Timik renal kapsül greftleme, CD34+ hücre enjeksiyonu ve sitokin iletimi yoluyla insanlaştırılmış fare üretimi

Özet

İnsanlaştırılmış fare modelleri, insan bağışıklık mikro ortamının daha doğru bir temsilini sağlar. Bu el yazması, bu modellerin insan timusunun renal grefti, insan CD34⁺ hücrelerinin enjeksiyonu ve CD34⁺ hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını teşvik etmek için insan sitokin transgenlerinin hedefli iletimi yoluyla oluşturulduğu süreci açıklamaktadır.

Özet

Hayvan modelleri, in vitro ve in vivo biyomedikal araştırmalar arasında hayati bir çeviri sağlar. İnsanlaştırılmış fare modelleri, insan sistemlerinin temsilinde bir köprü sağlar, böylece patogenez, biyobelirteçler ve diğer birçok bilimsel sorgunun daha doğru bir şekilde incelenmesine olanak tanır. Açıklanan bu yöntemde, bağışıklık eksikliği olan NOD-scid IL2Rγnull (NSG) farelere otolog timus implante edilir, karaciğer kaynaklı CD34 ⁺ hücreleri enjekte edilir ve ardından bir dizi enjekte edilen sitokin iletimi yapılır. Benzer nitelikteki diğer modellerin aksine, burada açıklanan model, AAV8 veya pMV101 DNA bazlı vektörlerde kodlanan transgenler yoluyla sitokinler ve büyüme faktörleri sağlayarak bağışıklık hücrelerinin gelişmiş bir şekilde yeniden yapılandırılmasını destekler. Ayrıca, CD34 ⁺ enjeksiyonlarından sonra ortalama 30 haftalık bir ömre sahip olan sulandırılmış fareler ile uzun vadeli stabilite sunar. Bu model sayesinde, bir fare modelinde immünoterapi ve insan hastalıklarını incelemek için istikrarlı ve etkili bir yöntem sağlamayı umuyoruz, böylece öngörücü preklinik modellere olan ihtiyacı gösteriyoruz.

Giriş

Hayvan modelleri, hücresel ve moleküler sistemler hakkında daha derin bir anlayış yaratmış olsa da, bağışıklık, fizyoloji ve diğer patoloji alanları gibi türe özgü sistemlerin karmaşıklıklarını aydınlatmada zorluk devam etmektedir. Şempanzeler gibi insan olmayan primatlar (NHP), tarihsel olarak model araştırmasındaki eksikleri telafi etmek için kullanılmıştır; bununla birlikte, NHP modeli, özellikle Avrupa'da kullanımları yasaklandığı için oldukça maliyetli ve erişilemez olabilir¹.

Başarılı bir aşılama prosedürünün ardından, murin sistemi, lenfoid organların yeniden popülasyonu ile gösterildiği gibi insan bağışıklık sistemini kopyalar. İşlevsel insan bağışıklık sistemlerine sahip farelerin geliştirilmesi, çeşitli bağlamlarda insan bağışıklığı üzerine translasyonel araştırmalar yapma fırsatı sağlar. Operatif bir insan bağışıklık sistemini başarılı bir şekilde kopyalayabilen insan hücreleri ve dokuları ile aşılanmış immün yetmezliği olan fareler, hematopoez, bağışıklık, gen tedavisi², bulaşıcı hastalıklar³, kanser⁴ ve rejeneratif tıp⁵ çalışmalarını kolaylaştırır. Grubumuz ve bazı işbirlikçilerimiz, kutanöz melanom^6'nın klinik öncesi modellerini gösteren bu modeli kullanarak sonuçlar yayınladılar. Bu model, melanom ve immünoterapi araştırmaları bağlamının ötesinde sayısız alana uygulanabilecek kadar çok yönlüdür.

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), immün toleransta yerleşik rollere sahip olan T hücrelerinin sağlam bir şekilde yeniden yapılandırılmasına yol açtıkları için insanlaştırma için yaygın olarak kullanılır; bununla birlikte, düşük kendini yenileme oranları ve yüksek olgun soya bağlı hücre oranları nedeniyle, PBMC'ler genellikle fetal karaciğerden türetilebilen insan-kök hücre (HSC) bazlı ürünlerle değiştirilir⁷. Bu türetilmiş HSC ürünleri ile kombinasyon halinde, insan timusunun NSG farelerinin böbrek kapsüllerinin altına implante edilmesinin eklenmesi, insan T hücresi gelişimini destekleyebilen bir sistem oluşturur. Kemik iliği-karaciğer-timus (BLT) olarak bilinen bu model, çok soylu hematopoez, otolog timusta T hücresi eğitimi ve HLA kısıtlaması^8'e izin verdiği için oldukça avantajlıdır.

Bu yazıda önerilen model, ek sitokin iletimi olan modifiye edilmiş bir BLT modelidir. Proinflamatuar sitokinlerin, özellikle IL-15 bazlı immünoterapiler yoluyla efektör bağışıklık hücrelerinin yeteneklerini desteklediği gösterilmiştir⁹. CD45⁺ lenfositler, insan CD34⁺ hücre enjeksiyonundan yaklaşık 8-12 hafta sonra insanlaştırılmış farelerin (Hu-fareler) periferik kanında gözlenir ve normal NSG farelerinin dolaşımdaki kanına kıyasla sulandırmada belirgin bir artış gösterir. İnsan IL-3, IL-7 ve GM-CSF'yi iletmek için Adeno-İlişkili vektörü kullanarak, insan CD45 ⁺ hücrelerinin seviyeleri, sitokinleri almayan farelere kıyasla dolaşımda artmıştır. DNA Combo II sitokinlerinin (SCF, FLT3, CKIT ve THPO) eklenmesi, T hücrelerini ve miyeloid hücre farklılaşmasını^{iyileştirir 10}. Sitokin dağıtımının eklenmesi, yayınlanmış veriler¹⁰ tarafından desteklendiği gibi, bu yöntemi diğer Hu-fare modelleri arasında ayırır.

Doğuştan gelen ve adaptif bir insan bağışıklık tepkisi ile bu modelin geliştirilmesi, tedavi direnci ve tümör mikroçevresi ile ilgili verilerin yayınlanmasına izin vermiştir¹⁰. Sağlanan laboratuvarlar bu yöntemi kullanmak için doku örneklerine erişebilir; Bu Hu-fare modeli, diğer laboratuvarların benzer alanları incelemesinin yanı sıra diğer immünoterapi ve klinik öncesi çalışma alanlarına genişlemesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Protokol

Hayvanların kullanımını içeren tüm protokoller, Wistar Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanıcı Komitesi (IACUC) tarafından yakından izlenmektedir. Laboratuvar, ilgili hayvanların sağlığını, güvenliğini ve refahını sağlamak için bu komite ve ilgili veteriner tarafından belirlenen yönergelere uyar. Bu protokolü takip etmeden önce, veteriner hekim ve IACUC onayı gereklidir ve bireyler, hayvan refahı ile ilgili yukarıda belirtilen tarafların tavsiyelerine göre protokole kıyasla spesifik cerrahi tekniklerde ve hayvan kullanımında farklılıklar gösterebilir.

NOT: Doku örnekleri kullanıma hazır olana kadar dondurulabilir. Ek olarak, CD34⁺ izolasyonu renal greft ameliyatı ile aynı gün veya ertesi gün yapılabilir. Bu bilgi, Busulfan'ın ne zaman enjekte edileceği konusunda bilgi verecektir: izolasyonla aynı gün ameliyat yapılması planlanıyorsa, Busulfan, alıcı dokunun hazırlanması için önleyici olarak enjekte edilmelidir. Otuz dişi 5-7 haftalık NSG faresini 30 mg / kg (100 μL, PBS 1x) taze yapılmış miyelo tüketen bir ilaçla tedavi edin; Busulfan ameliyattan 24 saat önce IP enjekte edildi.

1. CD34 ⁺ hücre izolasyonu

1. 100 mg Kollajenaz / Dispas'ı 50 mL RPMI1640 içinde çözerek sindirim solüsyonunu hazırlayın. Sindirim solüsyonunu sterilize etmek için 0,22 μm'lik bir vakum filtresi kullanın.
2. Fetal karaciğer (>20 haftalık) 50 mL RPMI1640 besiyerinde sağlanır. Karaciğeri içeren tüpün içinde 10 mL bırakarak ortamı aspire edin ve atın.
3. Dokuyu 45 mL RPMI1640 + 100 μg/mL antibiyotik Primocin ile 50 mL'lik konik bir tüpte iki kez yıkayın ve her yıkama arasında ortamı vakumlayın. Ortamı vakumlamadan önce dokunun tüpün dibine çökmesine izin verdiğinizden emin olun.
4. 200 mL'lik steril bir behere steril bir doku süzgeci yerleştirin.
5. Fetal karaciğeri elekten geçirin ve dokuyu öğütmek için 10 mL steril plastik şırınganın ucunu kullanın.
6. Elekte kalan karaciğer hücrelerini 50 mL RPMI1640 + 100 μg / mL antibiyotik Primocin ve ardından 50 mL RPMI1640 Kollajenaz / Dispas ortamı (2 mg / mL) kullanarak durulayın. 200 mL'lik beher artık Primosin, RPMI1640 kollajenaz / dispas ve homojenize karaciğer içeren RPMI1640 içerir.
7. Karışımı dört adet 50 mL'lik konik tüpe koyun ve 1 saat boyunca bir su banyosunda (37 ° C) inkübe edin. Konik tüpleri her 15 dakikada bir çalkalayın.
8. Dört adet 50 mL konik tüpe 15 mL Ficoll ekleyin.
9. Homojenize karaciğer solüsyonunu dikkatlice üstüne yerleştirin ve her tüp arasında yaklaşık 35 mL dağıtın. Arayüzü rahatsız etmeyin.
10. Tüpleri santrifüje yerleştirin ve minimum hızlanma/frenleme ile 1 saat boyunca 800 x g'da döndürün.
11. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve hücreleri arayüzden (10-15 mL) iki adet 50 mL konik tüpe toplayın.
12. Peleti yıkamak için 50 mL'ye kadar PBS 1x ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
13. Peleti 10 mL ACK (Amonyum-Klorür-Potasyum) lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve 5-10 dakika inkübe edin. Tüpü 1x PBS ile doldurun.
14. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri manuel olarak sayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: İstenirse, örneğin hücre sayısı 50 milyon hücreden düşükse, karaciğer mononükleer hücreleri doğrudan buradan enjekte edilebilir.
15. PBS'yi vakumlayın ve hücre peletini 100 x 10⁶ veya daha az hücre için 300 μL ayırma tamponunda (2 mM EDTA, 1x PBS'de 5 μg / mL BSA) yeniden süspanse edin. 100 x 10^6'dan fazla hücre için, tampon miktarını belirlemek için yukarıdaki hücre miktarına dayalı bir oran kullanın (yani, hücreleri ikiye katlayın, tamponu ikiye katlayın).
16. 100 μL FcR bloke edici reaktif ekleyin ve 2-5 dakika inkübe edin.
17. 100 μL CD34 mikroboncuk antikoru ekleyin, iyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin; 15 dakika sonra mekanik olarak elle çalkalayın.
18. 7-10 mL ayırma tamponu ekleyin ve bu sırayla 100 μm, 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerinden süzün.
19. Manyetik ayırıcıya sütun tabanlı hücre ayırıcısı yerleştirin. Akışı ve tamponu toplamak için ayırıcının altına 15 mL'lik bir konik tüp yerleştirin.
20. Sütunu 500 μL ayırma tamponu ile doldurun.
21. Hücre süspansiyonunu kolondan dökün.
22. Sütunu, konik tüpte toplanan akış ve tampon ile doldurun.
23. Kolonu 500 μL ayırma tamponu ile 3 kez yıkayın.
24. Akışı atın ve tüpü 15 mL'lik bir polistiren tüp ile değiştirin.
25. Sütunu 1 mL ayırma tamponu ile doldurun, sütunu mıknatıstan çıkarın ve pistonu tek bir dokunuşla aşağı yıkayın.
26. Hücreleri sayın ve enjeksiyon için 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Kullanana kadar buzun üzerine koyun.

2. Timik işleme

1. Otolog timusu (>20 haftalık) 5-8 mL RPMI1640 ekleyerek yıkayın, dokunun oturmasını bekleyin. Timus ile temastan kaçınırken ortamı vakumla dikkatlice çıkarın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
2. Primocin (100 μg / mL) ile RPMI1640 10 mL oda sıcaklığında süspansiyon yapın.
3. Timusu doku ile muamele edilmiş bir Petri kabına aktarın. Timusun Primocin media ile tamamen kaplandığından emin olun.
4. Oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe edin.
5. Primocin ortamını vakumlayın. Timusu 5-8 mL RPMI1640 ile yıkayın, ortamı vakumla çıkarın ve bunu bir kez daha tekrarlayın.
6. Timusu 5-8 mL RPMI1640 içinde süspanse edin.
7. İnkübe edilmiş timusu iki neşter kullanarak 1 mm x 2 mm'lik segmentler dilimleyerek aşılama için hazırlayın.
   NOT: Bu, farelere aşılanacaktır; bu nedenle, timus dilimlerinin şırınganın ve takılı 22 G Hamilton iğnesinin hem içine hem de dışına nispeten kolaylıkla vakumlanabildiğinden emin olun.

3. Subrenal kapsül greftleme ve CD34 hücreleri enjeksiyonu

1. Ameliyattan önce fareleri genel sağlıkları açısından inceleyin. Sol yan gövdede bir alanı (yaklaşık 3 "x 2") ortaya çıkarmak için fareleri tıraş edin.
2. Fareleri odadaki izofluran (indüksiyon% 5, bakım% 2 -% 3) yoluyla uyuşturun ve daha sonra tek tek fareleri odadan bir burun konisi ile cerrahi bir aşamaya aktarın.
3. Traş edilen alanı Kloroheksidin ve alkol hazırlama çubuklarıyla sterilize edin. Kıstırma testi ile bireysel anesteziyi sağlayın.
4. Farenin omurgasının yanında, arkada büyük bir kesi (5-7 mm) yapın ve cildi geriye doğru katlayın.
5. Bu noktada, dalağın fasyanın altında göründüğünden emin olun. Ön panoda ~ 2 mm'lik daha küçük bir kesi yapın. Böbreğin tamamen açığa çıkmasına izin verirken kesiğin mümkün olduğunca küçük olduğundan emin olun.
6. Bu insizyonun yerini belirleyin, dalağı görsel olarak tanımlayın ve görünmeyen böbrek için bir belirteç olarak kullanın.
   NOT: Murin böbreği, dalağın kuzeydoğu kadranında bir yağ grubunun arkasında bulunur.
7. Buradan, elinizi (cerrahı) farenin kesi tarafının altına, kesiğin karşısına yerleştirin ve böbreği ortaya çıkarmak için itin. Böbreği tamamen açığa çıkarmak için herhangi bir yağı yeniden konumlandırın.
8. Açıkta kalan böbreği stabilize etmek için aynı elin parmaklarını kullanın. Gerekirse, açıkta kalan böbreği yağlamak için steril 1x PBS kullanın.
   NOT: Cerrahın, steriliteyi korumak için böbreği tutmak için farenin yan tarafını tutanlardan farklı parmaklar kullanması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Sterilitenin uygun şekilde sürdürülmesi konusunda enstitünün veterinerine danışın.
9. Eşzamanlı olarak, asistanın fetal timus dokusu ile künt bir şırınga hazırlamasına izin verin. 2-3 orta boy timus parçasını (1 mm x 2 mm) minimum ortamla iğnenin ucuna nazikçe emdirin ve ardından işlemi gerçekleştirmesi için cerraha teslim edin.
   NOT: Timus parçalarının sayısı dokunun boyutuna bağlıdır, genellikle insanlaştırılmış fareler elde etmek için 2 parça yeterlidir.
10. Cerrahın iğneyi böbrek kapsülünün kaudal ucundan, distal uca ulaşılana kadar (~ 2 mm), iğnenin göründüğü noktaya kadar sokmasına izin verin, ancak böbrek kapsülünün kraniyal tarafından kırılmaz. Asistanın şırıngayı daldırmasına izin verin.
11. Böbreği, açıkta kalan herhangi bir yağ ile birlikte peritona geri yerleştirin. Bir adet emilebilir sütür (4 numara) yerleştirin ve yüzeysel kesiyi bir veteriner bağ yapıştırıcısı ile kapatın.
12. Ameliyat sonrası, subkütan enjeksiyon (1 mg / kg) yoluyla bir doz analjezik ilaç, 25 μL sürekli salimli buprenorfin (1 mg / mL) uygulayın.
13. Farelerin ameliyattan sonraki 5 dakika içinde iyileşmeye başladığını kontrol edin.
14. Kafesler arasında eldivenleri değiştirin ve aletleri bir cam boncuk sterilizatöründe sterilize edin.
15. Ameliyattan 1-3 saat sonra, intravenöz (IV) enjeksiyon yoluyla fareye 100 μL insan CD34⁺ hücresi (yaklaşık 100.000 hücre) enjekte edin.
16. Ameliyatı tamamladıktan sonra (genellikle ilk kafesten 2 saat sonra), ardından 24 saat ve 48 saat sonra fareler üzerinde genel bir sağlık kontrolü yapın.
17. Eğilim veya yaşamsal belirtilerde herhangi bir anormallik varsa, fareleri daha fazla izleyin. Bu kontrol noktalarını temizledikten sonra, fareleri daha az sıkı bir şekilde izleyin (haftada 2x-3x).
18. Ameliyattan bir hafta sonra, farelere 100 μL AAV8 insan sitokini (IL-3, IL-7 ve GM-CSF; 2 x 10⁹ genom kopyası / mL) enjekte edin (IV).
19. Ameliyattan iki hafta sonra, plazmid DNA Combo II'nin IM enjeksiyonlarını gerçekleştirin.
    1. Plazmid DNA Combo II'nin IM enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için bir elektroporasyon makinesi kullanın: SCF, FLT3, CKIT ve THPO. Her fare için 25 μL SCF (2 mg/mL), 25 μL THPO (2 mg/mL), 25 μL FLT3 (2 mg/mL) ve 25 μL CKIT (10 mg/mL) birleştirin.
    2. Arka bacak başına bir enjeksiyon, yani bacak başına 50 μL ile toplam iki enjeksiyon yapın, ardından her enjeksiyon bölgesinde elektroporasyon yapın.

Sonuçlar

Başarılı cerrahi ve uygun postoperatif enjeksiyonları takiben, CD34 ⁺ diferansiyasyonu akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Ameliyattan yaklaşık 8 hafta sonra, fareler, daha önce¹⁰ tarif edildiği gibi insan bağışıklık hücrelerinin belirli bir eşiğine ulaşılana kadar her 2 haftada bir tekrarlanan FACS'a hazırlık olarak kanalanır. Kısaca 100 mL kan, lityum ve heparin ile kaplı kan alma tüplerinde toplandı. Kırmızı kan hücre...

Tartışmalar

Bu el yazması, bir insan bağışıklık sistemini yeniden oluşturmak için böbrek kapsülü altına aşılanmış insan fetal timus ve ardından CD34 ⁺ enjeksiyonu yoluyla insanlaştırılmış farelerin üretilmesini tanımlamıştır.

Protokol mümkün olan en iyi modeli oluşturmak için işlev görse de, uygulanabilirlik için belirli adımlar gereklidir. Örneğin, CD34⁺ izolasyonu sırasında, mikroskoptan bakan birinin CD34

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysis buffer	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		blood collection tubes
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Irradiating drug; light sensitive
CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
CKIT	Aldevron	custom	cytokine; stored at -20 °C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	Stored at 4 °C
FcR Blocking reagent	Miltenyi Biotec	130-046-702	antibody beads kit; stored at 4 °C
Fetal tissue (liver and thymus)	Advanced Bioscience Resources		Delivered same day or overnight
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Stored at room temperature
FLT3	Aldevron	125964	cytokine; stored at -20 °C
Forceps	Various	Various
Hamilton syringe needle	Various	Various	22 G; 3 point; 2" length
Hemostats	Various	Various
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	magnetic separator
PBS	Gibco	14190-136	Stored at room temperature
Primocin	Invivogen	amt-pm1	antibiotic; stored at 4 °C
RPMI	Corning	10-040-CM	Stored at 4 °C
SCF	Aldevron	125962	cytokine; stored at -20 °C
Surgical scissors	Various	Various
THPO	Aldevron	125963	cytokine; stored at -20 °C
Tissue treated petri dish	Corning	430167
VetBond glue	3M	1469SB	glue
Visorb suture	Stoelting Co	5046	absorbable suture, size 4, 19 mm cutting