흉선 신낭 이식, CD34+ 세포 주입 및 사이토카인 전달을 통한 인간화 마우스 생산

요약

인간화 마우스 모델은 인간 면역 미세환경을 보다 정확하게 표현합니다. 이 원고는 CD34⁺ 세포 증식 및 분화를 촉진하기 위해 인간 흉선의 신장 이식, 인간 CD34⁺ 세포 주입 및 인간 사이토카인 전이유전자의 표적 전달을 통해 이러한 모델을 만드는 과정을 설명합니다.

초록

동물 모델은 in vitro 및 in vivo 생물 의학 연구 간의 중요한 번역을 제공합니다. 인간화 마우스 모델은 인간 시스템을 표현하는 데 다리를 제공하여 발병기전, 바이오마커 및 기타 많은 과학적 쿼리에 대한 보다 정확한 연구를 가능하게 합니다. 설명된 이 방법에서는 면역이 결핍된 NOD-scid IL2Rγnull(NSG) 마우스에 자가 흉선을 이식하고 간 유래 CD34⁺ 세포를 주입한 후 일련의 사이토카인을 주입합니다. 유사한 특성의 다른 모델과 달리, 여기에 설명된 모델은 AAV8 또는 pMV101 DNA 기반 벡터에 암호화된 전이유전자를 통해 사이토카인 및 성장 인자를 전달하여 면역 세포의 향상된 재구성을 촉진합니다. 또한, CD34⁺ 주입 후 평균 수명이 30주인 재구성된 마우스로 장기적인 안정성을 제공합니다. 이 모델을 통해 쥐 모델에서 면역 요법 및 인간 질병을 연구하는 안정적이고 영향력 있는 방법을 제공하여 예측 전임상 모델의 필요성을 입증할 수 있기를 희망합니다.

서문

동물 모델을 통해 세포 및 분자 시스템에 대한 더 깊은 이해가 이루어졌지만, 면역, 생리학 및 기타 병리학 영역과 같은 종 특이적 시스템의 복잡성을 밝히는 데는 여전히 어려움이 남아 있습니다. 침팬지와 같은 비인간 영장류(NHP)는 역사적으로 모델 연구의 부족한 부분을 보완하기 위해 사용되어 왔습니다. 그러나 NHP 모델은 특히 유럽¹에서 사용이 금지되어 있기 때문에 비용이 많이 들고 접근하기 어려울 수 있습니다.

성공적인 이식 절차에 따라 쥐 시스템은 림프 기관의 재증식을 통해 입증된 바와 같이 인간 면역 체계를 복제합니다. 기능적인 인간 면역 체계를 가진 마우스의 개발은 다양한 맥락에서 인간 면역에 대한 중개 연구를 수행할 수 있는 기회를 제공합니다. 인체 면역 체계가 작동하는 것을 성공적으로 복제할 수 있는 인간 세포와 조직을 생착시킨 면역결핍 마우스는 조혈, 면역, 유전자 치료², 전염병³, 암⁴, 재생의학⁵에 대한 연구를 용이하게 한다. 우리 그룹과 일부 공동 연구자들은 피부 흑색종의 전임상 모델을 보여주는 이 모델을 사용한 결과를 발표했다⁶. 이 모델은 흑색종 및 면역 요법 연구의 맥락을 넘어 수많은 분야에 적용할 수 있을 만큼 충분히 다재다능합니다.

말초혈액 단핵세포(PBMC)는 면역 관용에 역할을 확립한 T 세포의 강력한 재구성을 초래하기 때문에 인간화에 일반적으로 사용됩니다. 그러나 PBMC는 자가 재생률이 낮고 성숙한 계통 투입 세포의 비율이 높기 때문에 태아 간에서 유래할 수 있는 인간 줄기 세포(HSC) 기반 제품으로 대체되는 경우가 많습니다⁷. 이러한 파생 HSC 산물과 함께 NSG 마우스의 신장 캡슐 아래에 인간 흉선을 이식하면 인간 T 세포 발달을 지원할 수 있는 시스템이 생성됩니다. BLT(bone marrow-liver-thymus)로 알려진 이 모델은 다계통 조혈, 자가 흉선에서의 T세포 교육, HLA 제한⁸을 가능하게 하기 때문에 매우 유리하다.

이 원고에서 제안된 모델은 추가적인 사이토카인 전달을 가진 변형된 BLT 모델입니다. 전염증성 사이토카인은 특히 IL-15 기반 면역요법을 통해 효과기 면역 세포의 능력을 강화하는 것으로 나타났습니다⁹. CD45⁺ 림프구는 인간 CD34⁺ 세포 주입 후 약 8-12주 후에 인간화 마우스(Hu-mice)의 말초 혈액에서 관찰되며, 일반 NSG 마우스의 순환 혈액에 비해 재구성이 뚜렷하게 증가합니다. Adeno-Associated 벡터를 사용하여 human IL-3, IL-7 및 GM-CSF를 전달한 결과, cytokine을 투여받지 않은 마우스에 비해 human CD45⁺ cell의 순환 수치가 증가했습니다. DNA Combo II 사이토카인(SCF, FLT3, CKIT, THPO)을 추가하면 T세포와 골수성 세포 분화가 개선된다¹⁰. 사이토카인 전달의 추가는 발표된 데이터¹⁰에 의해 뒷받침되는 바와 같이 이 방법을 다른 Hu-마우스 모델과 구별합니다.

선천적이고 적응적인 인간 면역 반응을 가진 이 모델의 개발로 치료 저항성 및 종양 미세환경에 관한 데이터를 발표할 수 있었다¹⁰. 단, 실험실에서 이 방법을 활용하기 위해 조직 샘플에 액세스할 수 있습니다. 이 Hu-mice 모델은 다른 실험실에서 유사한 분야를 연구할 수 있을 뿐만 아니라 다른 면역 요법 및 전임상 연구 분야로 확장할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

동물 사용과 관련된 모든 프로토콜은 Wistar Institute의 IACUC(Institutional Animal Care and User Committee)에서 면밀히 모니터링합니다. 실험실은 관련 동물의 건강, 안전 및 복지를 보장하기 위해 본 위원회와 담당 수의사가 정한 지침을 준수합니다. 이 프로토콜을 따르기 전에 수의사 및 IACUC 승인이 필요하며, 개인은 앞서 언급한 동물 복지와 관련된 당사자의 조언에 따라 프로토콜과 비교하여 특정 수술 기술 및 동물 취급에 차이가 있을 수 있습니다.

참고: 조직 샘플은 사용할 준비가 될 때까지 냉동할 수 있습니다. 또한 CD34⁺ 분리는 신장 이식 수술 당일 또는 다음날 수행할 수 있습니다. 이 정보는 Busulfan이 언제 주입되는지를 알려줍니다: 격리 당일에 수술을 진행하려는 경우, 조직 수용을 준비하기 위해 Busulfan을 선제적으로 주입해야 합니다. 30마리의 암컷 5-7주 된 NSG 마우스를 갓 만든 골수 고갈 약물 30mg/kg(100μL, PBS 1x)으로 치료합니다. Busulfan은 수술 24시간 전에 IP를 주입했습니다.

1. CD34⁺ 세포 격리

1. 100mg의 콜라겐분해효소/디스파아제를 50mL의 RPMI1640에 용해시켜 분해액을 준비합니다. 0.22μm 진공 필터를 사용하여 분해 용액을 살균합니다.
2. 태아 간(>20주령)은 50mL의 배지RPMI1640 제공됩니다. 배지를 흡인하여 버리고 간이 들어 있는 튜브 내부에 10mL를 남겨둡니다.
3. 50mL 원추형 튜브에 45mL의 RPMI1640 + 100μg/mL의 항생제 Primocin으로 조직을 두 번 세척하고 세척할 때마다 배지를 진공 청소기로 청소합니다. 매체를 진공 청소기로 청소하기 전에 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 하십시오.
4. 멸균 조직 체를 200mL 멸균 비커에 넣습니다.
5. 체를 통해 태아의 간을 붓고 10mL 멸균 플라스틱 주사기 끝을 사용하여 조직을 갈아냅니다.
6. 50mL의 RPMI1640 + 100μg/mL의 항생제 Primocin을 사용하여 체에 남아 있는 간 세포를 헹구고 50mL의 RPMI1640 콜라겐분해효소/디스파제 배지(2mg/mL)를 사용합니다. 200mL 비커에는 이제 Primocin, RPMI1640 콜라겐 분해 효소 / 디스 파제 및 균질화 된 간이있는 RPMI1640이 포함되어 있습니다.
7. 혼합물을 4개의 50mL 코니컬 튜브에 분취하고 수조(37°C)에서 1시간 동안 배양합니다. 15분마다 원뿔형 튜브를 흔듭니다.
8. 4개의 50mL 코니컬 튜브에 15mL의 Ficoll을 추가합니다.
9. 균질화된 간 용액을 조심스럽게 위에 겹쳐 놓고 각 튜브 사이에 약 35mL를 분배합니다. 인터페이스를 방해하지 마십시오.
10. 튜브를 원심분리기에 놓고 최소한의 가속/브레이크로 800 x g 에서 1시간 동안 회전합니다.
11. 원심분리기에서 튜브를 제거하고 계면(10-15mL)에서 세포를 두 개의 50mL 원뿔형 튜브로 수집합니다.
12. PBS 1x를 최대 50mL까지 첨가하여 펠릿을 세척하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
13. 펠릿을 10mL의 ACK(Ammonium-Chloride-Potassium) 용해 완충액에 재현탁시키고 5-10분 동안 배양합니다. 튜브에 PBS 1개를 채웁니다.
14. trypan blue와 혈구계를 사용하여 현미경으로 세포를 수동으로 계수합니다. 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
    참고: 간 단핵 세포는 원하는 경우, 예를 들어 세포 수가 5천만 개 미만인 경우 여기에서 직접 주입할 수 있습니다.
15. PBS를 진공 청소기로 청소하고 100 x 10⁶ 세포 이하의 경우 300μL의 분리 완충액(2mM EDTA, 1x PBS에서 5μg/mL의 BSA)에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 100 x 10⁶ 셀 이상의 경우 위의 셀 수에 따라 비율을 사용하여 버퍼의 양을 결정합니다(즉, 셀의 두 배, 버퍼의 두 배).
16. 100μL의 FcR 차단 시약을 추가하고 2-5분 동안 배양합니다.
17. CD34 마이크로비드 항체 100μL를 첨가하고 잘 섞은 후 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 15분 후에 손으로 기계적으로 흔듭니다.
18. 7-10mL의 분리 완충액을 추가하고 100μm, 70μm, 40μm 세포 스트레이너를 순으로 필터링합니다.
19. 열 기반 셀 구분 기호를 자기 분리기에 배치합니다. 분리기 아래에 15mL 원뿔형 튜브를 놓아 플로우스루와 버퍼를 수집합니다.
20. 컬럼을 500μL의 분리 완충액으로 채웁니다.
21. 컬럼을 통해 세포 현탁액을 붓습니다.
22. 원뿔형 튜브에 수집된 플로우 스루(flow-through)와 완충액으로 컬럼을 채웁니다.
23. 500μL의 분리 버퍼로 컬럼을 3회 세척합니다.
24. 플로우 스루를 버리고 튜브를 15mL 폴리스티렌 튜브로 교체합니다.
25. 컬럼에 1mL의 분리 버퍼를 채우고 자석에서 컬럼을 제거한 다음 플런저를 한 번에 밀어 내립니다.
26. 세포를 계수하고 주입을 위해 1x PBS에 재현탁합니다. 사용할 때까지 얼음 위에 올려 놓으십시오.

2. 흉선 가공

1. 자가 흉선(>20주령)을 5-8mL의 RPMI1640를 첨가하여 세척하고 조직이 안정되도록 합니다. 흉선과의 접촉을 피하면서 진공 청소기로 매체를 조심스럽게 제거하십시오. 이것을 한 번 더 반복하십시오.
2. 프리모신(100μg/mL)과 함께 실온 RPMI1640 10mL에 현탁합니다.
3. 흉선을 티슈 처리된 페트리 접시에 옮깁니다. 흉선이 Primocin-media로 완전히 코팅되어 있는지 확인하십시오.
4. 실온에서 30-45분 동안 배양합니다.
5. Primocin-media를 진공 청소기로 청소하십시오. 5-8mL의 RPMI1640으로 흉선을 씻고 진공 청소기로 매체를 제거한 다음 한 번 더 반복합니다.
6. 흉선을 5-8mL의 RPMI1640에 현탁시킵니다.
7. 두 개의 메스를 사용하여 1mm x 2mm 분절을 잘라 이식을 위해 배양된 흉선을 준비합니다.
   참고: 이것은 마우스에 접목됩니다. 따라서 흉선 슬라이스를 주사기와 부속된 22G Hamilton 바늘 안팎으로 비교적 쉽게 진공 청소기로 청소할 수 있는지 확인하십시오.

3. 신장하캡슐 이식 및 CD34 세포 주입

1. 수술 전에 생쥐의 전반적인 건강 상태를 검사하십시오. 마우스를 면도하여 왼쪽 측면 몸체의 영역(약 3" x 2")이 노출되도록 합니다.
2. 챔버에서 이소플루란(유도 5%, 유지 2%-3%)을 통해 마우스를 마취한 다음 챔버에서 콧방울을 사용하여 개별 마우스를 수술 단계로 옮깁니다.
3. 클로로헥시딘과 알코올 준비 면봉으로 면도한 부위를 소독합니다. 핀치 테스트를 통해 개별 마취를 보장합니다.
4. 마우스의 척추 옆쪽에서 뒤쪽으로 크게 절개(5-7mm)하고 피부를 뒤로 접습니다.
5. 이 시점에서 비장이 근막 아래에 보이는지 확인하십시오. 근막을 ~2mm 더 작게 절개합니다. 신장이 완전히 노출될 수 있도록 절개 부위가 가능한 한 작은지 확인하십시오.
6. 이 절개 부위의 위치를 결정하고, 비장을 육안으로 식별하고, 이를 눈에 보이지 않는 신장의 표지자로 사용합니다.
   참고: 쥐 신장은 비장의 북동쪽 사분면에 있는 지방 그룹 뒤에 있습니다.
7. 여기에서 손(외과의)을 절개 부위 반대편에 있는 마우스 옆 아래에 놓고 밀어 신장을 노출시킵니다. 신장이 완전히 노출되도록 지방의 위치를 조정하십시오.
8. 같은 손의 손가락을 사용하여 노출된 신장을 안정시킵니다. 필요한 경우 멸균 1x PBS를 사용하여 노출된 신장을 윤활합니다.
   알림: 외과의는 무균 상태를 유지하기 위해 신장을 잡기 위해 마우스 쪽을 다뤄본 손가락과 다른 손가락을 사용해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 적절한 불임 유지 관리에 대해 연구소의 수의사와 상담하십시오.
9. 동시에, 조수가 태아 흉선 조직으로 뭉툭한 주사기를 준비하도록 합니다. 최소한의 매체로 중간 크기의 흉선 덩어리 2-3개(1mm x 2mm)를 바늘 끝까지 부드럽게 빨아들인 다음 외과의에게 넘겨 시술을 진행합니다.
   참고: 흉선 덩어리의 수는 조직의 크기에 따라 다르며, 일반적으로 2개의 덩어리는 인간화된 쥐를 얻기에 충분합니다.
10. 외과의가 신장 캡슐의 꼬리 끝을 통해 바늘이 보이는 지점(~2mm)에 도달할 때까지 바늘을 삽입하되 바늘이 신장 캡슐의 두개골 쪽을 뚫지 않도록 합니다. 조수가 주사기를 떨어뜨리게 합니다.
11. 노출된 지방과 함께 신장을 복막에 다시 놓습니다. 흡수성 봉합사(크기 4)를 하나 놓고 수의사 접착 접착제로 표재성 절개 부위를 닫습니다.
12. 수술 후 진통제인 25μL의 서방성 부프레노르핀(1mg/mL)을 피하 주사(1mg/kg)를 통해 투여합니다.
13. 쥐가 수술 후 5분 이내에 회복하기 시작하는지 확인하십시오.
14. 케이지 사이에서는 장갑을 교체하고 유리 구슬 살균기로 기구를 소독합니다.
15. 수술 후 1-3시간 이내에 100μL의 인간 CD34⁺ 세포(약 100,000개 세포)를 마우스에 정맥 주사(IV) 주사로 주입합니다.
16. 수술을 마친 후(보통 첫 번째 케이지 후 2시간 후), 수술 후 24시간 및 48시간 후에 생쥐에 대한 일반적인 건강 검진을 실시합니다.
17. 기질이나 활력 징후에 이상이 있는 경우 마우스를 더 자세히 모니터링하십시오. 일단 체크포인트를 통과하면 마우스를 덜 엄격하게 모니터링합니다(주당 2회-3회).
18. 수술 일주일 후, 100 μL의 AAV8 인간 사이토카인(IL-3, IL-7 및 GM-CSF; 2 x 10⁹ genome copies/mL)을 마우스에 주입(IV)합니다.
19. 수술 2주 후 플라스미드 DNA Combo II의 IM 주사를 수행합니다.
    1. 전기천공법을 사용하여 플라스미드 DNA Combo II(SCF, FLT3, CKIT 및 THPO)의 IM 주입을 수행합니다. 각 마우스에 대해 25μL의 SCF(2mg/mL), 25μL의 THPO(2mg/mL), 25μL의 FLT3(2mg/mL) 및 25μL의 CKIT(10mg/mL)를 결합합니다.
    2. 뒷다리당 1회, 즉 다리당 50μL씩 총 2회 주입한 다음 각 주입 부위에 전기천공을 실시합니다.

결과

성공적인 수술과 적절한 수술 후 주사 후 유세포 분석을 통해 CD34⁺ 감화를 확인할 수 있습니다. 수술 후 약 8주 후, 마우스는 FACS를 준비하기 위해 출혈을 일으키며, 앞서 설명한 바와 같이 인간 면역 세포의 특정 역치에 도달할 때까지 2주마다 반복됩니다¹⁰. 간단히 말해서, 100mL의 혈액이 리튬과 헤파린으로 코팅된 채혈 튜브에 수집되었습니다. ACK...

토론

본 원고는 본원에서 신장 캡슐 아래에 이식된 인간 태아 흉선을 통해 인간화된 마우스를 생성하고 후속 CD34⁺ 주입을 통해 인간 면역 체계를 재현하는 방법을 설명했습니다.

프로토콜은 가능한 최상의 모델을 만드는 기능을 하지만 특정 단계는 실행 가능성에 필수적입니다. 예를 들어, CD34⁺ 분리 중에는 현미경을 통해 CD34⁺ 세포...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysis buffer	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		blood collection tubes
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Irradiating drug; light sensitive
CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
CKIT	Aldevron	custom	cytokine; stored at -20 °C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	Stored at 4 °C
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
Fetal tissue (liver and thymus)	Advanced Bioscience Resources		Delivered same day or overnight
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Stored at room temperature
FLT3	Aldevron	125964	cytokine; stored at -20 °C
Forceps	Various	Various
Hamilton syringe needle	Various	Various	22 G; 3 point; 2" length
Hemostats	Various	Various
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	magnetic separator
PBS	Gibco	14190-136	Stored at room temperature
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antibiotic; stored at 4 °C
RPMI	Corning	10-040-CM	Stored at 4 °C
SCF	Aldevron	125962	cytokine; stored at -20 °C
Surgical scissors	Various	Various
THPO	Aldevron	125963	cytokine; stored at -20 °C
Tissue treated petri dish	Corning	430167
VetBond glue	3M	1469SB	glue
Visorb suture	Stoelting Co	5046	absorbable suture, size 4, 19 mm cutting