Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120

Riepilogo

L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.

Abstract

I sistemi di espressione genica inducibili sono uno strumento inestimabile per lo studio dei processi biologici. I sistemi di espressione optogenetica possono fornire un controllo preciso sui tempi, la posizione e l'ampiezza dell'espressione genica utilizzando la luce come agente induttore. In questo protocollo, un sistema di espressione optogenetica viene utilizzato per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione ingegnerizzato chiamato TAEL basato su un fattore di trascrizione attivato dalla luce naturale dal batterio E. litoralis. Quando illuminato con luce blu, TAEL dimerizza, si lega al suo elemento regolatore affine chiamato C120 e attiva la trascrizione. Questo protocollo utilizza embrioni transgenici di zebrafish che esprimono il fattore di trascrizione TAEL sotto il controllo dell'onnipresente promotore ubb. Allo stesso tempo, l'elemento regolatore C120 guida l'espressione di un gene reporter fluorescente (GFP). Utilizzando un semplice pannello LED per fornire luce blu attivante, l'induzione dell'espressione GFP può essere rilevata per la prima volta dopo 30 minuti di illuminazione e raggiunge un picco di oltre 130 volte l'induzione dopo 3 ore di trattamento della luce. L'induzione dell'espressione può essere valutata mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e microscopia a fluorescenza. Questo metodo è un approccio versatile e facile da usare per l'espressione genica optogenetica.

Introduzione

I sistemi di espressione genica inducibili aiutano a controllare la quantità, i tempi e la posizione dell'espressione genica. Tuttavia, ottenere l'esatto controllo spaziale e temporale negli organismi multicellulari è stato difficile. Il controllo temporale è più comunemente ottenuto aggiungendo composti a piccole molecole¹ o attivazione di promotori di shock termici². Tuttavia, entrambi gli approcci sono vulnerabili a problemi di tempistica, forza di induzione e risposte allo stress fuori bersaglio. Il controllo spaziale si ottiene principalmente con l'uso di promotori tessuto-specifici³, ma questo approccio richiede un promotore o un elemento normativo adeguato, che non sono sempre disponibili e non è favorevole all'induzione a livello sub-tissutale.

In contrasto con tali approcci convenzionali, gli attivatori trascrizionali optogenetici attivati dalla luce hanno il potenziale per un controllo spaziale e temporale più fine dell'espressione^{genica 4}. Il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu è stato sviluppato e ottimizzato per l'uso in embrioni di zebrafish^5,6. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione endogeno attivato dalla luce dal batterio E. litoralis^7,8. Il sistema TAEL/C120 è costituito da un attivatore trascrizionale chiamato TAEL che contiene un dominio di transattivazione Kal-TA4, un dominio LOV (light-oxygen-voltage sensing) sensibile alla luce blu e un dominio di legame al DNA helix-turn-helix (HTH)⁵. Quando illuminati, i domini LOV subiscono un cambiamento conformazionale che consente a due molecole TAEL di dimerizzare, legarsi a un promotore C120 responso al TAEL e avviare la trascrizione di un gene a valle di interesse^5,8. Il sistema TAEL/C120 presenta un'induzione rapida e robusta con una tossicità minima e può essere attivato da diverse modalità di erogazione della luce. Recentemente, sono stati apportati miglioramenti al sistema TAEL/C120 aggiungendo un segnale di localizzazione nucleare a TAEL (TAEL-N) e accoppiando l'elemento regolatore C120 a un promotore basale cFos (C120F) (Figura 1A). Queste modifiche hanno migliorato i livelli di induzione di oltre 15 volte^6.

In questo protocollo, un semplice pannello LED viene utilizzato per attivare il sistema TAEL/C120 e indurre l'espressione ubiquitaria di un gene reporter, GFP. L'induzione dell'espressione può essere monitorata qualitativamente osservando l'intensità della fluorescenza o quantitativamente misurando i livelli di trascrizione utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Questo protocollo dimostrerà il sistema TAEL/C120 come uno strumento versatile e facile da usare che consente una robusta regolazione dell'espressione genica in vivo.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California Merced.

1. Incrocio di zebrafish e raccolta di embrioni

1. Mantenere separate le linee transgeniche di zebrafish contenenti l'attivatore trascrizionale TAEL o il gene reporter controllato da C120 per ridurre al minimo l'attivazione spuria.
2. Incrociare 6-8 pesci zebra adulti da ogni linea utilizzando i metodi standard⁹ per produrre embrioni transgenici doppi che contengono sia i componenti TAEL che C120 (Figura 1B).
   NOTA: In alternativa, entrambi i componenti possono essere espressi transitoriamente attraverso la microiniezione di mRNA o DNA plasmidico utilizzando metodi standard¹⁰.
3. Raccogliere embrioni in piastre di Petri contenenti acqua di uova (60 μg/mL di sale marino istantaneo dell'oceano disciolto in acqua distillata), con circa 30 embrioni per condizione da testare.
4. Posizionare i piatti in una scatola o coprire con un foglio di alluminio per ridurre al minimo l'attivazione involontaria da parte della luce ambientale (vedere Tabella 1).

2. Induzione globale della luce

1. Utilizzare un pannello LED a luce blu (465 nm) per fornire luce blu attivante a più embrioni contemporaneamente.
2. Posizionare il pannello LED rispetto alle piastre di Petri contenenti embrioni in modo che la potenza effettiva della luce ricevuta dagli embrioni sia di circa 1,5 mW/cm² misurata da un misuratore di potenza luminosa ed energia (Figura 2A).
3. Pulsare la luce ad intervalli di 1 h on/1 h off utilizzando un relè timer se illuminato per più di 3 h per ridurre il rischio di fotodanneria all'attivatore trascrizionale TAEL^5,8.
   NOTA: potrebbe essere necessario ottimizzare la durata esatta dell'illuminazione per applicazioni specifiche. In questo protocollo vengono forniti esempi di durata dell'illuminazione di 30 min, 1 h, 3 h e 6 h.
4. Rimuovere i coperchi della capsula di Petri per ridurre al minimo la dispersione della luce dalla condensa.
5. Posizionare le piastre di Petri contenenti embrioni di controllo in una scatola a prova di luce o coprire con un foglio di alluminio per controlli scuri.

3. Valutazione quantitativa dell'induzione mediante qRT-PCR

1. Rimuovere gli embrioni dall'illuminazione dopo la durata di attivazione desiderata.
2. Estrarre l'RNA totale da 30-50 embrioni attivati dalla luce e 30-50 embrioni scuri utilizzando un kit di isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del kit.
   1. Trasferire gli embrioni in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml e rimuovere l'acqua in eccesso di uova. Aggiungere il tampone di lisi e omogeneizzare gli embrioni con un pestello di plastica.
   2. Trasferire il lisi in una colonna fornita dal kit e continuare con le istruzioni del kit. Procedere immediatamente al passaggio 3.3 o conservare l'RNA purificato a -20 °C a -80 °C.
3. Utilizzare 1 μg di RNA totale per la sintesi del cDNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA seguendo le istruzioni del kit.
   1. Prendere un tubo PCR da 0,2 mL a parete sottile, aggiungere 1 μg di RNA a 4 μL di 5x miscela master di reazione cDNA (contenente tampone ottimizzato, oligo-dT e primer casuali e dNTP), 1 μL di soluzione di trascrittasi inversa 20x e acqua priva di nucleasi per un volume totale di 20 μL.
   2. Posizionare il tubo in un termociclatore programmato come segue: 22 °C per 10 min, 42 °C per 30 min, 85 °C per 5 min, quindi tenere a 4 °C. Procedere immediatamente al passaggio 3.4 o conservare il cDNA a -20 °C.
4. Preparare reazioni qPCR contenenti SYBR green enzyme master mix, cDNA diluito 5 volte (fase 3.3) e 325 nM di ciascun primer per GFP.
   NOTA: primer utilizzati in questo protocollo come segue. GFP in avanti: 5'-ACGACGGCAACTACACAAGCACC-3'; GFP inverso: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a avanti 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a inverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
5. Eseguire reazioni qPCR in una macchina PCR in tempo reale.
   NOTA: programma PCR: attivazione iniziale a 95 °C per 10 min, seguita da 40 cicli da 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C.
6. Eseguire un'analisi della curva di fusione una volta completata la PCR per determinare la specificità della reazione. Eseguire tre repliche tecniche per ogni campione.
7. Calcola l'induzione attivata dalla luce come cambiamento di piega rispetto agli embrioni tenuti al buio usando il metodo^{2 -ΔΔCt 11}. La significatività statistica può essere determinata con un pacchetto software di statistica.

4. Valutazione qualitativa dell'induzione mediante microscopia a fluorescenza

1. Rimuovere gli embrioni dall'illuminazione dopo la durata desiderata di attivazione.
2. Immobilizzare gli embrioni per l'imaging in metilcellulosa al 3% contenente lo 0,01% di tricaina in vetrini di depressione vetrosa.
3. Acquisisci immagini a fluorescenza e in campo luminoso su uno stereomicroscopio fluorescente collegato a una fotocamera digitale utilizzando le impostazioni standard del filtro GFP. Utilizzare impostazioni di acquisizione delle immagini identiche per tutti i campioni.
4. Unisci immagini brightfield e fluorescenza dopo l'acquisizione con il software di elaborazione delle immagini.

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Risultati

Per questa dimostrazione, una linea reporter GFP C120-responsive (Tg(C120F:GFP)^ucm107)) è stata incrociata con una linea transgenica che esprime TAEL-N ubiquitamente dal promotore dell'ubiquitina b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) per produrre embrioni transgenici doppi contenenti entrambi gli elementi. 24 ore dopo la fecondazione, gli embrioni sono stati esposti all'attivazione della luce blu, pulsata ad una frequenza di 1 ora on/1 h off. L'induzione dell'espressio...

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Discussione

Questo protocollo descrive l'uso del sistema optogenetico TAEL/C120 per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce blu. Questo sistema è costituito da un attivatore trascrizionale, TAEL, che dimerizza all'illuminazione con luce blu e attiva la trascrizione di un gene di interesse a valle di un elemento regolatore C120. L'espressione indotta di un reporter GFP può essere rilevata dopo appena 30 minuti di esposizione alla luce, suggerendo che questo approccio possiede una cinetica relativamente veloce e reattiva...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender web-based science illustration tool	BioRender		https://biorender.com/
Color CCD digital camera	Lumenara	755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD	Thorlabs	PM100D
Excitation filter, 545 nm	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Healthcare	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix	Quantabio	101414-286
Photoshop image procesing software	Adobe
Prism graphing and statistics software	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	A28137
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source	Excelitas	010-00326R	Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+