JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Оптогенетика является мощным инструментом с широким спектром применения. Этот протокол демонстрирует, как достичь индуцируемой светом экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио с использованием системы TAEL/C120, реагирующей на синий свет.

Аннотация

Индуцируемые системы экспрессии генов являются бесценным инструментом для изучения биологических процессов. Оптогенетические системы экспрессии могут обеспечить точный контроль над временем экспрессии генов, местоположением и амплитудой, используя свет в качестве индуцированного агента. В этом протоколе оптогенетическая система экспрессии используется для достижения светоиндуцируемой экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио. Эта система опирается на инженерный фактор транскрипции под названием TAEL, основанный на естественном светоактивированном факторе транскрипции от бактерии E. litoralis. При освещении синим светом TAEL димеризуется, связывается со своим родственным регуляторным элементом, называемым C120, и активирует транскрипцию. Этот протокол использует трансгенные эмбрионы рыбок данио, которые экспрессируют фактор транскрипции TAEL под контролем вездесущего промотора ubb. В то же время регуляторный элемент C120 управляет экспрессией флуоресцентного репортерного гена (GFP). Используя простую светодиодную панель для подачи активирующего синего света, индукция экспрессии GFP может быть сначала обнаружена после 30 минут освещения и достигает пика более чем 130-кратной индукции после 3 ч световой обработки. Индукция экспрессии может быть оценена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и флуоресцентной микроскопии. Этот метод является универсальным и простым в использовании подходом к экспрессии оптогенетических генов.

Введение

Индуцируемые системы экспрессии генов помогают контролировать количество, время и местоположение экспрессии генов. Однако достижение точного пространственного и временного контроля в многоклеточных организмах было сложной задачей. Временное управление чаще всего достигается путем добавления маломолекулярных соединений1 или активации промоутеров теплового шока2. Тем не менее, оба подхода уязвимы для вопросов времени, силы индукции и нецелевых стрессовых реакций. Пространственный контроль в основном достигается за счет использования тканеспецифических промоторов3,но такой подход требует подходящего промотора или регуляторного элемента, которые не всегда доступны, и это не способствует индукции субтафезневого уровня.

В отличие от таких традиционных подходов, активированные светом оптогенетические транскрипционные активаторы обладают потенциалом для более тонкого пространственного и временного контроля экспрессии генов4. Система TAEL/C120, реагирующая на синий свет, была разработана и оптимизирована для использования в эмбрионах рыбокданио5,6. Эта система основана на эндогенном светоактивированном транскрипционном факторе от бактерии E. litoralis7,8. Система TAEL/C120 состоит из транскрипционного активатора под названием TAEL, который содержит домен трансактивации Kal-TA4, чувствительный к синему свету домен LOV (измерение напряжения света-кислорода) и домен связывающей ДНК спирали-поворота-спирали (HTH)5. При освещении домены LOV претерпевают конформационное изменение, которое позволяет двум молекулам TAEL димеризоваться, связываться с TAEL-чувствительным промотором C120 и инициировать транскрипцию нижестоящего гена, представляющий интерес5,8. Система TAEL/C120 демонстрирует быструю и надежную индукцию с минимальной токсичностью и может быть активирована несколькими различными способами подачи света. Недавно были усовершенствования в системе TAEL/C120 путем добавления сигнала ядерной локализации в TAEL (TAEL-N) и соединения регулирующего элемента C120 с базальным промоутером cFos (C120F)(рисунок 1A). Эти модификации улучшили уровни индукции более чем в 15 разв 6раз.

В этом протоколе простая светодиодная панель используется для активации системы TAEL/C120 и индуцирования повсеместной экспрессии репортерного гена GFP. Индукцию экспрессии можно качественно контролировать, наблюдая интенсивность флуоресценции, или количественно путем измерения уровней транскриптов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол продемонстрирует систему TAEL/C120 как универсальный, простой в использовании инструмент, который обеспечивает надежную регуляцию экспрессии генов in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Это исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Мерседе.

1. Скрещивание рыбок данио и сбор эмбрионов

  1. Поддерживайте отдельные трансгенные линии рыбок данио, содержащие либо транскрипционный активатор TAEL, либо контролируемый C120 репортерный ген, чтобы свести к минимуму ложную активацию.
  2. Скрещивать 6-8 взрослых рыбок данио с каждой линии, используя стандартные методы9, для получения двойных трансгенных эмбрионов, которые содержат как компоненты TAEL, так и C120(рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, оба компонента могут быть экспрессированы временно посредством микроинъекции мРНК или плазмидной ДНК с использованием стандартных методов10.
  3. Соберите эмбрионы в чашки Петри, содержащие яичную воду (60 мкг / мл морской соли Instant Ocean, растворенной в дистиллированной воде), с примерно 30 эмбрионами на каждое условие, которое будет протестировано.
  4. Поместите посуду в светонепроницаемый ящик или накройте алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму непреднамеренную активацию окружающим светом (см. Таблицу 1).

2. Глобальная индукция света

  1. Используйте светодиодную панель синего света (465 нм) для доставки активирующего синего света к нескольким эмбрионам одновременно.
  2. Расположите светодиодную панель относительно чашек Петри, содержащих эмбрионы, таким образом, чтобы фактическая мощность света, получаемого эмбрионами, составляла приблизительно 1,5 мВт/см2, измеренная измерителем мощности и энергии света(рисунок 2А).
  3. Пульсируйте свет с интервалом 1 ч в/1 ч выключения с помощью реле таймера при освещении более 3 ч, чтобы снизить риск фотоповреждения к транскрипционному активатору TAEL5,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точную продолжительность освещения, возможно, потребуется оптимизировать для конкретных применений. В этом протоколе приведены примеры продолжительности освещения 30 мин, 1 ч, 3 ч и 6 ч.
  4. Снимите крышки чашки Петри, чтобы свести к минимуму рассеяние света от конденсации.
  5. Поместите чашки Петри, содержащие контрольные эмбрионы, в светонепроницаемую коробку или накройте алюминиевой фольгой для темных элементов управления.

3. Количественная оценка индукции методом qRT-PCR

  1. Удалите эмбрионы из освещения после желаемой продолжительности активации.
  2. Извлеките общую РНК из 30-50 светоактивированных и 30-50 темных эмбрионов с помощью комплекта изоляции РНК в соответствии с инструкциями набора.
    1. Перенесите эмбрионы в микроцентрифужную трубку 1,5 мл и удалите лишнюю яичную воду. Добавьте буфер лизиса и гомогенизируйте эмбрионы пластиковым пестиком.
    2. Перенесите лисат в графу, предусмотренную комплектом, и продолжите работу с инструкциями по набору. Немедленно перейдите к шагу 3.3 или сохраните очищенную РНК при -20 °C до -80 °C.
  3. Используйте 1 мкг общей РНК для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями набора.
    1. Возьмите тонкостенный ПЦР-трубку 0,2 мл, добавьте 1 мкг РНК к 4 мкл 5-кратной реакционной мастер-смеси кДНК (содержащей оптимизированный буфер, олиго-dT и случайные праймеры и дзНТП), 1 мкл 20-кратного раствора обратной транскриптазы и воду без нуклеазы до общего объема 20 мкл.
    2. Поместите трубку в термоциклер, запрограммированную следующим образом: 22 °C в течение 10 мин, 42 °C в течение 30 мин, 85 °C в течение 5 мин, а затем держите при 4 °C. Немедленно перейдите к шагу 3.4 или сохраните кДНК при -20 °C.
  4. Готовят реакции qPCR, содержащие смесь зеленых ферментов SYBR, 5-кратную разбавленую кДНК (этап 3.3) и 325 нМ каждого праймера для GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Букварь используется в этом протоколе следующим образом. GFP вперед: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP реверс: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a вперед 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a реверс: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. Проводите qPCR-реакции в аппарате ПЦР в режиме реального времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа ПЦР: начальная активация при 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 30 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 1 мин при 72 °C.
  6. Выполните анализ кривой расплава после завершения ПЦР для определения специфичности реакции. Выполните три технические реплики для каждого образца.
  7. Рассчитайте индукцию, активируемую светом, как изменение складки относительно эмбрионов, удержированных в темноте, используя метод2 -ΔΔCt 11. Статистическая значимость может быть определена с помощью пакета статистического программного обеспечения.

4. Качественная оценка индукции флуоресцентной микроскопией

  1. Удалите эмбрионы из иллюминации после желаемой продолжительности активации.
  2. Иммобилизуйте эмбрионы для визуализации в 3% метилцеллюлозе, содержащей 0,01% трикаина в стеклянных депрессивных слайдах.
  3. Получайте флуоресцентные и яркие изображения на флуоресцентном стереомикроскопе, подключенном к цифровой камере, с помощью стандартных настроек фильтра GFP. Используйте одинаковые настройки получения изображений для всех образцов.
  4. Объединяйте изображения яркого поля и флуоресценции после получения с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для этой демонстрации реагирующая на C120 репортерная линия GFP(Tg(C120F:GFP)ucm107)была скрещена трансгенной линией, которая повсеместно экспрессирует TAEL-N из промотора ubiquitin b (ubb)(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113))для получения двойных трансгенных эмбрионов, содержащих оба элемента. Чер?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает использование оптогенетической системы TAEL/C120 для достижения экспрессии генов, индуцируемой синим светом. Эта система состоит из транскрипционного активатора TAEL, который димеризуется при освещении синим светом и активирует транскрипцию интересующего гена пос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Никаких конфликтов интересов объявлено не было.

Благодарности

Мы благодарим Стефана Матерну и членов лабораторий Woo и Materna за полезные предложения и комментарии по этому протоколу. Мы благодарим Анну Рид, Кевина Гарднера и Лору Мотта-Мена за ценную дискуссию и понимание при разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH; R03 DK106358) и Координационный комитет по исследованию рака Калифорнийского университета (CRN-20-636896) в S.W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender web-based science illustration toolBioRenderhttps://biorender.com/
Color CCD digital cameraLumenara755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCDThorlabsPM100D
Excitation filter, 545 nmOlympusET545/25x
illustra RNAspin Mini kitGE Healthcare95017-491
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programmable digital timer switchAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mixQuantabio101414-286
Photoshop image procesing softwareAdobe
Prism graphing and statistics softwareGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light sourceExcelitas010-00326RDiscontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

Ссылки

  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены