Production de souris humanisées par greffe de capsule rénale thymique, injection de cellules CD34+ et administration de cytokines

Résumé

Les modèles de souris humanisés fournissent une représentation plus précise du microenvironnement immunitaire humain. Ce manuscrit décrit le processus par lequel ces modèles sont créés par une greffe rénale de thymus humain, l’injection de cellules CD34⁺ humaines et l’administration ciblée de transgènes de cytokines humaines pour favoriser la prolifération et la différenciation des cellules CD34⁺ .

Résumé

Les modèles animaux fournissent une traduction vitale entre la recherche biomédicale in vitro et in vivo . Les modèles murins humanisés fournissent un pont dans la représentation des systèmes humains, permettant ainsi une étude plus précise de la pathogenèse, des biomarqueurs et de nombreuses autres requêtes scientifiques. Dans cette méthode décrite, des souris NOD-scid IL2Rγnull (NSG) immunodéficientes sont implantées avec du thymus autologues, injectées avec des cellules CD34⁺ dérivées du foie, suivies d’une série d’injections de cytokines. Contrairement à d’autres modèles de nature similaire, le modèle décrit ici favorise une meilleure reconstitution des cellules immunitaires en délivrant des cytokines et des facteurs de croissance via des transgènes codés dans des vecteurs basés sur l’ADN AAV8 ou pMV101. De plus, il offre une stabilité à long terme avec des souris reconstituées ayant une durée de vie moyenne de 30 semaines après des injections de CD34⁺ . Grâce à ce modèle, nous espérons fournir une méthode stable et efficace d’étude de l’immunothérapie et des maladies humaines dans un modèle murin, démontrant ainsi la nécessité de modèles précliniques prédictifs.

Introduction

Bien que les modèles animaux aient permis de mieux comprendre les systèmes cellulaires et moléculaires, le défi reste d’élucider les subtilités des systèmes spécifiques à une espèce, tels que l’immunité, la physiologie et d’autres domaines de la pathologie. Les primates non humains (PNH), tels que les chimpanzés, ont historiquement été utilisés pour compenser les lacunes dans la recherche sur les modèles ; cependant, le modèle des PSN peut être assez coûteux et inaccessible, d’autant plus que leur utilisation a été interdite en Europe¹.

À la suite d’une procédure de greffe réussie, le système murin réplique le système immunitaire humain, comme le démontre le repeuplement des organes lymphoïdes. Le développement de souris dotées d’un système immunitaire humain fonctionnel offre la possibilité de mener des recherches translationnelles sur l’immunité humaine dans divers contextes. Des souris immunodéficientes greffées avec des cellules et des tissus humains capables de reproduire avec succès un système immunitaire humain opérationnel facilitent l’étude de l’hématopoïèse, de l’immunité, de la thérapie génique², des maladies infectieuses³, du cancer⁴ et de la médecine régénérative⁵. Notre groupe et certains de nos collaborateurs ont publié des résultats utilisant ce modèle qui démontre des modèles précliniques de mélanome cutané⁶. Ce modèle est suffisamment polyvalent pour être appliqué à d’innombrables domaines au-delà du contexte de la recherche sur le mélanome et l’immunothérapie.

Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont couramment utilisées pour l’humanisation car elles entraînent une reconstitution robuste des lymphocytes T, qui ont établi des rôles dans la tolérance immunitaire ; cependant, en raison de leur faible taux d’auto-renouvellement et de leur taux élevé de cellules matures engagées dans la lignée, les PBMC sont souvent remplacés par des produits à base de cellules souches humaines (CSH), qui peuvent être dérivés du foie fœtal⁷. En combinaison avec ces produits dérivés de CSH, l’ajout de l’implantation du thymus humain sous les capsules rénales de souris NSG crée un système capable de soutenir le développement des lymphocytes T humains. Ce modèle, connu sous le nom de moelle osseuse-foie-thymus (BLT), est très avantageux car il permet l’hématopoïèse multilignée, l’éducation des lymphocytes T dans le thymus autologue et la restriction HLA⁸.

Le modèle proposé dans ce manuscrit est un modèle BLT modifié avec administration supplémentaire de cytokines. Il a été démontré que les cytokines pro-inflammatoires renforcent les capacités des cellules immunitaires effectrices, en particulier grâce aux immunothérapies basées sur l’IL-15⁹. Les lymphocytes CD45⁺ sont observés dans le sang périphérique de souris humanisées (souris Hu) environ 8 à 12 semaines après l’injection de cellules CD34⁺ humaines, montrant une augmentation évidente de la reconstitution par rapport au sang circulant des souris NSG ordinaires. En utilisant le vecteur adéno-associé pour délivrer l’IL-3, l’IL-7 et le GM-CSF humains, les niveaux de cellules CD45⁺ humaines ont augmenté en circulation par rapport aux souris qui ne reçoivent pas les cytokines. L’ajout des cytokines DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT et THPO) améliore les lymphocytes T et la différenciation des cellules myéloïdes¹⁰. L’ajout de l’administration de cytokines distingue cette méthode parmi les autres modèles de souris Hu, comme le confirment les données publiées¹⁰.

Le développement de ce modèle avec une réponse immunitaire humaine innée et adaptative a permis de publier des données concernant la résistance aux thérapies et le microenvironnement tumoral¹⁰. Les laboratoires peuvent accéder à des échantillons de tissus pour utiliser cette méthode ; ce modèle Hu-mice a un grand potentiel pour que d’autres laboratoires étudient des domaines similaires et s’étendent à d’autres domaines de l’immunothérapie et des études précliniques.

Protocole

Tous les protocoles impliquant l’utilisation d’animaux sont étroitement surveillés par le Comité Institutionnel de Protection et d’Utilisation des Animaux (IACUC) de l’Institut Wistar. Le laboratoire adhère aux directives établies par ce comité et le vétérinaire traitant pour assurer la santé, la sécurité et le bien-être des animaux impliqués. Avant de suivre ce protocole, l’approbation du vétérinaire et de l’IACUC est requise, et les individus peuvent présenter des variations dans les techniques chirurgicales spécifiques et la manipulation des animaux par rapport au protocole, selon les conseils des parties susmentionnées impliquées dans le bien-être animal.

REMARQUE : Les échantillons de tissus peuvent être congelés jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés. De plus, l’isolement de CD34⁺ peut être effectué le même jour ou le lendemain que la chirurgie de greffe rénale. Cette information permettra de savoir quand le Busulfan sera injecté : si vous avez l’intention d’effectuer une intervention chirurgicale le même jour que l’isolement, le Busulfan doit être injecté de manière préventive en préparation du tissu récepteur. Traiter trente souris NSG femelles âgées de 5 à 7 semaines avec 30 mg/kg (100 μL, PBS 1x) d’un médicament myélodéplévant fraîchement fabriqué ; Busulfan injecté IP 24 h avant l’opération.

1. Isolement des cellules CD34⁺

1. Préparez la solution de digestion en dissolvant 100 mg de collagénase/dispase dans 50 ml de RPMI1640. Utilisez un filtre à vide de 0,22 μm pour stériliser la solution de digestion.
2. Le foie fœtal (âgé de >20 semaines) est fourni dans 50 ml de milieu RPMI1640. Aspirez et jetez le milieu, en laissant 10 ml à l’intérieur du tube contenant le foie.
3. Lavez le mouchoir avec 45 ml de RPMI1640 + 100 μg/mL de l’antibiotique Primocin deux fois dans un tube conique de 50 mL, en aspirant le média entre chaque lavage. Assurez-vous de laisser le mouchoir se déposer au fond du tube avant d’aspirer le support.
4. Placez un tamis à tissus stériles dans un bécher stérile de 200 ml.
5. Versez le foie fœtal à travers le tamis et utilisez l’extrémité d’une seringue en plastique stérile de 10 ml pour broyer le tissu.
6. Rincer les cellules hépatiques qui restent dans le tamis à l’aide de 50 mL de RPMI1640 + 100 μg/mL de l’antibiotique Primocine suivis de 50 mL de milieu de RPMI1640 collagénase/dispase (2 mg/mL). Le bécher de 200 ml contient maintenant le RPMI1640 avec Primocin, RPMI1640 collagénase/dispase, et du foie homogénéisé.
7. Aliquote le mélange dans quatre tubes coniques de 50 mL et incubez-les dans un bain-marie (37 °C) pendant 1 h. Agitez les tubes coniques toutes les 15 min.
8. Ajouter 15 mL de Ficoll dans quatre tubes coniques de 50 mL.
9. Superposez soigneusement la solution hépatique homogénéisée sur le dessus, en répartissant environ 35 ml entre chaque tube. Ne dérangez pas l’interface.
10. Placez les tubes dans la centrifugeuse et faites-les tourner à 800 x g pendant 1 h avec une accélération/un freinage minimal.
11. Retirer les tubes de la centrifugeuse et recueillir les cellules de l’interface (10-15 ml) dans deux tubes coniques de 50 ml.
12. Ajouter du PBS 1x jusqu’à 50 mL pour laver la pastille et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
13. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de tampon de lyse ACK (chlorure d’ammonium-potassium) et incuber pendant 5 à 10 min. Remplissez le tube avec 1x PBS.
14. Comptez manuellement les cellules au microscope à l’aide de bleu trypan et d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : Les cellules mononucléées du foie peuvent être injectées directement à partir d’ici si vous le souhaitez, par exemple, si le nombre de cellules est inférieur à 50 millions de cellules.
15. Aspirez le PBS et remettez en suspension la pastille de cellule dans 300 μL du tampon de séparation (2 mM d’EDTA, 5 μg/mL de BSA dans 1x PBS) pour 100 x 10⁶ cellules ou moins. Pour plus de 100 x 10⁶ cellules, utilisez un rapport basé sur la quantité de cellules ci-dessus pour déterminer la quantité de tampon (c’est-à-dire doubler les cellules, doubler le tampon).
16. Ajouter 100 μL de réactif bloquant le FcR et incuber 2 à 5 min.
17. Ajouter 100 μL d’anticorps contre les microbilles CD34, bien mélanger et incuber sur glace pendant 30 min ; Secouer mécaniquement à la main après 15 min.
18. Ajouter 7 à 10 ml de tampon de séparation et filtrer à travers des crépines de cellules de 100 μm, 70 μm et 40 μm dans cet ordre.
19. Placez un séparateur de cellules à colonne dans un séparateur magnétique. Placez un tube conique de 15 mL sous le séparateur pour recueillir le passage et la mémoire tampon.
20. Remplissez la colonne avec 500 μL de tampon de séparation.
21. Versez la suspension cellulaire à travers la colonne.
22. Remplissez la colonne avec le flux et la mémoire tampon qui ont été collectés dans le tube conique.
23. Laver la colonne 3 fois avec 500 μL de tampon de séparation.
24. Jetez le tube à écoulement continu et remplacez le tube par un tube en polystyrène de 15 ml.
25. Remplissez la colonne avec 1 ml de tampon de séparation, retirez la colonne de l’aimant et rincez le piston vers le bas en une seule pression.
26. Comptez les cellules et remettez-les en suspension dans 1x PBS pour injection. Placer sur de la glace jusqu’à utilisation.

2. Traitement thymique

1. Lavez le thymus autologue (>20 semaines) en ajoutant 5 à 8 ml de RPMI1640, laissez le tissu se déposer. Retirez délicatement le milieu sous vide tout en évitant tout contact avec le thymus. Répétez cette opération une fois de plus.
2. Mettre en suspension dans 10 mL de RPMI1640 à température ambiante avec Primocin (100 μg/mL).
3. Transférez le thymus dans une boîte de Pétri traitée par des tissus. Assurez-vous que le thymus est entièrement enrobé de Primocin-media.
4. Incuber pendant 30-45 min à température ambiante.
5. Aspirez le Primocin-media. Lavez le thymus avec 5 à 8 ml de RPMI1640, retirez le média sous vide et répétez l’opération une fois de plus.
6. Suspendre le thymus dans 5 à 8 mL de RPMI1640.
7. Préparez le thymus incubé pour la greffe en coupant des segments de 1 mm x 2 mm à l’aide de deux scalpels.
   REMARQUE : Celui-ci sera greffé dans les souris ; par conséquent, assurez-vous que les tranches de thymus peuvent être aspirées à la fois dans et hors de la seringue et de l’aiguille Hamilton de 22 G attachée avec une relative facilité.

3. Greffe de capsule sous-rénale et injection de cellules CD34

1. Examinez les souris pour leur état de santé général avant la chirurgie. Rasez les souris pour exposer une zone (environ 3 « x 2 ») sur le corps latéral gauche.
2. Anesthésie les souris via l’isoflurane (induction 5 %, entretien 2 % à 3 %) dans la chambre, puis transfère les souris individuelles de la chambre à un stade chirurgical avec un cône nasal.
3. Désinfectez la zone rasée avec de la chlorohexidine et des tampons de préparation à l’alcool. Assurer une anesthésie individuelle par test de pincement.
4. Faites une grande incision (5-7 mm) à l’arrière, latéralement à la colonne vertébrale de la souris, et repliez la peau.
5. Assurez-vous qu’à ce stade, la rate est visible sous le fascia. Faites une incision plus petite de ~2 mm dans le fascia. Assurez-vous que l’incision est aussi petite que possible tout en permettant au rein d’être complètement exposé.
6. Déterminez l’emplacement de cette incision, en identifiant visuellement la rate et en l’utilisant comme marqueur pour le rein, qui n’est pas visible.
   REMARQUE : Le rein murin est situé derrière un groupe de graisse dans le quadrant nord-est de la rate.
7. À partir de là, placez la main (chirurgien) sous le côté de la souris en face de l’incision et poussez pour exposer le rein. Repositionnez toute graisse pour exposer complètement le rein.
8. Utilisez les doigts de la même main pour stabiliser le rein exposé. Si nécessaire, utilisez du PBS stérile 1x pour lubrifier le rein exposé.
   REMARQUE : Il est important de noter que le chirurgien doit utiliser des doigts différents de ceux qui manipulaient le côté de la souris pour tenir le rein afin de maintenir la stérilité. Consulter le vétérinaire de l’institut concernant le bon maintien de la stérilité.
9. Simultanément, laissez l’assistant préparer une seringue émoussée avec le tissu du thymus fœtal. Aspirez doucement 2 à 3 morceaux de thymus de taille moyenne (1 mm x 2 mm) avec un minimum de support jusqu’à la pointe de l’aiguille, puis remettez-le au chirurgien pour effectuer la procédure.
   REMARQUE : Le nombre de morceaux de thymus dépend de la taille du tissu, généralement 2 morceaux suffisent pour obtenir des souris humanisées.
10. Laissez le chirurgien insérer l’aiguille à travers l’extrémité caudale de la capsule rénale jusqu’à ce que l’extrémité distale soit atteinte (~2 mm), jusqu’au point où l’aiguille est visible, mais elle ne traverse pas le côté crânien de la capsule rénale. Laissez l’assistant plonger la seringue.
11. Replacez le rein, ainsi que toute graisse exposée, dans le péritoine. Placez une suture résorbable (taille 4) et fermez l’incision superficielle avec une colle de liaison vétérinaire.
12. En postopératoire, administrer une dose de l’analgésique, soit 25 μL de buprénorphine à libération prolongée (1 mg/mL) par injection sous-cutanée (1 mg/kg).
13. Vérifiez que les souris commencent à se rétablir dans les 5 minutes suivant l’opération.
14. Entre les cages, changez les gants et stérilisez les instruments dans un stérilisateur à billes de verre.
15. De 1 à 3 heures après la chirurgie, injecter 100 μL de cellules CD34⁺ humaines (environ 100 000 cellules) dans la souris par injection intraveineuse (IV).
16. Effectuez un bilan de santé général sur les souris après la fin de la chirurgie (généralement 2 h après la première cage), puis 24 h et 48 h après.
17. S’il y a des anomalies dans le tempérament ou les signes vitaux, surveillez davantage les souris. Une fois qu’elles ont franchi ces points de contrôle, surveillez les souris de manière moins stricte (2 à 3 fois par semaine).
18. Une semaine après la chirurgie, injectez (IV) aux souris 100 μL de cytokines humaines AAV8 (IL-3, IL-7 et GM-CSF ; 2 x 10⁹ copies du génome/mL).
19. Deux semaines après l’opération, effectuez des injections IM du plasmide ADN Combo II.
    1. Utilisez un appareil d’électroporation pour effectuer des injections IM de l’ADN plasmidique Combo II : SCF, FLT3, CKIT et THPO. Pour chaque souris, combinez 25 μL de SCF (2 mg/mL), 25 μL de THPO (2 mg/mL), 25 μL de FLT3 (2 mg/mL) et 25 μL de CKIT (10 mg/mL).
    2. Effectuer une injection par patte arrière, soit deux au total, à raison de 50 μL par patte, suivie d’une électroporation sur chaque site d’injection.

Résultats

Après une intervention chirurgicale réussie et des injections postopératoires appropriées, la différenciation de CD34⁺ peut être confirmée par cytométrie en flux. Environ 8 semaines après la chirurgie, les souris sont saignées en préparation du FACS, récurrente toutes les 2 semaines jusqu’à ce qu’un seuil spécifique de cellules immunitaires humaines soit atteint, comme décrit précédemment¹⁰. En bref, 100 ml de sang ont été prélev...

Discussion

Ce manuscrit décrit ici la génération de souris humanisées via le thymus fœtal humain greffé sous la capsule rénale et l’injection ultérieure de CD34⁺ pour recréer un système immunitaire humain.

Bien que le protocole fonctionne pour créer le meilleur modèle possible, certaines étapes sont essentielles à la viabilité. Par exemple, lors de l’isolement de CD34⁺ , il est essentiel qu’une personne regardant au microscope p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysis buffer	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		blood collection tubes
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Irradiating drug; light sensitive
CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
CKIT	Aldevron	custom	cytokine; stored at -20 °C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	Stored at 4 °C
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
Fetal tissue (liver and thymus)	Advanced Bioscience Resources		Delivered same day or overnight
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Stored at room temperature
FLT3	Aldevron	125964	cytokine; stored at -20 °C
Forceps	Various	Various
Hamilton syringe needle	Various	Various	22 G; 3 point; 2" length
Hemostats	Various	Various
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	magnetic separator
PBS	Gibco	14190-136	Stored at room temperature
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antibiotic; stored at 4 °C
RPMI	Corning	10-040-CM	Stored at 4 °C
SCF	Aldevron	125962	cytokine; stored at -20 °C
Surgical scissors	Various	Various
THPO	Aldevron	125963	cytokine; stored at -20 °C
Tissue treated petri dish	Corning	430167
VetBond glue	3M	1469SB	glue
Visorb suture	Stoelting Co	5046	absorbable suture, size 4, 19 mm cutting