Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

Resumo

Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.

Resumo

Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.

Introdução

Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas¹ ou ativação dos promotores de choque térmico². Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido^3,mas essa abordagem requer um promotor adequado ou elemento regulatório, que nem sempre estão disponíveis, e não é propício à indução do nível subsecimento.

Em contraste com tais abordagens convencionais, ativadores transcricionais optogenéticos ativados pela luz têm o potencial de um controle espacial e temporal mais fino da expressão^{genética 4}. O sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul foi desenvolvido e otimizado para uso em embriões de zebrafish^5,6. Este sistema é baseado em um fator de transcrição endógeno ativado pela luz da bactéria E. litoralis^7,8. O sistema TAEL/C120 consiste em um ativador transcricional chamado TAEL que contém um domínio de transativação Kal-TA4, um domínio LOV lov (sensor de tensão de luz-oxigênio) azul e um domínio de ligação de DNA helix-turn-helix (HTH)⁵. Quando iluminados, os domínios LOV sofrem uma alteração conformacional que permite que duas moléculas de TAEL dimerizem, vinculem-se a um promotor C120 responsivo do TAEL e iniciem a transcrição de um gene a jusante de interesse^5,8. O sistema TAEL/C120 apresenta indução rápida e robusta com toxicidade mínima, podendo ser ativado por diversas modalidades diferentes de entrega de luz. Recentemente, foram feitas melhorias no sistema TAEL/C120, adicionando um sinal de localização nuclear ao TAEL (TAEL-N) e acoplando o elemento regulatório C120 a um promotor basal cFos (C120F) (Figura 1A). Essas modificações melhoraram os níveis de indução em mais de 15^{vezes 6}.

Neste protocolo, um simples painel LED é usado para ativar o sistema TAEL/C120 e induzir a expressão onipresente de um gene repórter, GFP. A indução de expressão pode ser monitorada qualitativamente observando a intensidade da fluorescência ou quantitativamente medindo os níveis de transcrição usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo demonstrará o sistema TAEL/C120 como uma ferramenta versátil e fácil de usar que permite uma regulação robusta da expressão genética in vivo.

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Protocolo

Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia Merced.

1. Travessia de zebrafish e coleta de embriões

1. Mantenha linhas separadas de zebrafish transgênicos contendo o ativador transcricional TAEL ou o gene repórter controlado pelo C120 para minimizar a ativação espúria.
2. Cruze 6-8 zebrafish adultos de cada linha usando métodos padrão⁹ para produzir embriões transgênicos duplos que contêm os componentes TAEL e C120(Figura 1B).
   NOTA: Alternativamente, ambos os componentes podem ser expressos transitoriamente através de microinjeção de mRNA ou DNA plasmídeo usando métodos padrão¹⁰.
3. Coletar embriões em placas de Petri contendo água de ovo (60 μg/mL Sal marinho do Oceano Instantâneo dissolvido em água destilada), com aproximadamente 30 embriões por condição a ser testado.
4. Coloque os pratos em uma caixa à prova de luz ou cubra com papel alumínio para minimizar a ativação não intencional por luz ambiente (ver Tabela 1).

2. Indução global de luz

1. Use um painel LED de luz azul (465 nm) para fornecer luz azul ativante a vários embriões ao mesmo tempo.
2. Posicione o painel LED em relação às placas de Petri contendo embriões de modo que o poder real da luz recebido pelos embriões seja de aproximadamente 1,5 mW/cm² medido por um medidor de energia e energia leve(Figura 2A).
3. Pulso a luz em intervalos de 1 h em/1 h desligando usando um relé de temporizador se iluminar por mais de 3h para reduzir o risco de fotodamagem ao ativador transcricional TAEL^5,8.
   NOTA: A duração exata da iluminação pode precisar ser otimizada para aplicações específicas. Neste protocolo, são fornecidos exemplos de duração de iluminação de 30 min, 1h, 3 h e 6h.
4. Remova as tampas da placa de Petri para minimizar a dispersão de luz da condensação.
5. Coloque placas de Petri contendo embriões de controle em uma caixa à prova de luz ou cubra com papel alumínio para controles escuros.

3. Avaliação quantitativa da indução por qRT-PCR

1. Remova os embriões da iluminação após a duração desejada de ativação.
2. Extrair RNA total de 30-50 embriões escuros ativados por luz e 30-50 usando um kit de isolamento de RNA seguindo as instruções do kit.
   1. Transfira embriões para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e remova o excesso de água dos ovos. Adicione tampão de lise e homogeneize os embriões com um pilão plástico.
   2. Transfira o lysate para uma coluna fornecida pelo kit e continue com as instruções do kit. Proceda imediatamente para a etapa 3.3 ou armazene o RNA purificado a -20 °C a -80 °C.
3. Use 1 μg total de RNA para síntese de cDNA usando um kit de síntese cDNA seguindo as instruções do kit.
   1. Pegue um tubo PCR de parede fina de 0,2 mL, adicione 1 μg de RNA a 4 μL de 5x cDNA reaction master mix (contendo buffer otimizado, oligo-dT e primers aleatórios, e dNTPs), 1 μL de solução de transcriptase reversa de 20x e água sem nuclease para um volume total de 20 μL.
   2. Coloque o tubo em um termociclador programado da seguinte forma: 22 °C para 10 min, 42 °C para 30 min, 85 °C por 5 min e, em seguida, mantenha a 4 °C. Proceda imediatamente para a etapa 3.4 ou armazenar cDNA a -20 °C.
4. Prepare as reações qPCR contendo mistura mestre de enzimas verdes SYBR, cDNA diluída de 5 vezes (etapa 3.3) e 325 nM de cada primer para GFP.
   NOTA: Primers usados neste protocolo da seguinte forma. Avanço GFP: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; Reverso GFP: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATCAT-3').
5. Realize reações qPCR em uma máquina PCR em tempo real.
   NOTA: Programa PCR: ativação inicial a 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C.
6. Realize uma análise de curva de derretimento assim que o PCR estiver concluído para determinar a especificidade da reação. Realize três réplicas técnicas para cada amostra.
7. Calcule a indução ativada pela luz como mudança de dobra em relação aos embriões mantidos no escuro usando o método 2^{-ΔΔCt 11}. A significância estatística pode ser determinada com um pacote de software estatístico.

4. Avaliação qualitativa da indução por microscopia de fluorescência

1. Remova os embriões da iluminação após a duração desejada da ativação.
2. Imobilize embriões para imagem em 3% de metilcelulose contendo 0,01% de tricaine em lâminas de depressão de vidro.
3. Adquira imagens de fluorescência e brightfield em um estereóquio fluorescente conectado a uma câmera digital usando as configurações padrão do filtro GFP. Use configurações idênticas de aquisição de imagens para todas as amostras.
4. Mescle imagens de brightfield e fluorescência após a aquisição com software de processamento de imagens.

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Resultados

Para esta demonstração, uma linha de repórteres GFP responsiva C120 -responsiva (Tg(C120F:GFP)^ucm107)foi cruzada com uma linha transgênica que expressa TAEL-N onipresentemente a partir da ubiquitina b (ubb) promotor(Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) para produzir embriões transgênicos duplos contendo ambos os elementos. 24 h pós-fertilização, os embriões foram expostos à ativação da luz azul, pulsado a uma frequência de 1 h on/1 h off. A indução da expressão...

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Discussão

Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender web-based science illustration tool	BioRender		https://biorender.com/
Color CCD digital camera	Lumenara	755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD	Thorlabs	PM100D
Excitation filter, 545 nm	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Healthcare	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix	Quantabio	101414-286
Photoshop image procesing software	Adobe
Prism graphing and statistics software	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	A28137
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source	Excelitas	010-00326R	Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+