JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وهناك نقص في النماذج الشاملة في المختبر التي تلخص بأمانة المرض البشري ذي الصلة. تقدم الدراسة الحالية إنشاء الورم ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) والثقافة ، وهي أداة موثوقة في المختبر لدراسة التفاعل الورمي الحلقي في سرطان الكبد البشري.

Abstract

العدوانية وعدم وجود علاجات جيدة التحمل وفعالة على نطاق واسع لسرطان الكبد المتقدم (HCC)، الشكل السائد لسرطان الكبد، ترشيد رتبته كثاني أكثر الأسباب شيوعا للوفاة المرتبطة بالسرطان. تحتاج النماذج قبل السريرية إلى التكيف لتلخيص الظروف البشرية لاختيار أفضل المرشحين العلاجيين للتنمية السريرية والمساعدة في تقديم الطب الشخصي. تظهر نماذج كروية خلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وعدا كبديل في المختبر الناشئ للثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد). هنا، ونحن نصف نموذج كروية الورم 3D الذي يستغل قدرة الخلايا الفردية لتجميع عند الحفاظ عليها في قطرات معلقة، وأكثر تمثيلا لبيئة في الجسم الحي من monolayers القياسية. وعلاوة على ذلك، يمكن إنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد من خلال الجمع بين الخلايا المثلية أو غير المتغايرة، التي تعكس أكثر التغاير الخلوي في الجسم الحي، مما قد يمكن من دراسة التفاعلات البيئية التي يمكن أن تؤثر على التقدم واستجابات العلاج. البحث الحالي الأمثل كثافة الخلية لتشكيل 3D متجانسة والفيرويدات الورم غير الاستوائية عن طريق شل تعليق الخلايا على أغطية القياسية 10 سم3 أطباق بيتري. تم إجراء تحليل طولي لتوليد منحنيات النمو للورم المثلي مقابل الخلايا الليفية/ الخلايا الليفية. وأخيرا، تم التحقيق في التأثير التكاثري للخلايا الليفية (خلايا COS7) والخلايا العضلية الليفية الكبدية (LX2) على كرويات الورم المثلي (Hep3B). وقد أسفرت كثافة البذر التي تبلغ 000 3 خلية (في 20 وسائط ميكرولتر) بنجاح عن كرويات غير منشطة من نوع Huh7/COS7، أظهرت زيادة مطردة في الحجم حتى يوم الثقافة 8، أعقبها تأخر النمو. تم تأكيد هذه النتيجة باستخدام كرويدات متجانسة Hep3B المستزرعة في LX2 (خط الخلية النجمية الكبدية البشرية) المتوسطة (CM). LX2 CM تسبب في انتشار كرويدات Hep3B مقارنة مع كرويات الورم السيطرة. في الختام، أظهر هذا البروتوكول أنه يمكن استخدام كرويات الورم ثلاثية الأبعاد كأداة بسيطة واقتصادية ومرحلة ما قبل الشاشة في المختبر لدراسة التفاعلات الورمية السترومية بشكل أكثر شمولا.

Introduction

استمر معدل الإصابة والوفيات الناجمة عن سرطان الكبد في الازدياد على الصعيد العالمي، على الرغم من التقدم المحرز في علاج أمراض الكبد ومعظم أنواع السرطان الأخرى. في عام 2018، تجاوز سرطان الكبد سرطان القولون والمستقيم والمعدة ليصبح ثاني أكثر الأسباب شيوعا للوفاة المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم1. في عام 2020، كان هناك أكثر من 9,00,000 تشخيص جديد، وهو ما يمثل 4.7٪ من إجمالي حالات السرطان في جميع أنحاء العالم1. وهذا أمر مخيب للآمال بشكل خاص، بالنظر إلى أن عوامل الخطر الهامة لتطوير HCC، الشكل الأكثر شيوعا لسرطان الكبد، تتميز بشكل جيد2. تليف الكبد هو عامل الخطر الأكثر شيوعا لتطوير HCC، مع 80٪ من الحالات النامية على خلفية تليف الكبد المنشأ2. وتشمل أمراض الكبد المزمنة، التي تتقدم إلى تليف الكبد، وبالتالي HCC، فيروس التهاب الكبد B (HBV)، وفيروس التهاب الكبد C (HCV)، وأمراض الكبد المرتبطة بالكحول (ARLD)، وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية (NAFLD) - وهذا الأخير يعزى إلى السمنة وداء السكري من النوع 2 (T2DM)2،3. تعتمد بروتوكولات الإدارة الحالية ل HCC على المرحلة ومحدودة بالنسبة لأولئك الذين يعانون من سرطان متقدم ، والذين غالبا ما تكون نتائجهم ضعيفة4. كانت هناك تطورات كبيرة باستخدام مثبطات كيناز، ومؤخرا، علاجات الأورام المناعية، على الرغم من واقعيا، تستفيد سوى أقلية من المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد المتقدمة5. وعلاوة على ذلك، هناك قلق من أن مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية الناشئة في المرضى الذين يعانون من NAFLD - السبب الكامن الأسرع نموا، الذي يمثل أكثر من 50٪ من حالات HCC التي تم تشخيصها حديثا في الدول الغربية، قد تكون أكثر مقاومة للعلاج المثبط للوفيات المبرمجة 1 (PD1) نقطة تفتيش6.

كان هناك استثمار كبير في التجارب السريرية للمرضى الذين يعانون من HCC ، بما في ذلك تحسينات كبيرة في التجارب السريرية ونقاط النهاية الخاصة بهم7. بعد عقد من الفشل، بدأت هذه الاستثمارات في تغيير الفرص المتاحة للمرضى. ومع ذلك، فإن الواقع هو أن النسبة الإجمالية للمستجيبين لا تزال ضعيفة نسبيا، حيث غالبا ما يمثل المرضى الذين يتم تجنيدهم في التجارب بشكل ضعيف أولئك الذين يتلقون الرعاية في العيادات. و الخطر هو أن التقدم مكلف ويفيد القلة وليس الكثيرين. مع ظهور المزيد من العلاجات المرشحة للاستخدام الفردي أو الجمع ، من الضروري أن يكون هناك نماذج قبل السريرية أكثر تنبؤا باستجابات الجسم الحي. ومن المرجح أن تكون هذه النماذج التي تتضمن عوامل إضافية تسهم في التباين ينظر في استجابات المرضى التي تعكس بشكل أفضل عدم التجانس HCC الإنسان والتعقيد المرضي8. هناك حاجة إلى النظم التي تعيد خلق الظروف المرضية المرضية في الجسم الحي من HCC للمساعدة في فهم بيولوجيا تطور الورم والنمو والتقدم. النماذج التجريبية الحالية لأمراض الكبد المزمنة وHCC تندرج عادة تحت ثلاث فئات رئيسية: في النماذج الحيوانية الحية (استعرضت in9)، في الثقافات المختبرية10، ونماذج vivo11،12 ex. وتستخدم النهج القائمة على الحيوانات على نطاق واسع لدراسة أمراض الكبد المزمنة، بما في ذلك HCC؛ ومع ذلك، فإن التباين الجيني، وارتفاع تكاليف التشغيل، ومختلف أجهزة المناعة بين الأنواع هي من بين القيود الرئيسية لتطبيق مثل هذه النماذج9. في حين أن بعض نماذج الجسم الحي السابق توفر أداة ممتازة للتركيز على الأنسجة البشرية مقارنة مع غيرها من نماذج خط الخلية المختبرية، وتوافر الأنسجة ومسار زمني تجريبي محدود عرقلة استخدامها على نطاق واسع.

من ناحية أخرى ، لا تزال نماذج خط الخلية في المختبر خيارا جيدا للعلماء الذين يعملون بموارد محدودة ، مع حاجة أقل إلى إمدادات مستمرة من الأنسجة البشرية الطازجة10. توفر هذه النماذج أيضا أداة يمكن استخدامها كشاشة أولى للمساعدة في التحقق المستهدف من اختيار الدواء قبل الانتقال إلى نماذج أكثر تعقيدا في الجسم الحي. التعديل الأخير للثقافات أحادية الطبقة 2D التقليدية في الثقافات 3D قد حسن فعالية هذه النماذج في المختبر13,14.

يمكن للنماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر تلخيص الميزات الحرجة التي شوهدت في الحالات الطبيعية والمرضية للإنسان. في ظل الظروف الفسيولوجية ، يتم بدء تحويل الإشارات من خلال الكلام الخلوي والتفاعل مع جزيئات النسيج الضام الأخرى ، وهي بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وتشكيل شبكة تفاعل ثلاثية الأبعاد15،16. يتطور الورم في شكل كروي ثلاثي الأبعاد أثناء التحول الخبيث ، والذي يكون الأكسجين والمواد المغذية وفيرة بسهولة في مرحلة ما بين الأورام / الأورام. وفي الوقت نفسه، تسود حالات نقص الأكاكس في قلب الورم. هذا التغايرية في توافر المواد الغذائية يؤدي إلى تنشيط الإشارات المتميزة مكانيا والمسارات الأيضية التي تنظم الورم. يتم تلخيص هذه الظروف بشكل سيئ في الثقافات أحادية الطبقة التقليدية 2D14 ، حيث تنمو الخلايا على البلاستيك الثقافي القاسي بطريقة غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. الخلايا السرطانية أيضا التواصل مع الخلايا الأخرى غير parenchymal, المصدر الرئيسي ل ECM, نمو, والغزو الإشارات داخل البيئة الدقيقة الورم. على عكس الثقافات ثنائية الأبعاد، يمكن أن توفر النماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر منصة أكثر ملاءمة لدراسة هذا التفاعل بين الورم والستروم17.

وتستخدم النماذج ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع في مجال HCC، وتختلف في الطريقة التي تتشكل بها الأنسجة الدقيقة18,19,20,21,22,23. معظم هذه النماذج تستخدم إما لوحات الربط منخفضة جدا18,19,20,21,22 أو عبر الآبار23 في عملية تشكيل كروي. البروتوكول الموصوف يقدم تقنية القطيرات المعلقة كنموذج بديل خال من البلاستيك وفعال من حيث التكلفة في المختبر ثلاثي الأبعاد للورم. وهذا قد يسهل تقييم أدوار الغدد الليفية في الغدد الليفية والغدد الصماء على انتشار الخلايا السرطانية في شكل ثلاثي الأبعاد.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. إجراء جميع التجارب في ظل ظروف معقمة في الدرجة الثانية خزانة السلامة الميكروبيولوجية تدفق صفح (انظر جدول المواد).
    1. قم بتشغيل غطاء محرك السيارة والسماح لتثبيت تدفق الهواء.
    2. رش تماما سطح غطاء محرك السيارة الداخلية مع الإيثانول 70٪ للقضاء على أي تلوث محتمل من المستخدمين السابقين.
    3. إعداد 5٪ من محلول مطهر في كوب زجاجي 500 مل. تجاهل أي خلية فائقة أو حطام الخلية داخل الحل.
    4. تنظيف جميع micropipettes تماما وصناديق تلميح مع الإيثانول 70٪.
  2. إعداد وسائل الإعلام ثقافة الخلايا الطازجة عن طريق استكمال دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) وسائل الإعلام عالية الجلوكوز مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنين (FBS)، 1٪ البنسلين / العقدية (100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستريبتومايسين)، و 2M L-الجلوتامين. بالنسبة لخط الخلية النجمية الكبدية LX2، قلل من تركيز ملحق FBS إلى 2٪.
  3. وسائل الإعلام الثقافة الدافئة قبل بدء التجربة.
  4. خذ خطوط خلايا الورم Huh7 و Hep3B HCC وخطوط خلايا الخلايا الليفية COS7 و LX2 من رف التخزين الخاص بهم في النيتروجين السائل. الخلايا المبردة التي تذويب الجليد بسرعة.
  5. تمييع الخلايا المذابة مع 2 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة دافئة جديدة.
  6. خلايا البذور في قارورة ثقافة الخلية T75. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية في ظروف رطبة 95٪ حتى تصل الخلايا إلى التقاء 60٪-70٪.

2. جمع الخلية

  1. أسبيرات وسائل الإعلام الثقافة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
  2. إضافة 2 مل من تريبسين 1x قبل الحارة لفصل الخلايا الملتصقة من الجزء السفلي من قوارير T75. حضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 4 دقائق.
  3. تعطيل التريبسين بإضافة 4 مل من الوسائط الثقافية الكاملة. جمع تعليق الخلية وخلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في وسائط الثقافة الطازجة 4 مل.

3. عد الخلايا

  1. دوامة بلطف تعليق الخلية لضمان توزيع متجانسة من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي.
  2. باستخدام ماصة 10 ميكرولتر، اخلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من أزرق تريبان. ماصة بلطف الخليط صعودا وهبوطا أربع مرات لضمان تلطيخ كامل لسطح الخلية الخارجية مع الصبغة.
  3. عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    1. أولا، ضع غطاء فوق منطقة عد مقياس الدم قبل تحميل تعليق الخلية الملطخة.
    2. ضع طرف ماصة تحتوي على تعليق الخلية في الأخدود الخامس من مقياس الدم. طرد بلطف محتوى تلميح في الشريحة العد.
    3. اترك الطين لتسوية لبضع دقائق قبل إصلاحه على مرحلة المجهر لعد الخلايا.
      ملاحظة: لتجنب العد المزدوج، عد الخلايا على جانبي المربع الكبير فقط.
    4. عد في الخلايا المتداخلة في أعلى أو حق الحكم وتجنب تلك المتداخلة في أسفل أو اليسار الحاكم.
  4. حساب العدد الإجمالي للخلايا.
    ملاحظة: رقم الخلية لكل مل = figure-protocol-2984

4. جمع وسائل الإعلام مكيفة الخلايا الليفية (CM)

  1. يستنشق وسائل الإعلام الثقافة وغسل خلايا LX2 ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 2 مل من تريبسين 1x قبل الحارة لفصل الخلايا الملتصقة من الجزء السفلي من قوارير T75. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 4 دقائق.
  3. تعطيل التريبسين بإضافة 4 مل من الوسائط الثقافية الكاملة. جمع تعليق الخلية وخلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عد الخلايا حسب الخطوة 3.
  4. البذور 1 × 106 خلايا LX2 في 10 سم3 أطباق لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
  5. جمع CM الخلايا الليفية بعد 48 ساعة. جهاز الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة بيليه أي الخلايا العائمة. مرشح معقم CM باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر ثابتة على الجزء السفلي من المحاقن 20 مل.
  6. جمع الناسخة CM. Aliquot CM في أنابيب 2 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمزيد من التطبيقات.
    ملاحظة: يمكن تخزين الحل لمدة 6 أشهر عند -80 درجة مئوية.

5. التحقق من كثافة الخلايا للكفرويدات الكمال

  1. أسبيرات وسائل الإعلام الثقافة وغسل خطوط الخلية HCC ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 2 مل من تريبسين 1x قبل الحارة لفصل الخلايا الملتصقة من الجزء السفلي من قوارير T75. حضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 4 دقائق.
  3. تعطيل التريبسين بإضافة 4 مل من الوسائط الثقافية الكاملة. جمع تعليق الخلية وخلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. عد الخلايا حسب الخطوة 3.
  5. ماصة كثافات مختلفة من خطوط الخلايا السرطانية (12000، 6000، 3000، 1500، 1000، 750، 500، 250، و 125 خلية) في 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام على السطح الداخلي لغطاء 10 سم3 من طبق بيتري.
  6. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى الجزء السفلي من الطبق لتوفير ظروف رطبة لعملية تشكيل كروية.
  7. عكس غطاء طبق 10 سم3 للسماح للوسائط، بما في ذلك تعليق الخلية، بالتعلق ببيئة رطبة. اتركي القطرات المعلقة لمدة 3 أيام.
  8. التقاط صور للشفرات في التكبير 50x باستخدام المجهر مقلوب 3 أيام بعد تعليق قطرات الأصلي.

6. ورم الهيروتيبيك / كرويدات سترومال

  1. تعليق 1500 خلايا HCC هاه7 مع 1500 خلايا الثدييات الخلايا الليفية COS7 (نسبة 1:1) في قطرات معلقة لتشكيل المجالات. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة إلى الجزء السفلي من الطبق لتوفير ظروف رطبة للسفيرات.
  2. عكس غطاء طبق 10 سم3 للسماح للوسائط، بما في ذلك تعليق الخلية، بالتعلق ببيئة رطبة. اتركي القطرات المعلقة لمدة 3 أيام.
  3. التقاط صور للشفرات باستخدام المجهر المقلوب من اليوم 3 حتى اليوم 10 من الثقافة.
    1. وضع طبق 10 سم3 على خشبة المسرح المجهر. ضبط تكبير المجهر في 50x لجميع كرويدات.
    2. افتح برنامج المجهر على الكمبيوتر المرفق واضبط تركيزه للحصول على صورة واضحة لكل كروي. استخدم أداة الالتقاط على برنامج المجهر لحفظ الصور المكتسبة.

7. هوموتيبيك Hep3B كرويدات في LX2 CM

  1. تعليق 3000 خلايا HCC Hep3B في قطرات معلقة لتشكيل المجالات. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة إلى الجزء السفلي من الطبق لتوفير ظروف رطبة للسفيرات.
  2. عكس غطاء طبق 10 سم3 للسماح للوسائط، بما في ذلك تعليق الخلية، بالتعلق ببيئة رطبة. اتركي القطرات المعلقة لمدة 3 أيام.
  3. نقل كرويدات Hep3B إلى 20 ميكرولتر من CM الطازجة من خلايا LX2 في قطرات معلقة.
    ملاحظة: استخدم العقيمة autoclaved غير المصفاة 200 ميكرولتر ماصة نصائح في عملية نقل كروية لتجنب أي اضطراب أو إصابة في كرويات شكلت. هذا هو أيضا للقضاء على أي الخلايا المتبقية التي لا تزال غير مرتبطة كروية واحدة رئيسية.
    1. استخدام ماصة 20 ميكرولتر autoclaved لعملية النقل. ضبط حجم ماصة إلى 2 ميكرولتر. إرفاق طرف ماصة إلى ماصة.
    2. عكس غطاء طبق 10 سم3 التي تشكلت عليها كرويدات. إصلاح الغطاء على خشبة المسرح من المجهر الخفيف. ضبط التركيز الدقيق للمجهر لجعل كل كروية مرئية.
    3. إفراغ الهواء بعناية من micropipette عن طريق الضغط على زر المكبس. أدخل طرف ماصة في القطيرات، بما في ذلك كروية، ليتم نقلها. الحصول على مقربة جدا من كروية دون لمسها مع طرف.
    4. حرر بلطف الضغط على زر المكبس للسماح لشفط كرويد في تلميح micropipette في وسائط 2 ميكرولتر.
    5. نقل كروية إلى قطرة جديدة معلقة على طبق جديد 10 سم3 ، وجود وسائل الإعلام الجديدة / وسائل الإعلام مشروطة / العلاج.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع كرويدات يتم نقلها بنجاح إلى طبق 10 سم3 جديدة باستخدام المجهر الخفيف.
  4. التقاط صور للشفرات في 50x التكبير باستخدام المجهر مقلوب من يوم النقل (اليوم 3) حتى اليوم 7 من الثقافة في LX2 CM.

8. حساب حجم كروي

  1. تعيين معرف رقمي فريد لكل كروية بحيث يمكن التقاط الصور من كرويات متطابقة يوميا.
  2. تحليل الصور من كرويدات المتنامية باستخدام حزمة برامج تحليل الصور.
    1. افتح كل صورة كروية داخل حزمة البرامج. باستخدام أداة التحديد اليدوية وتحديد كل كروية. من الزر المنسدل تحليل ، حدد تعيين القياس، ثم المنطقة. اضغط موافق.
    2. رسم دائرة يدويا حول كل كروية. بمجرد أن تدور الدائرة، اضغط على Ctrl + M للسماح للبرنامج بحساب منطقة كروية في بكسل. تحويل منطقة كروية إلى وحدة تخزين.
      ملاحظة: حجم spheroidmm3 = 0.09403 × figure-protocol-8191
    3. حساب التغيير في حجم كروية بالنسبة لحجمها في اليوم الأول من التقاط الصورة.
      ملاحظة: هذا هو تطبيع وحدة التخزين الكروية إلى وحدة التخزين البداية وتحسين الدقة نظرا للتباين الطبيعي في حجم البداية.

النتائج

تعكس الخلايا المستزرعة في شكل ثلاثي الأبعاد متعدد الطبقات بشكل أكثر دقة تعقيد البيئة الدقيقة للورم من الثقافات التقليدية 2D24,25. في السابق، وقد استكملت العديد من الدراسات وسائل الإعلام ثقافة كرويدات مع mitogens مختلفة وعوامل النمو26 لبدء تشكيل كروية. في هذه الدراسة، ومع ذلك، فإن إضافة الخلايا الليفية، أو CM بهم، ويوفر الميتوجين الأساسية وعوامل النمو لتسريع نمو كروية.

يصور الشكل 1 بيانات من دراسة تجريبية تم فيها زرع خلايا HCC البشرية Huh7 في كثافة بذر تنازلية تبدأ من 12000 إلى 125 خلية في وسائط جديدة 20 ميكرولتر لمدة 3 أيام. أسفرت كثافة البذر التي تبلغ 12,000 خلية عن كرويدات ذات شكل غير متماثل، والتي لم يتم تصحيحها حتى بعد خفض كثافة بذر الخلايا إلى النصف. ومع ذلك، ظهرت كرويدات تم إنشاؤها من 3000 خلية أكثر استدارة (الشكل 1، الصف العلوي). ولم ينجح المزيد من التخفيض في تركيز الخلايا في تشكيل مجالات واحدة (125 و250 و500 كرة كثافة خلايا) كما لم يكن له مظهر كروي منتظم (1000 و1500 كروية كثافة الخلايا). وتجدر الإشارة إلى أن العديد من المجالات الصغيرة تشكلت بكثافة 500 خلية ورم. ومع ذلك، تم التقاط كروية صغيرة واحدة فقط عند تكبير 50x (الشكل 1، الصف العلوي). تم تطبيق نفس البروتوكول الأمثل على خط خلايا الخلايا الليفية الكلية الرئيسية COS7 (الشكل 1، الصف الأوسط). أدى تعليق 125 و250 و500 من الخلايا الليفية COS7 في قطرات معلقة 20 ميكرولتر إلى كروية مستديرة واحدة مع كرويدات أصغر متعددة ، في حين شكلت كثافات الخلايا الأعلى (1000 و 1500 و 3000) كرويات نصف مستديرة واحدة. على غرار كرويات الورم Huh7 ، أدى تعليق الخلايا الأعلى (6000 و 12000 خلية / كرة) إلى تكوين مجاميع الخلايا غير المنتظمة ، وبالتالي تم التخلص من تركيزات الخلايا الأعلى (الشكل 1 ، الصف الأوسط). ولدت الكثافات المنخفضة من تعليق الخلايا الغيرية هوه7/COS7 (125 و 250 و 500 خلية/كرة) كروية واحدة مع كرويات عائمة أو شبه مرفقة متعددة (الشكل 1، الصف السفلي). كانت كرويات الخلايا الغيرية ذات الخلايا 1000 و1500 شبه مستديرة، في حين أعطت كثافة البذر من 3000 خلية (1500 لكل نوع خلية) كروية ثلاثية الأبعاد مستديرة. وكما لوحظ سابقا، أدت كثافة الخلايا الأعلى إلى تكوين مجاميع بدلا من كرويات محددة جيدا (الشكل 1، الصف السفلي). في الختام، تم تقريب 3000 كروية كثافة الخلايا، على غرار أورام HCC الإنسان، وتم تكييفها لمزيد من التجارب. كان زراعة تعليق الخلية كقطرات معلقة لمدة 3 أيام كافيا لتعزيز تكوين الكروية.

بعد تحسين أفضل تركيز الخلية ونقطة زمنية لتشكيل كروية في السياق الحالي، تم تقييم التأثير التكاثري للورم المشترك وخطوط الخلايا الليفية طوليا. ويبين الشكلان 2 والشكل 3 أن كرويات الخلايا غير المدارية من هوه7/COS7 (3000 عدد الخلايا الإجمالي لكل كروي) رصدها من اليوم الثالث حتى اليوم العاشر. هوموتيبيك Huh7 و COS7 كرويدات (1500 خلية لكل منهما) بمثابة عناصر التحكم. بدءا من اليوم 4، نمت كرويدات التروتيبيك في شكل مثالي يشبه الجولة مقارنة بشفرات المثلية (الشكل 2). كان الحجم الأولي للكفرين غير الاستوائي أكبر من كل كروية متجانسة. تم حساب نمو كرويدات كما التغير في حجمها بالنسبة لحجم الأولية في يوم تشكيل كروية لتجنب الاختلاف الطبيعي في حجم كروية (اليوم 3، الشكل 3). أظهرت كرويات التروتوبيك في البداية مرحلة نمو سريعة تبدأ من اليوم الرابع حتى اليوم السابع تليها مرحلة أبطأ من النمو في اليوم الثامن (الشكلان 2 والصف العلوي والشكل 3). انخفض حجم كروية في اليومين 9 و 10، وربما يعكس استنفاد المواد الغذائية أو نواة نقص الأكز وموت الخلايا.

وعلى النقيض من ذلك، نمت كرويات هوه 7 وCOS7 بمعدل أبطأ بكثير (الشكل 2، الصفوف الوسطى والسفلية؛ الشكل 2، الصفوف الوسطى والسفلية؛ الشكل 2، الصفوف المتوسطة والسفلية؛ الشكل 2، الصفوف المتوسطة والسفلية؛ الشكل 2، الصفوف المتوسطة والسفلية؛ الشكل 2، الصفوف المتوسطة والسفلية؛ الشكل 2، الصفوف الوسطى والس الشكل 3- الأرقام 3- الأرقام 3- أظهرت كرويات المثلية منحنى نمو ثابت نسبيا حتى اليوم الخامس من الثقافة (بعد يومين من تكوين كروية). وابتداء من اليوم السادس، بدأت الشفرات المتجانسة تظهر زيادة تدريجية في منحنى نموها، وإن كان بمعدل أقل بكثير من معدل الكرويات غير المدارية (الشكل 3). في الختام، تنمو كرويات الورم/الخلايا الليفية غير المدارية بمعدل أعلى من كرويات المثلية مما يشير إلى أن الاتصال المباشر للخلايا السرطانية والخلايا الليفية يزيد من حجم كرويدات الورم.

وأخيرا، للتحقق من صحة النتائج المذكورة أعلاه ولدراسة تأثير الخلايا الميسنشيمالية على انتشار كرويدات HCC في سياق مرتبط بالكبد، نمت كرويدات سداسية الخلايا سداسية الهبوك المثلية الشكل 3B عمرها 3 أيام في وسائط جديدة منتظمة أو CM من الخلايا النجمية الكبدية LX2 (الشكل 4 والشكل 5) لمدة 4 أيام إضافية. للوهلة الأولى، شكلت خلايا 3000 Hep3B كرويات مستديرة تماما بعد 3 أيام (الشكل 4). وأظهرت كرويدات Hep3B الانتشار المستمر في وسائل الإعلام الجديدة من اليوم 3 حتى اليوم 7 (الشكل 4، الصف العلوي). وقد تعزز معدل النمو عندما تم الحفاظ على كرويدات Hep3B في LX2 CM (الشكل 4، الصف السفلي). أظهر هذا التحويل المعتمد على الوسائط في نمو كروية Hep3B أهمية إحصائية من اليوم الرابع حتى نهاية التجربة (الشكل 5) ، مما يشير إلى انتشار كرويات الورم المدفوعة بالخلايا الليفية.

في الختام، نجحت هذه الدراسة في تعديل الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد الحالية لاستغلال الحديث المتبادل بين خلايا ورم HCC وخطوط الخلايا الليفية المختلفة والتحقيق في الأهمية التكاثرية لهذا التفاعل الخلوي المباشر وغير المباشر (الشكل 6). هناك حاجة إلى مزيد من توصيف كرويات شكلت لتحسين كيفية تفاعل الخلايا السرطانية مع البيئة الدقيقة المحيطة بها.

figure-results-5928
الشكل 1: تحسين كثافة الخلية المثلى لتشكيل كروية. تمثل الأعمدة كثافات مختلفة لبذور الخلايا، وتمثل الصفوف كرويات مكونة من خلايا Huh7 (الصف العلوي) وخلايا COS7 (الصف الأوسط) وخلايا He7/COS7 غير المدارية (الصف السفلي). تمثل الصور كرويدات تم تشكيلها بعد تعليق 125 و250 و500 و1000 و1500 و3000 و6000 و12000 خلية (من اليسار إلى اليمين) في وسائط 20 ميكرولتر لمدة 3 أيام. وشملت الدراسة التجريبية اثنين من كرويدات لكل شرط، واتخذت الصور في التكبير 50x، شريط مقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6729
الشكل 2: نمو كروي غير متجانس مقابل الهتيروتيبيك. تمثل الأعمدة اليوم الذي تم فيه التقاط صور كروية، وتظهر الصفوف صورا تمثيلية للشفرات التي تم تشكيلها من خلايا Huh7 (الصف العلوي) وخلايا COS7 (الصف الأوسط) وخلايا هوه7/COS7 (الصف السفلي). تمثل الصور كرويدات تشكلت بعد تعليق 3000 خلية من كل حالة (homotypic Huh7 ، COS7 ، أو كرويدات He7/COS7 الغيرية) من نقاط زمنية مختلفة من اليسار إلى اليمين. وشملت التجربة 10 كرويدات لكل حالة، وتم التقاط الصور في 50x التكبير، شريط مقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7544
الشكل 3: التحليل الطولي لنمو كروية غير متغايرة مقابل متجانسة. الرسم البياني يبين منحنى النمو من هوه7 heterotypic /COS7 كرويدات مقابل هوه7 homotypic و COS7 كروية. وتقدم البيانات على أنها متوسط ±.m؛ n = 10 كرويدات مستقلة. ** ص < 0.01؛ ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8120
الشكل 4: نمو كرويدات Hep3B المثلية في LX2 CM. تمثل الأعمدة اليوم الذي تم فيه التقاط صور كروية، وتظهر الصفوف صورا تمثيلية لشفرات Hep3B المستزرعة في وسائط ثقافة DMEM الطازجة (الصف العلوي) أو LX2 CM (الصف السفلي). وشملت التجربة سبعة كرويدات لكل حالة (وسائط جديدة أو LX2 CM)، وتم التقاط الصور في التكبير 50x، شريط مقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8785
الشكل 5: التحليل الطولي لنمو كروية Hep3B المثلية. يوضح الرسم البياني منحنى نمو كرويات Hep3B في وسائط ثقافة DMEM الجديدة أو بيانات LX2 CM. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± s.e..m؛ n = 7 كرويدات مستقلة. ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9332
الشكل 6: التمثيل التخطيطي لعملية تشكيل كروية. تعليق الخلية هو pipetted على الغطاء الداخلي من 10 سم3 بيتري طبق. الغطاء مقلوب وأبقى لمدة 3 أيام للسماح لتشكيل كروية متجانسة أو غير متغايرة. يتم التقاط صور كروية في التكبير 50x. يتم إنشاء هذا الرقم باستخدام أداة التوضيح العلمي على شبكة الإنترنت (انظر جدول المواد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يؤثر السياق الذي تنمو فيه خطوط الخلايا التجريبية على ملف التعبير الجيني وتحليل المسار والمعايير الوظيفية. على سبيل المثال، في خلايا سرطان الثدي، يتم الاحتفاظ بالتنسيق بين المسارات السرطانية المختلفة فقط إذا نمت الخلايا السرطانية في تشكيل ثلاثي الأبعاد27. الجينات غير المنظمة في سرطان الجلد ثلاثي الأبعاد وشفرات سرطان الثدي ، ولكن ليس في الخلايا أحادية الطبقة ، هي أكثر صلة بالورم البشري في الجسم الحي28،29. على سبيل المثال، كانت مستويات integrin β1 في الخلايا الظهارية الثديية ونظراء الورم أقل من المستويات التي نمت في شكل 2D29. وعلاوة على ذلك، تميل الخلايا الليفية في الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى الهجرة بشكل واضح من حيث المورفولوجيا والسرعة مقارنة بتلك المستزرعة على البلاستيك30. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التصلب الميكانيكي لركيزة النمو ينشط مسارات محددة تشجع التحول الخبيث للخلايا الظهارية الطبيعية عن طريق إلغاء تحرير كيناز الإشارة خارج الخلية (ERK) / Rho في الخلايا الظهارية31. هذه العوامل تفضل الانتقال من الثقافة التقليدية 2D إلى نماذج كروية ثلاثية الأبعاد ، حيث أن الثقافات ثلاثية الأبعاد أكثر انسجاما مع الأمراض البشرية.

استخدمت الدراسة الحالية أدوات وإمدادات مختبرية تقليدية لإنتاج نموذج كروي للورم ثلاثي الأبعاد. واستجابت الشفرات المتشكلة لإشارات الانتشار الصادرة عن الخلايا الليفية، كما يبين نموها المتزايد بشكل ملحوظ. ينتمي هذا النموذج إلى فئة كرويدات الورم متعدد الخلايا. هناك ثلاث فئات أخرى من كرويات الورم ثلاثي الأبعاد ، بما في ذلك الكائنات السرطانية32 ، ومجالات الورم المشتقة من الأنسجة3334 ، وpheroids متعددة الخلايا العضوية35. في كرويات الأورام متعددة الخلايا ، يتم تعليق الخلايا السرطانية في ظروف التصاق منخفضة للسماح لها بتجميع معا لتشكيل المجالات دون لمس الجزء السفلي من وعاء الثقافة36. وقد استخدمت عدة نهج لتقديم هذه التقنية المستقلة عن المرسى، بدءا من الأنظمة الدوارة، وتقنيات التراكب السائل، والملحقات غير المصقولة منخفضة للغاية على شكل حرف U37. في HCC ، تستخدم معظم الثقافات الكروية في المختبر لوحات المرفق المنخفضة للغاية 24- أو 96-well لتشكيل كرويدات مستديرة18،19،20،21،22. هذه التقنية، ومع ذلك، ليست فعالة من حيث التكلفة ولا تستبعد أي اتصال عرضي بين الخلية والبلاستيك. تستخدم أنظمة أخرى شرائح عبر الآبار23 أو الكبد12 لإنتاج الأنسجة الدقيقة للكبد. استخدام الأنسجة البشرية في العمل التحويلي هو المعيار الذهبي ولكن ليس دائما متاحة أو يمكن الوصول إليها من قبل العديد من مجموعات البحوث. استفاد النهج الحالي من نظرية القطرات المعلقة. يضاف تعليق الخلية بحيث يتم تشكيل كرويدات الورم في واجهة سائلة الهواء يمكن الوصول إليها لتشكيل المجالات واحدة مدورة38. مزايا استخدام هذه التقنية هي عدم وجود أي اتصال بين الخلايا والبلاستيك وسهولة دراسة الحديث المتبادل الأوتوكرين والباراكرين بين الخلايا السرطانية والخلايا الليفية. تم التحقق من صحة هذا النموذج في دراسة أخرى فك أهمية TREM2 غير parenchymal في حماية الكبد من التنمية HCC39. أظهر هذا العمل أن حجم كل من كرويات Hep3B و PLC/PRF5 كان أعلى في التحكم LX2 CM مقابل LX2-overexpressing LX2 CM بطريقة تعتمد على Wnt39.

في الدراسة الحالية ، تم خلط الخلايا الليفية مع الخلايا السرطانية قبل تشكيل كروية للتحقيق في التأثير التكاثري لهذه الثقافة المشتركة. وأضاف آخرون الخلايا الليفية, الخلايا البطانية, والخلايا المناعية مع تعليق الخلايا السرطانية بعد تشكيل كروية الورم لدراسة هجرة الخلايا النجمية إلى tumor40,41. وأظهر النموذج الحالي كروية غير نمطية نمط نمو مماثل للنماذج المبلغ عنها سابقا والأصلي في ورم في الجسم الحي; تظهر كرويدات النمو الأسي تليها مرحلة النمو المتأخرة، على الأرجح بسبب استنفاد المواد الغذائية وتوسيع core42. بدلا من إضافة عوامل النمو والميتوجين للمساعدة في تشكيل كروية، استخدمت هذه الدراسة نهجا أكثر فسيولوجية من خلال وجود عوامل النمو هذه من الاتصال المباشر مع الخلايا الليفية أو إفرازها في CM الخلايا الليفية. من الضروري أن نذكر أن خلايا LX2 يمكن تنشيطها عن طريق العلاج مع TGFβ1 أو PDGF43. وقد عولجت خلايا LX2 مع 10 نانوغرام / مل TGFβ1 لمدة 48 ساعة قبل إزالة وسائل الإعلام لإعدادات تجريبية مختلفة. تم غسل خلايا LX2 ثلاث مرات مع PBS (لاستبعاد أي تأثير TGFβ1 مباشر) ، ثم تمت إضافة وسائط جديدة لمدة 24 ساعة أخرى قبل جمع CM. تسبب CM الذي تم جمعه من LX2 المحفز TGFβ1 في نمو كرويدات Hep3B بمعدل أعلى من CM من التحكم LX2 (البيانات غير المعروضة). هذا النظام المرن يمكن أن تصلح للثقافات المشتركة من الخلايا السرطانية المختلفة زائد / ناقص الخلايا الليفية، فضلا عن خطوط المستمدة من المريض. كما يمكن أن يقدم فحصا متوسط الإنتاجية للأدوية التي يمكن اعتمادها بسرعة وإدراجها في خط أنابيب اكتشاف الأدوية المترجمة لإعلام المخدرات في دراسات الجسم الحي.

أحد قيود الدراسة الحالية هو استخدام خطوط الخلايا الخالدة في تكوين كروي بدلا من الخلايا السرطانية HCC المعزولة حديثا والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. وهناك قيد آخر هو مقارنة نمو كروية Hep3B المثلية بين CM من LX2 وفي الوسائط الطازجة بدلا من CM من خطوط الخلايا غير الليفية الأخرى. ويمكن معالجة هذا القيد الأخير عن طريق التعديل الوراثي لجين من الاهتمام في الخلايا الليفية تليها تطبيق CM من نوع البرية مقابل الخلايا الليفية المعدلة وراثيا إلى كرويات متجانسة.

Disclosures

FO هو مدير ومساهم في Fibrofind محدودة.

Acknowledgements

يتم تمويل MYWZ من قبل وزير الدولة للأعمال والطاقة والاستراتيجية الصناعية وجائزة نيوتن 2020 كجزء من صندوق المساعدة الإنمائية الرسمية في المملكة المتحدة "ODA" وصندوق نيوتن. ويدعم SS من قبل أبحاث السرطان المملكة المتحدة المتقدمة زمالة عالم السريرية C53575/A29959. SS, FO, والموارد البشرية تلقي التمويل كجزء من هنتر, بتمويل من خلال شراكة بين أبحاث السرطان في المملكة المتحدة, Fondazione AIRC, و Fundacion Cientifica دي لا Asociacion إسبانولا كونترا إل السرطان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x TrypsinSigma Aldrich59429C
2 mL tubesEppendorf
BiorenderBiorender.comOnline
Class II laminar flow BioMAT2 hoodMedair Technologies
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)BioseraM-D1107
Excel sofwareMicrosoft office 365
Graphpad prism sofwareGraphPad software
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)life tech105000064
Image J softwareFiji
L-glutamineSigma AldrichG7513-100ml
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin)Sigma AldrichP0781-100ml
Petri dish 90 mm, triple ventedGreiner633175
Trypan blueSigma AldrichT8154
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg BucketRely+On™SCI-129999
Ziess inverted microscopeZiess

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. International Journal of Cancer. , (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6 (2021).
  3. Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD. Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).
  4. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  5. Reig, M., et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH. Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).
  6. Pfister, D., et al. NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC. Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).
  7. Llovet, J. M., et al. Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference. Hepatology. 73, 158-191 (2021).
  8. Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design. Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).
  9. Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).
  10. Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120 (2018).
  11. Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models. Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).
  12. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  13. Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903 (2020).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).
  16. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  17. Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells. Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).
  18. Shao, H., et al. A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660 (2020).
  19. Song, Y., et al. Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids. Scientific Reports. 6, 36750 (2016).
  20. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  21. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Scientific Reports. 8 (1), 14297 (2018).
  22. Khawar, I. A., et al. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  23. Feaver, R. E., et al. Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis. Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954 (2016).
  24. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  25. Chen, R., et al. Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).
  26. Venkataraman, G., et al. Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).
  27. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).
  28. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  29. Delcommenne, M., Streuli, C. H. Control of integrin expression by extracellular matrix. Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).
  30. Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  33. Weiswald, L. B., et al. Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness. British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).
  34. Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).
  35. Rajcevic, U., et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sciences. 12, 39 (2014).
  36. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  37. Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge. International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).
  38. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  39. Esparza-Baquer, A., et al. TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms. Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).
  40. Dangles-Marie, V., et al. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation. Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).
  41. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  42. Mayer, B., et al. Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas. Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).
  43. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54 (1), 142-151 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved