.01٪ tricaine في شرائح الاكتئاب الزجاجي.
  3. احصل على صور مضانة و brightfield على منظار مجسم فلوري متصل بكاميرا رقمية باستخدام إعدادات فلتر GFP القياسية. استخدم إعدادات الحصول على صورة متطابقة لكافة العينات.
  4. دمج الصور مشرق وفلورسينس بعد الاستحواذ مع برامج معالجة الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لهذه المظاهرة ، C120 استجابة GFP خط مراسل (TG (C120F : GFP)ucm107))عبرت مع خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن TAEL - N في كل مكان من ubiquitin ب (ubb) المروج (Tg(ubb:TAEL -N)ucm113))لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحتوي على كلا العنصرين. 24 ساعة بعد الإخصاب، تعرضت الأجنة لتنشيط الضوء الأزرق، نبض...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا البروتوكول استخدام نظام TAEL/C120 البصري لتحقيق التعبير الجيني الأزرق غير القابل للانخزال. يتكون هذا النظام من منشط النسخ ، TAEL ، الذي يتناقص عند الإضاءة مع الضوء الأزرق وينشط نسخ جين الفائدة في المصب لعنصر تنظيمي C120. يمكن الكشف عن التعبير المستحث لمراسل GFP بعد أقل من 30 دقيقة من التعرض ل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر ستيفان ماترنا وأعضاء مختبري وو وماتيرانا على الاقتراحات والتعليقات المفيدة على هذا البروتوكول. نشكر آنا ريد وكيفن غاردنر ولورا موتا مينا على المناقشات القيمة والرؤى أثناء تطوير هذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة؛ R03 DK106358) ولجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا (CRN-20-636896) إلى S.W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender web-based science illustration toolBioRenderhttps://biorender.com/
Color CCD digital cameraLumenara755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCDThorlabsPM100D
Excitation filter, 545 nmOlympusET545/25x
illustra RNAspin Mini kitGE Healthcare95017-491
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programmable digital timer switchAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mixQuantabio101414-286
Photoshop image procesing softwareAdobe
Prism graphing and statistics softwareGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light sourceExcelitas010-00326RDiscontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

References

  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved