إنتاج الفأر المتوافق مع البشر عن طريق تطعيم كبسولة الغدة الصعترية الكلوية ، وحقن خلايا CD34 + ، وتوصيل السيتوكين

Summary

توفر نماذج الفئران المتوافقة مع البشر تمثيلا أكثر دقة للبيئة المكروية المناعية البشرية. تصف هذه المخطوطة العملية التي يتم فيها إنشاء هذه النماذج من خلال الطعم الكلوي للغدة الصعترية البشرية ، وحقن خلايا CD34 ⁺ البشرية ، والتوصيل المستهدف للجينات المحورة للسيتوكين البشري لتعزيز تكاثر خلايا CD34 ⁺ وتمايزها.

Abstract

توفر النماذج الحيوانية ترجمة حيوية بين البحوث الطبية الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي . توفر نماذج الفئران المتوافقة مع البشر جسرا في تمثيل الأنظمة البشرية ، مما يسمح بدراسة أكثر دقة للتسبب في المرض والمؤشرات الحيوية والعديد من الاستفسارات العلمية الأخرى. في هذه الطريقة الموصوفة ، يتم زرع الفئران NOD-scid IL2Rγnull (NSG) التي تعاني من نقص المناعة مع الغدة الصعترية الذاتية ، ويتم حقنها بخلايا CD34 ⁺ المشتقة من الكبد متبوعة بسلسلة من عمليات تسليم السيتوكين المحقونة. على عكس النماذج الأخرى ذات الطبيعة المماثلة ، يعزز النموذج الموصوف هنا إعادة تكوين محسنة للخلايا المناعية عن طريق توصيل السيتوكينات وعوامل النمو عبر الجينات المعدلة وراثيا المشفرة في نواقل AAV8 أو pMV101 القائمة على الحمض النووي. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر استقرارا طويل الأمد مع الفئران المعاد تكوينها التي يبلغ متوسط عمرها 30 أسبوعا بعد حقن CD34 ⁺ . من خلال هذا النموذج ، نأمل في توفير طريقة مستقرة ومؤثرة لدراسة العلاج المناعي والأمراض البشرية في نموذج الفئران ، مما يدل على الحاجة إلى نماذج تنبؤية قبل السريرية.

Introduction

في حين أن النماذج الحيوانية خلقت فهما أعمق للأنظمة الخلوية والجزيئية ، إلا أن التحدي لا يزال يتمثل في توضيح تعقيدات الأنظمة الخاصة بالأنواع ، مثل المناعة وعلم وظائف الأعضاء ومجالات أخرى من علم الأمراض. تم استخدام الرئيسيات غير البشرية (NHP) ، مثل الشمبانزي ، تاريخيا للتعويض عن الفجوات المطلوبة في البحث النموذجي. ومع ذلك ، يمكن أن يكون نموذج NHP مكلفا للغاية ولا يمكن الوصول إليه ، لا سيما وأن استخدامه قد تم حظره في أوروبا¹.

بعد إجراء تطعيم ناجح ، يكرر نظام الفئران جهاز المناعة البشري ، كما يتضح من إعادة توطين الأعضاء اللمفاوية. يوفر تطوير الفئران ذات أجهزة المناعة البشرية الوظيفية الفرصة لإجراء أبحاث انتقالية حول مناعة الإنسان في مجموعة متنوعة من السياقات. تسهل الفئران التي تعاني من نقص المناعة المطعمة بخلايا وأنسجة بشرية يمكنها تكرار جهاز المناعة البشري الجراحي بنجاح دراسة تكون الدم والمناعة والعلاج الجيني² والأمراض المعدية³ والسرطان⁴ والطب التجديدي⁵. نشرت مجموعتنا وبعض المتعاونين معنا نتائج باستخدام هذا النموذج الذي يوضح النماذج قبل السريرية للورم الميلانيني الجلدي⁶. هذا النموذج متعدد الاستخدامات بما يكفي لتطبيقه على مجالات لا حصر لها خارج سياق أبحاث الورم الميلانيني والعلاج المناعي.

تستخدم خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) بشكل شائع لإضفاء الطابع الإنساني لأنها تؤدي إلى إعادة تشكيل قوية للخلايا التائية ، والتي لها أدوارا في التسامح المناعي. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض معدل التجديد الذاتي وارتفاع معدل الخلايا الناضجة الملتزمة بالسلالة ، غالبا ما يتم استبدال PBMCs بمنتجات قائمة على الخلايا الجذعية البشرية (HSC) ، والتي يمكن اشتقاقها من كبد الجنين⁷. بالاقتران مع منتجات HSC المشتقة هذه ، فإن إضافة زرع الغدة الصعترية البشرية تحت كبسولات الكلى لفئران NSG تخلق نظاما قادرا على دعم نمو الخلايا التائية البشرية. هذا النموذج ، المعروف باسم نخاع العظام والكبد والغدة الصعترية (BLT) ، مفيد للغاية لأنه يسمح بتكون الدم متعدد السلالات ، وتعليم الخلايا التائية في الغدة الصعترية الذاتية ، وتقييد HLA⁸.

النموذج المقترح في هذه المخطوطة هو نموذج BLT معدل مع توصيل إضافي للسيتوكين. ثبت أن السيتوكينات المسببة للالتهابات تعزز قدرات الخلايا المناعية المستجيبة ، وتحديدا من خلال العلاجات المناعية القائمة على IL-15⁹. لوحظت الخلايا الليمفاوية CD45 ⁺ في الدم المحيطي للفئران المتوافقة مع البشر (الفئران الفردية) بعد حوالي 8-12 أسبوعا من حقن خلايا CD34 ⁺ البشرية ، مما يدل على زيادة واضحة في إعادة التكوين مقارنة بالدم المنتشر لفئران NSG العادية. باستخدام ناقل الأدينو المرتبط لتوصيل IL-3 و IL-7 و GM-CSF البشري ، زادت مستويات خلايا CD45 ⁺ البشرية في الدورة الدموية مقارنة بتلك الفئران التي لا تتلقى السيتوكينات. تعمل إضافة السيتوكينات DNA Combo II (SCF و FLT3 و CKIT و THPO) على تحسين الخلايا التائية وتمايز الخلايا النخاعية¹⁰. تميز إضافة توصيل السيتوكين هذه الطريقة بين نماذج Hu-mice الأخرى ، كما تدعمها البيانات^{المنشورة 10}.

سمح تطوير هذا النموذج باستجابة مناعية بشرية فطرية وتكيفية بنشر البيانات المتعلقة بمقاومة العلاج والبيئة المكروية للورم¹⁰. يمكن للمختبرات المقدمة الوصول إلى عينات الأنسجة لاستخدام هذه الطريقة ؛ يتمتع نموذج Hu-mice هذا بإمكانيات كبيرة للمختبرات الأخرى لدراسة مجالات مماثلة بالإضافة إلى التوسع في مجالات أخرى من العلاج المناعي والدراسات قبل السريرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تتم مراقبة جميع البروتوكولات التي تنطوي على استخدام عن كثب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية والمستخدمين (IACUC) التابعة لمعهد Wistar. يلتزم المختبر بالإرشادات التي وضعتها هذه اللجنة والطبيب البيطري المعالج لضمان صحة وسلامة ورفاهية المعنية. قبل اتباع هذا البروتوكول ، يلزم الحصول على موافقة الطبيب البيطري و IACUC ، وقد يكون لدى الأفراد اختلافات في التقنيات الجراحية المحددة والتعامل مع مقارنة بالبروتوكول وفقا لنصيحة الأطراف المذكورة أعلاه المشاركة في رعاية.

ملاحظة: يمكن تجميد عينات المناديل حتى تصبح جاهزة للاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء عزل CD34 ⁺ في نفس اليوم أو اليوم التالي لجراحة الكسب غير المشروع الكلوي. ستحدد هذه المعلومات متى سيتم حقن بوسولفان: إذا كنت تنوي إجراء عملية جراحية في نفس يوم العزل ، فيجب حقن بوسلفان بشكل استباقي استعدادا لتلقي الأنسجة. علاج ثلاثين أنثى من فئران NSG تتراوح أعمارها بين 5-7 أسابيع ب 30 مجم / كجم (100 ميكرولتر ، PBS 1x) من دواء مستنفد النخاع الطازج ؛ حقن بوسولفان IP قبل 24 ساعة من الجراحة.

1. عزل خلايا CD34 ⁺

1. تحضير محلول الهضم عن طريق إذابة 100 مجم من الكولاجيناز / ديسباز في 50 مل من RPMI1640. استخدم مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر لتعقيم محلول الهضم.
2. يتم توفير كبد الجنين (>20 أسبوعا من العمر) في 50 مل من RPMI1640 متوسط. شفط الوسائط وتخلص منها ، مع ترك 10 مل داخل الأنبوب الذي يحتوي على الكبد.
3. اغسل المنديل ب 45 مل من RPMI1640 + 100 ميكروغرام / مل من المضاد الحيوي بريموسين مرتين في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، مع تنظيف الوسائط بالمكنسة الكهربائية بين كل غسلة. تأكد من ترك الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب قبل تنظيف الوسائط بالمكنسة الكهربائية.
4. ضع منخل مناديل معقم في دورق معقم سعة 200 مل.
5. صب كبد الجنين من خلال المنخل واستخدم نهاية حقنة بلاستيكية معقمة سعة 10 مل لطحن الأنسجة.
6. اشطف خلايا الكبد المتبقية في المنخل باستخدام 50 مل من RPMI1640 + 100 ميكروغرام / مل من المضاد الحيوي بريموسين متبوعا ب 50 مل من RPMI1640 الكولاجيناز / ديسبيز (2 مجم / مل). يحتوي الدورق سعة 200 مل الآن على RPMI1640 مع بريموسين ، RPMI1640 كولاجيناز / ديسباز ، والكبد المتجانس.
7. قم بتقسيم الخليط إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مل واحتضانها في حمام مائي (37 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة. رج الأنابيب المخروطية كل 15 دقيقة.
8. أضف 15 مل من Ficoll في أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
9. ضع طبقة بعناية من محلول الكبد المتجانس في الأعلى ، ووزع ما يقرب من 35 مل بين كل أنبوب. لا تزعج الواجهة.
10. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 800 × جم لمدة 1 ساعة مع الحد الأدنى من التسارع / الفرامل.
11. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي واجمع الخلايا من الواجهة (10-15 مل) إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل.
12. أضف PBS 1x حتى 50 مل لغسل الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
13. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من محلول تحلل ACK (كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم) واحتضانه لمدة 5-10 دقائق. املأ الأنبوب ب 1x PBS.
14. عد الخلايا يدويا تحت المجهر باستخدام المغرق الأزرق ومقياس كثافة الدم. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يمكن حقن خلايا الكبد أحادية النواة مباشرة من هنا إذا رغبت في ذلك ، على سبيل المثال ، إذا كان عدد الخلايا أقل من 50 مليون خلية.
15. قم بتفريغ PBS وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفصل (2 ملي مولار EDTA ، 5 ميكروغرام / مل من BSA في 1x PBS) ل 100 × 10⁶ خلايا أو أقل. لأكثر من 100 × 10⁶ خلايا ، استخدم نسبة تستند إلى كمية الخلايا المذكورة أعلاه لتحديد مقدار المخزن المؤقت (أي مضاعفة الخلايا ، مضاعفة المخزن المؤقت).
16. أضف 100 ميكرولتر من كاشف حجب FcR واحتضن 2-5 دقائق.
17. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الدقيقة CD34 ، واخلطها جيدا واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة ؛ رج العبوة ميكانيكيا باليد بعد 15 دقيقة.
18. أضف 7-10 مل من المخزن المؤقت للفصل وقم بالتصفية من خلال مصافي خلية 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر بهذا الترتيب.
19. ضع فاصل خلية قائم على العمود في فاصل مغناطيسي. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل أسفل الفاصل لتجميع التدفق والمخزن المؤقت.
20. املأ العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفصل.
21. صب تعليق الخلية من خلال العمود.
22. املأ العمود بالتدفق والمخزن المؤقت الذي تم تجميعه في الأنبوب المخروطي.
23. اغسل العمود 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفصل.
24. تخلص من التدفق واستبدل الأنبوب بأنبوب بوليسترين سعة 15 مل.
25. املأ العمود ب 1 مل من المخزن المؤقت للفصل ، وقم بإزالة العمود من المغناطيس وقم بغسل المكبس لأسفل بضغطة واحدة.
26. عد الخلايا وإعادة تعليقها في 1x PBS للحقن. ضعه على الثلج حتى الاستخدام.

2. معالجة الغدة الصعترية

1. اغسل الغدة الصعترية الذاتية (>20 أسبوعا من العمر) بإضافة 5-8 مل من RPMI1640 ، واترك الأنسجة تستقر. قم بإزالة الوسيط بعناية عن طريق المكنسة الكهربائية مع تجنب ملامسة الغدة الصعترية. كرر هذا مرة أخرى.
2. في 10 مل من RPMI1640 درجة حرارة الغرفة باستخدام Primocin (100 ميكروغرام / مل).
3. انقل الغدة الصعترية إلى طبق بتري معالج بالأنسجة. تأكد من أن الغدة الصعترية مغلفة بالكامل بوسائط Primocin.
4. احتضن لمدة 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. نظف الوسائط Primocin. اغسل الغدة الصعترية ب 5-8 مل من RPMI1640 ، وقم بإزالة الوسائط بالمكنسة الكهربائية ، وكرر ذلك مرة أخرى.
6. الغدة الصعترية في 5-8 مل من RPMI1640.
7. جهز الغدة الصعترية المحتضنة للتطعيم عن طريق تقطيع شرائح 1 مم × 2 مم باستخدام مشرطين.
   ملاحظة: سيتم تطعيم هذا في الفئران. لذلك ، تأكد من إمكانية تنظيف شرائح الغدة الصعترية داخل وخارج المحقنة وإبرة هاميلتون المرفقة 22 G بسهولة نسبية.

3. تطعيم الكبسولة تحت الكلوية وحقن خلايا CD34

1. فحص الفئران للتأكد من صحتها العامة قبل الجراحة. احلق الفئران لكشف منطقة (حوالي 3 × 2 بوصة) على الجسم الجانبي الأيسر.
2. قم بتخدير الفئران عن طريق الأيزوفلوران (الحث 5٪ ، الصيانة 2٪ -3٪) في الغرفة ثم انقل الفئران الفردية من الغرفة إلى المرحلة الجراحية باستخدام مخروط الأنف.
3. قم بتعقيم المنطقة المحلوقة باستخدام مسحات الكلوروهيكسيدين والكحول. تأكد من التخدير الفردي عن طريق اختبار القرصة.
4. قم بعمل شق كبير (5-7 مم) خلفي ، جانبي للعمود الفقري للفأر ، وقم بطي الجلد للخلف.
5. تأكد من أن الطحال مرئي تحت اللفافة في هذه المرحلة. قم بعمل شق أصغر ~ 2 مم في اللفافة. تأكد من أن الشق صغير قدر الإمكان مع السماح للكلية بالتعرض بالكامل.
6. تحديد موقع هذا الشق ، وتحديد الطحال بصريا واستخدامه كعلامة للكلى ، وهو غير مرئي.
   ملاحظة: تقع كلية الفئران خلف مجموعة من الدهون في الربع الشمالي الشرقي للطحال.
7. من هنا ، ضع اليد (الجراح) أسفل جانب الفأر مقابل الشق وادفعها لكشف الكلى. أعد وضع أي دهون لتعريض الكلى بالكامل.
8. استخدم الأصابع على نفس اليد لتثبيت الكلية المكشوفة. إذا لزم الأمر ، استخدم 1x PBS معقم لتليين الكلى المكشوفة.
   ملاحظة: من المهم ملاحظة أنه يجب على الجراح استخدام أصابع مختلفة عن تلك التي تعاملت مع جانب الفأر لتثبيت الكلى للحفاظ على العقم. استشر الطبيب البيطري في المعهد بشأن الحفاظ على العقم بشكل صحيح.
9. في الوقت نفسه ، دع المساعد يحضر حقنة حادة بأنسجة الغدة الصعترية الجنينية. امتصاص 2-3 قطع من الغدة الصعترية متوسطة الحجم برفق (1 مم × 2 مم) مع الحد الأدنى من الوسائط على طرف الإبرة ثم سلمها إلى الجراح لإجراء العملية.
   ملاحظة: يعتمد عدد قطع الغدة الصعترية على حجم الأنسجة ، وعادة ما تكون قطعتان تكفيان للحصول على الفئران المتوافقة مع البشر.
10. دع الجراح يدخل الإبرة من خلال الطرف الذيلي لكبسولة الكلى حتى يتم الوصول إلى النهاية البعيدة (~ 2 مم) ، إلى النقطة التي تكون فيها الإبرة مرئية ، لكنها لا تخترق الجانب الجمجمي من كبسولة الكلى. دع المساعد يغرق المحقنة.
11. ضع الكلى مع أي دهون مكشوفة مرة أخرى في الصفاق. ضع خياطة واحدة قابلة للامتصاص (مقاس 4) وأغلق الشق السطحي بغراء بيطري.
12. بعد الجراحة، يتم تطبيق جرعة من الدواء المسكن 25 ميكرولتر من البوبرينورفين المستمر الإطلاق (1 ملغ/مل) عن طريق الحقن تحت الجلد (1 ملغ/كغ).
13. تأكد من أن الفئران تبدأ في التعافي في غضون 5 دقائق بعد العملية.
14. بين الأقفاص ، قم بتغيير القفازات وتعقيم الأدوات في معقم الخرز الزجاجي.
15. من 1-3 ساعات بعد الجراحة ، قم بحقن 100 ميكرولتر من خلايا CD34 ⁺ البشرية (حوالي 100,000 خلية) في الفأر عن طريق الحقن الوريدي (IV).
16. إجراء فحص صحي عام للفئران بعد الانتهاء من الجراحة (عادة 2 ساعة بعد القفص الأول), ثم 24 ساعة و 48 ساعة بعد ذلك.
17. إذا كان هناك أي تشوهات في التصرف أو علامات حيوية ، فراقب الفئران بشكل أكبر. بمجرد إخلاء نقاط التفتيش هذه ، راقب الفئران بشكل أقل صرامة (2x-3x في الأسبوع).
18. بعد أسبوع واحد من الجراحة ، قم بحقن الفئران (IV) ب 100 ميكرولتر من السيتوكين البشري AAV8 (IL-3 و IL-7 و GM-CSF ؛ 2 × 10⁹ نسخ جينوم / مل).
19. بعد أسبوعين من الجراحة ، قم بإجراء الحقن العضلي لكومبو الحمض النووي البلازميد II.
    1. استخدم آلة التثقيب الكهربائي لإجراء حقن المراسلة العضلية لمجموعة الحمض النووي البلازميد II: SCF و FLT3 و CKIT و THPO. لكل فأر ، اجمع بين 25 ميكرولتر من SCF (2 مجم / مل) ، و 25 ميكرولتر من THPO (2 مجم / مل) ، و 25 ميكرولتر من FLT3 (2 مجم / مل) ، و 25 ميكرولتر من CKIT (10 مجم / مل).
    2. قم بإجراء حقنة واحدة لكل ساق خلفية ، أي حقنتين إجمالا ، مع 50 ميكرولتر لكل ساق ، متبوعة بالكهرباء في كل موقع حقن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد الجراحة الناجحة والحقن المناسبة بعد الجراحة ، يمكن تأكيد تمايز CD34 ⁺ عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد حوالي 8 أسابيع من الجراحة ، تنزف الفئران استعدادا ل FACS ، وتتكرر كل أسبوعين حتى يتم استيفاء عتبة محددة من الخلايا المناعية البشرية كما هو موضح سابقا¹⁰. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وصفت هذه المخطوطة هنا توليد الفئران المتوافقة مع البشر عن طريق الغدة الصعترية للجنين البشري المطعمة تحت الكبسولة الكلوية وحقن CD34 ⁺ اللاحق لإعادة إنشاء جهاز المناعة البشري.

بينما يعمل البروتوكول على إنشاء أفضل نموذج ممكن ، فإن بعض الخطوات ضرورية للب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysis buffer	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		blood collection tubes
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Irradiating drug; light sensitive
CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
CKIT	Aldevron	custom	cytokine; stored at -20 °C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	Stored at 4 °C
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
Fetal tissue (liver and thymus)	Advanced Bioscience Resources		Delivered same day or overnight
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Stored at room temperature
FLT3	Aldevron	125964	cytokine; stored at -20 °C
Forceps	Various	Various
Hamilton syringe needle	Various	Various	22 G; 3 point; 2" length
Hemostats	Various	Various
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	magnetic separator
PBS	Gibco	14190-136	Stored at room temperature
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antibiotic; stored at 4 °C
RPMI	Corning	10-040-CM	Stored at 4 °C
SCF	Aldevron	125962	cytokine; stored at -20 °C
Surgical scissors	Various	Various
THPO	Aldevron	125963	cytokine; stored at -20 °C
Tissue treated petri dish	Corning	430167
VetBond glue	3M	1469SB	glue
Visorb suture	Stoelting Co	5046	absorbable suture, size 4, 19 mm cutting