JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة طريقة التصوير الزمني الميتوكوندريا لثقافات الخلايا الفلكية المجهزة بمساح حيوي MitoTimer والتحليل متعدد البارامترات الناتج عن ديناميكيات الميتوكوندريا والتنقل والمورفولوجيا والتكوين الحيوي وحالة الأكسدة والدوران.

Abstract

في حين تم إيلاء الكثير من الاهتمام لتعديلات الميتوكوندريا على مستوى الخلايا العصبية، تظهر الأدلة الأخيرة أن ديناميات الميتوكوندريا ووظيفتها في الخلايا الفلكية متورطة في الإدراك. توضح هذه المقالة طريقة التصوير الفاصل الزمني لثقافات الخلايا الفلكية المجهزة بمساح حيوي الميتوكوندريا: MitoTimer. MitoTimer هو أداة قوية وفريدة من نوعها لتقييم ديناميات الميتوكوندريا، والتنقل، مورفولوجيا، التكوين الحيوي، وحالة الأكسدة. هنا ، يتم تقديم الإجراءات المختلفة للثقافة ، واكتساب الصور ، وتحليل الميتوكوندريا اللاحق.

Introduction

الخلايا الفلكية هي لاعبين حاسمين في الحفاظ على التوازن في الدماغ. هم ربما أكثر معروفة أن يكون لها أدوار هيكلية كبيرة في الدماغ, كجزء من حاجز الدم في الدماغ1 ودعم الخلايا العصبية ونقاط الاشتباك العصبي في جميع أنحاء الدماغ2. دعم الخلايا الفلكية من الخلايا العصبية على حد سواءالهيكلية 3 والأيض4,5, مع الخلايا الفلكية تعزيز تكوين الأعصاب وتولد الخلايا النابعة في حين توفر أيضا الأيض الرئيسية مثل اللاكتات إلى الخلايا العصبية النشطة4,6,7. وراء دور الدعم الهيكلي، والخلايا الفلكية هي الخلايا النشطة التي تشارك في Ca2 + الإشارات والتخزين المؤقت (بما في ذلك عفوية الميتوكوندريا Ca2 + التدفقات)8،9، K+ التخزين المؤقت10،ويمكن التكيف والتفاعل مع احتياجات الدماغ في أوقات الإصابة11،12 . كونها مثل هذه الخلايا الديناميكية، الخلايا الفلكية لديها متطلبات الطاقة قوية، الأمر الذي يتطلب شبكة الميتوكوندريا كفاءة. هذه الميتوكوندريا لها أيضا دور حاسم في التخزين المؤقت لأنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS)13. بالإضافة إلى أدوارهم الفردية أو المحلية لتوليد الطاقة والتخزين المؤقت ل ROS ، تعمل الميتوكوندريا كشبكة14. وبهذا المعنى، فإنها تحافظ على التوازن بين الانشطار وانصهار الميتوكوندريا، التي تمثل الميتوكوندريا الجديدة / المخفضة والميتوكوندريا القديمة / المؤتأكسدة، على التوالي15. يمكن قياس حالة الأكسدة الشاملة للخلية من خلال حالة الأكسدة لشبكة الميتوكوندريا. في علم الأمراض ، وهذا هو قطعة حاسمة من المعلومات التي يمكن أن تلقي الضوء على الخلايا التي قد لا تعمل على النحو الأمثل.

في السنوات الأخيرة، تم تطوير العديد من أجهزة الاستشعار لدراسة ديناميات ووظائف الميتوكوندريا في الخلايا. على سبيل المثال، أجهزة الاستشعار قياس تبادل الطاقة (ATP)، حالة الأكسدة (NADH / NAD+، ROS)، وظائف الأنزيمية (cAMP، Ca2 +، ZN2 +) تستخدم حاليا في دراسة وظيفة الميتوكوندريا16. من بينها ، يسمح MitoTimer لمتابعة التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا (الحجم والشكل والمساحة السطحية) ، والتنقل (السرعة والإزاحة) ، والديناميكيات (أحداث الانصهار والانفطار) ، بالإضافة إلى معدل دوران الميتوكوندريا العام وحالة الأكسدة. MitoTimer هو بروتين فلوري أحمر متحول ، drFP58317، مع إشارة الميتوكوندريا من الوحدة الفرعية الثامنة من السيتوكروم البشري c oxidase18،19 لتصور الميتوكوندريا المركبة حديثا باللون الأخضر (488 نانومتر) والميتوكوندريا المؤاتدة باللون الأحمر (555 نانومتر). باستخدام الأخضر (488 نانومتر) والأحمر (555 نانومتر) نسبة الفلورية يسمح التقييم المتزامن للميتوكوندريا الفردية, تحليلها مورفولوجيا, الانصهار / الانشطار الأحداث, وتاريخ الدولة أكسدة20,21. يمكن استخدام هذه الخاصية الفريدة للتحقيق في العديد من الأسئلة العلمية المتعلقة بأدوار الميتوكوندريا الفسيولوجية والمرضية ، وبالتالي فهي واعدة للغاية للكشف عن الآليات الأساسية لديناميكيات الميتوكوندريا داخل العديد من أنواع الخلايا المختلفة.

قمنا مؤخرا بتطوير ناقل العدسة الجديدة (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, فيما بعد يسمى LV-G1-MitoTimer) لدراسة ديناميكية الميتوكوندريا ووظائفها على وجه التحديد في الخلايا الفلكية في المختبر وفي الجسم الحي22. يستخدم LV-G1-MitoTimer نسخة مبتورة من البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) المروج gfaABC1D، مع محسن B3 (gfaABC1D(B3)، وتسمى فيما بعد G1) جنبا إلى جنب مع نظام إلغاء الاستهداف العصبي miR124T الموصوف سابقا23. فإنه يسمح التعبير الحصري للمضاء الحيوي الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية في المختبر وفي الجسم الحي22. هنا هي الخطوات المختلفة لأداء ثقافة الخلايا الفلكية فرس النهر الفئران وتجهيزها مع LV-G1-MitoTimer الاستشعار الحيوي, فضلا عن خطوات المجهر المختلفة لمتابعة سلوك الميتوكوندريا الخلايا الفلكية خلال عدة ساعات متتالية / أيام.

Protocol

وقد نفذ هذا البروتوكول بموافقة لجنة أخلاقية (الاتفاق VD3602، لوزان، سويسرا) ويتبع المبادئ التوجيهية الأوروبية لاستخدام الحيوانات.

1. الجرذ فرس النهر الخلايا الفلكية الثقافة الأولية

  1. التضحية خمسة الجراء الفئران (Wistar IGS الجرذ) عن طريق قطع الرأس في يوم ما بعد الولادة 1-2.
  2. إزالة الدماغ والاحتفاظ بها في طبق بيتري تحتوي على 5 مل من المتوسطة الخلايا الفلكية الطازجة (DMEM مع GlutaMAX تكملها مع 1٪ البنسلين / ستريبتومايسين و 10٪ مصل الحصان الطازج).
  3. عزل قرن آمون. ينفصم في 5 مل من الوسط الفلكي بثلاثة مقاطع من خلال إبرة 21 G وثلاثة مقاطع من خلال إبرة 25 G.
  4. نقل الخلايا المفككة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والعد في مقياس الدم.
  5. لوحة 20،000-25،000 خلية / سم2 في أطباق متعددة بويل (9.4 ملم × 10.7 ملم × 9.3 ملم) وتخزينها في 37 درجة مئوية تحت جو يحتوي على 5٪ CO2 لبقية التجربة.
  6. استبدال المتوسط تماما في 3 أيام في المختبر (DIV3).
  7. في DIV8، إضافة 0.6 pg من مستضد P24 لكل خلية من الترميز ناقلات العدسية لMitoTimer الاستشعار البيولوجي الميتوكوندريا (LV-G1-MitoTimer22)المخفف في المالحة العازلة الفوسفات (PBS + 0.01٪ BSA).
  8. في DIV9، اغسل مع برنامج تلفزيوني معقم 1x (37 درجة مئوية) مسبقا وأضف وسيطا جديدا للخلايا الفلكية.
  9. في DIV11، قم بإجراء غسلين مع برنامج تلفزيوني معقم 1x معقم مسبقا (37 درجة مئوية) وإضافة وسيطة جديدة للخلايا الفلكية دون أحمر الفينول.
    ملاحظة: اختيار الطلاء يعتمد على المقايسة المقصودة. كطلاء قياسي للثقافة الأولية للخلايا الفلكية ، يوصى باستخدام 0.2 ملغم / مل بولي -د-ليسين أو 8.7 ميكروغرام / سم 2 من مصفوفةغشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال ، Matrigel). لتصور نظام الميتوكوندريا من الخلايا الفلكية، فمن الضروري للعمل على الخلايا المسطحة والمتمددة. وفي هذا السياق، فإن الجمع بين مصفوفة غشاء الطابق السفلي على شرائح IBIDI u هو الأنسب. ومن الأهمية بمكان أيضا عدم العمل مع فينول الأحمر، وهو سام للخلية تحت التعرض المتكرر للضوء.

2. مراقبة طويلة الأجل لنظام الميتوكوندريا.

  1. تقييم نظام الميتوكوندريا الفلكية ما لا يقل عن 3-5 أيام بعد العدوى العدسية مع LV-G1-MitoTimer (للسماح بمستوى كاف من الفلورسينس في الميتوكوندريا).
  2. صورة الخلايا مع المجهر مقلوب التي تسيطر عليها برامج اقتناء وتحليل ووحدة لأتمتة كاملة من اقتناء.
    ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل البرنامج والوحدة المستخدمة في هذه الدراسة.
  3. تأكد من أن المجهر مجهز وحاضنة قفص (انظر جدول المواد)للحفاظ على ثقافة الخلايا الفلكية بنسبة 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية طوال التجربة.
  4. التقاط الصور الفلورية باستخدام الإثارة المتتابعة في 490 نانومتر (للقناة الخضراء) و 550 نانومتر (للقناة الحمراء) مع الكشف عن إشارات فلورسينس الخضراء (500-540 نانومتر للقناة الخضراء).
  5. حدد 5 الخلايا الفلكية لكل بئر مع شبكة الميتوكوندريا التعبير عن مستويات كافية من LV-G1-MitoTimer باستخدام تكبير 40x. الحرص على تحديد الخلايا الفلكية مسطحة وكبيرة قدر الإمكان وليس موجودا في مجموعات من الخلايا (للعمل على الخلايا الفردية).
  6. حفظ إحداثيات الخلايا المحددة 5 في ملف xlm (map.xlm). يسمح هذا map.xlm المستخدم للعودة إلى نفس الخلايا بمرور الوقت.
  7. الحصول على تسلسلات الصور (صورة واحدة /ثانية لمدة 60 ثانية) باستخدام تكبير 150x (هدف غمر الزيت 100x ، 1.5x تكبير وسيط) لكل إحداثيات.
  8. تكرار اكتساب الصورة (صورة واحدة/ثانية لمدة 60 ثانية) لنفس الخلايا الفلكية 6 ح، 12 ساعة، و 24 ساعة بعد العلاجات.
    ملاحظة: استخدم مجهر مجهز بنظام التركيز البؤري التلقائي السريع والفعال. في هذا السياق، تم استخدام حل الأجهزة يسمى نظام التركيز المثالي (PFS). يستخدم PFS أجهزة استشعار LED وCCD ذات الأشعة تحت الحمراء القريبة من الأشعة تحت الحمراء 870 نانومتر لمكافحة تقلبات التركيز المحوري في الوقت الفعلي أثناء تحقيقات التصوير طويلة الأجل.

3. تحليل المورفولوجيا الميتوكوندريا الفردية ونسبة LV-G1-MitoTimer

ملاحظة: تم استخدام التحليل العام 3 (GA3) من نيكون لأتمتة التحليل المورفومتري في هذه الدراسة.

  1. لكل تسلسل الصورة (خط الأساس، 6 ساعة، 12 ساعة، 24 ساعة)، حدد الإطار الأول للقنوات الحمراء والخضراء من خلال النقر على ND معالجة > حدد الإطار.
  2. دمج القنوات الحمراء والخضراء عن طريق تحديد التحويلات > دمج القناة.
  3. لتصحيح تظليل الصور، حدد المعالجة المسبقة > تصحيح التظليل التلقائي.
  4. تطبيق خوارزمية الكرة المتداول عن طريق تحديد preprocessing > الكرة المتداول.
  5. لإنشاء أقنعة ثنائية لكل ميتوشوندريون، حدد التقسيم > عتبة.
  6. إزالة أية كائنات اقتطاعها من قبل الحد عن طريق تحديد معالجة ثنائية > حد اللمس.
  7. لقياس مساحة السطح، حدد قياس > منطقة الكائن.
  8. لقياس القطر، حدد قياس قطر مكافئ >.
  9. لقياس الطول، حدد قياس > الطول.
  10. لقياس العرض، حدد قياس > العرض.
  11. لقياس الخشونة، حدد القياس > الخشونة.
  12. لقياس التعميم، حدد قياس > دائرية.
  13. لقياس الاستطالة، حدد القياس > الاستطالة.
  14. إنشاء مجموعة (انقر بزر الماوس الأيمن) مع القياس أعلاه وإعادة تسميتها باسم MorphoData.
  15. قياس متوسط الكثافة الخضراء عن طريق اختيار قياس > متوسط الكثافة.
  16. قياس متوسط الكثافة الحمراء عن طريق تحديد قياس > متوسط الكثافة.
  17. لقياس نسبة الأحمر/الأخضر، حدد نسبة > القياس.
  18. إنشاء مجموعة (انقر بزر الماوس الأيمن) مع القياس أعلاه وإعادة تسميتها باسم RatioData.
  19. تصدير الجدول إلى ملف CSV عن طريق تحديد جدول > مرجع إلى CSV.
  20. حفظ البرنامج النصي GA3 للتحليل عن طريق تحديد حفظ باسم
    ملاحظة: يتم تلخيص قائمة غير شاملة بالمعايير المستخدمة في هذا الإجراء في الشكل 1 والجدول 1والجدول 2. يتوفر ملف البرنامج النصي GA3 التحليل في تكميلية (ملف الترميز التكميلي 1 والشكل 2). تم تكييف العتبات المستخدمة لإضفاء الطابع الفردي على أكبر عدد ممكن من الميتوكوندريا (باستثناء شبكات الميتوكوندريا الكبيرة حيثما أمكن). حيثما أمكن، يتم إما فردية شبكات الميتوكوندريا يدويا أو استبعادها من التحليلات. نظرا للتغير بين الخلايا، قم بإجراء هذه التحليلات على ما لا يقل عن 20-25 خلية لكل حالة (بحد أدنى 50 الميتوكوندريا بالخلية).

4. تحليل حركية الميتوكوندريا

ملاحظة: نظرا للتعقيد الشديد لحركات الميتوكوندريا، يفضل إجراء تحليل الحركة اليدوي. هنا ، تم استخدام نظام نيكون عنصر NIS لتتبع الميتوكوندريا يدويا.

  1. افتح وحدة التتبع في NIS، وحدد عرض تحليل > > التتبع.
  2. انقر على تعريف عائد الاستثمار الجديد.
  3. مع أداة الكشف التلقائي، حدد 25-50 الميتوكوندريا على الصورة الأولى من تسلسل الصورة.
  4. انقر على المسار التلقائي تحليل ROIs.
  5. إذا لزم الأمر، حذف المسارات ROI غير صحيحة.
  6. تصدير الجدول إلى ملف CSV.
    ملاحظة: ترد في الشكل 1 والجدول 3قائمة غير شاملة بالمعايير المستخدمة في هذا الإجراء. يعطي تحليل التتبع بشكل عام مسارا يصور تحركات مركز كل كائن متعقب. يجب تعيين خيارات التتبع المختلفة في خيار التتبع. يفضل اختيار الميتوكوندريا المعزولة التي هي بعيدة بما فيه الكفاية عن بعضها البعض لتسهيل تتبع. احتفظ فقط بالكائنات التي يمكن تعقبها باستمرار عبر التسلسل بأكمله. المضي قدما بنفس الطريقة لإزالة القيم المتطرفة بسبب تتبع نوعية سيئة. وبالتالي، فإن مجموعة الأجسام التي تم تحليلها في هذا القسم تختلف عن تلك التي تم تحليلها للتحليلات المورفولوجية الثابتة وستكون أصغر بشكل عام.

5. تحويل البيانات والتطبيع والتحليل الإحصائي

ملاحظة: يرجع ذلك أساسا إلى عدم التجانس عالية من الميتوكوندريا, البيانات التي تم إنشاؤها غالبا ما يكون التوزيع غير العادي.

  1. تسجيل تحويل القياسات يدويا قبل المعالجة.
  2. لكل تحليل وإطار زمني، قم بتطبيع البيانات الناتجة يدويا حسب متوسط البيانات التي تم الحصول عليها في عملية الاستحواذ المرجعي.
  3. بالإضافة إلى ذلك، فكر في تطبيع ثاني/مزدوج لحالة تحكم، على سبيل المثال، لتقييم تأثير العلاج.
  4. ثم قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام ANOVA المطابقة ثنائية الاتجاه. هنا تم استخدام GraphPad بريزم V8.

النتائج

أظهرت الثقافة الأولية للخلايا الفلكية المصابة ب LV-G1-MitoTimer شبكات الميتوكوندريا النموذجية. قبل العلاج، أظهرت الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer حجم الميتوكوندريا غير المتجانس وكثافات الفلورية الخضراء/الحمراء المختلفة (الشكل 3، الشكل 4، والفيديو 1). تم رصد نظام الميتوكوندريا لثقافات الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer قبل وبعد الحضانة مع H202 (10 ميكرومتر). تم حساب ميزات الميتوكوندريا المختلفة الموصوفة أعلاه على مدى 12 ساعة (كل 3 ح) وتم تطبيعها (خلية بخلية) إلى حالتها الأولية. على المستوى المورفولوجي (الشكل 3B)، تبدأ تأثيرات H2O2 في أن تكون مرئية عند حوالي 6 ساعة. في الواقع ، كانت مجزأة الميتوكوندريا (انخفاض الطول ، ومساحة السطح ، وعامل الاستطالة). هذا التجزئة هو أكثر وضوحا 12 ساعة بعد العلاج. لاحظ أن الأقطار والعرض والكفر لم يتم تقليلها. فيما يتعلق بحالة الأكسدة ودورانها(الشكل 3C)،3 ساعة بعد H2O 2 العلاج، زادت نسبة الميتوكوندرياالخضراء في الخلايا الفلكية (نتيجة لزيادة سريعة في التكوين الحيوي الميتوكوندريا). في 6 ساعة، عادت النسبة الخضراء إلى الحمراء إلى مستويات خط الأساس، ولكن عدد الميتوكوندريا الحمراء البحتة زاد بشكل كبير من المستويات القاعدية. بعد 12 ساعة، كانت عواقب المعالجة التأكسدية ل H2O 2 مرئية وأسفرت عنزيادة كبيرة في نسبة وعدد البونكتا الحمراء. فيما يتعلق بالديناميات والتنقل(الشكل 3D)،3 ساعة بعد العلاج، تم زيادة جميع المعايير بشكل عابر. على المدى الطويل (12 ساعة)، تحركت الميتوكوندريا ببطء أكبر وعلى مسافات أقصر.

figure-results-1705
الشكل 1: ثقافة الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer الاستشعار الحيوي. (أ) صور Confocal من الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer. (ب) اختيار الصور confocal من انخفاض (الأخضر) متوازنة (البرتقالي) وتأكسد (الأحمر) الميتوكوندريا مع مستويات مختلفة من التجزئة. (ج)مخطط موجز للمعايير المختلفة المتاحة للتحليل في الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer. شريط المقياس: (A) اللوحة العليا: 50 ميكرومتر، لوحة سفليا: 10 ميكرومتر، (ب) 1 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2575
الشكل 2: الميتوكوندريا مورفولوجيا وتحليل النسبة. (أ) GA3 نظرة عامة على السيناريو لتحليل المورفولوجيا الميتوكوندريا الفردية ونسبة. (ب)الصور الأولية للخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer تحليلها مع السيناريو GA3. (ج) مثال على الأقنعة الثنائية المتولدة لنظام الميتوكوندريا من الخلايا الفلكية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر (B-C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3288
الشكل 3: آثار H2O2 على نظام الميتوكوندريا من الخلايا الفلكية. (أ) صور الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer 1 ساعة قبل و 6 ح, 24 ح بعد العلاج مع برنامج تلفزيوني (CTRL) و 10 ميكرومتر من H2O2. (ب) مخططات رادارية لمورفولوجيا الميتوكوندريا،(C)حالة الأكسدة ودورانها، و(D)معايير التنقل التي تم تقييمها على الخلايا الفلكية خلال خط الأساس و3 ح، 6 ح، و 12 ساعة بعد H2O2 العلاج. SA: مساحة السطح; D: القطر; L: طول; W: العرض; R: استدارة; S: كروية; EF: عامل الاستطالة (=L/W)؛ G/R: نسبة فردية حمراء/خضراء؛ Gpuncta: النسبة المئوية من الميتوكوندريا puncta الخضراء; Rpuncta: النسبة المئوية من الميتوكوندريا puncta الحمراء; ديس: النزوح; Tr: طول المسار; Sp و SpV: تباين السرعة والسرعة؛ شارع: استقامة. شريط المقياس: 20 ميكرومتر (A) و2.5 ميكرومتر (داخلي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4495
الشكل 4: صور الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1-MitoTimer وتظهر شبكة الميتوكوندريا متجانسة ومتوازنة خلال خط الأساس. شريط المقياس: 20 ميكرومتر الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تأثيرH2O2 العلاج على نظام الميتوكوندريا من الخلايا الفلكية المستزرعة. الميتوكوندريا الفلكية قبل H2O2 العلاج (خط الأساس), فضلا عن 6 ح و 24 ح بعد H2O 2 العلاج مقارنة معخلية التحكم غير المعالجة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

معايير مورفولوجيانطاقملاحظات
مساحة السطح (SA)0.5-4 ميكرومتر2 هذه المعايير على علم ملامح مجزأة ممدود من الميتوكوندريا. وهي تتطور عموما في نفس الاتجاه. الميتوكوندريا المجزأة قد انخفضت مساحة السطح، وقطرها، وطول، وعامل الاستطالة في حين أن الاستدارة، والغلاف، والعرض قد تكون دون تغيير أو زيادة.
القطر (D)0.5-1.5 ميكرومتر
الطول (L)0.5-5 ميكرومتر
العرض (W)0.5-2 ميكرومتر
استدارة (R)0–1
كروية (S)0–1
عامل الاستطالة (EF = L/W)1–10

الجدول 1: ملخص المعلمات المختارة لمورفولوجيا الميتوكوندريا.

معايير حالة الأكسدةنطاقملاحظات
النسبة الفردية (G/R)0–10تشير النسبة إلى نتيجة حالة الأكسدة. وهو يعلم عن الحالة العامة والعمر من الميتوكوندريا في الخلية. من الضروري النظر في أن هذه النسبة هي توازن التكوين الحيوي وتدهور الميتوكوندريا وانصهار / انصهار الميتوكوندريا المؤأكسدة مع انخفاض الميتوكوندريا. ولذلك فإن تقييم عدد من puncta الأخضر والأحمر يمكن أن تساعد بقوة في تفسير النتائج.  يتم تحديد الميتوكوندريا puncta الخضراء عندما كثافة الأخضر هو 10 أضعاف ذلك من الأحمر. يتم تحديد الميتوكوندريا puncta الأحمر عندما تكون كثافة الأحمر 10 مرات أكبر من ذلك من الأخضر. حالة الأكسدة للخلايا الفلكية هي متوسط جميع نسب الميتوكوندريا في تلك الخلية.
النسبة المئوية من الميتوكوندريا puncta الخضراء (Gpuncta)0%–100%
النسبة المئوية للميتوكوندريا puncta الأحمر (Rpuncta)0%–100%

الجدول 2: ملخص المعلمات المختارة لحالة الأكسدة الميتوكوندريا.

معايير التنقلنطاقملاحظات
النزوح (ديس)0-10 ميكرومترمعا هذه الميزات إعلام ديناميات الحركة العامة للشبكة. الميتوكوندريا الثابتة عرض التشريد قصيرة وطول المسار مع سرعة منخفضة. من ناحية أخرى ، يمكن تمييز الجسيمات المتذبذبة مع الفرق بين طول المسار والإزاحة (مما يؤدي إلى انخفاض الاستقامة) وزيادة السرعة مقارنة بالساكنة.
طول المسار (Tr)0-10 ميكرومتر
تباين السرعة والسرعة (Sp و SpV)0-1.5 ميكرومتر/ثانية ± 0.2 ميكرومتر/ثانية
استقامه0–1
(Str = طول الإزاحة/المسار)

الجدول 3: ملخص المعلمات المختارة للتنقل الميتوكوندريا.

ملف الترميز التكميلي 1: GA3 ملف النصي لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا الفردية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

هنا ، يقترح طريقة جديدة لمتابعة ديناميات ودوران نظام الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية المثقفة. على عكس نهج الفاصل الزمني على مجموعة ثابتة من الخلايا أو خلية واحدة فردية في وقت واحد (غالبا ما تستخدم في الأدب)24،25، يمكن للباحثين متابعة تطور نظام الميتوكوندريا خلال عدة أيام على نفس الخلايا الفردية. على النقيض من التصوير الحي بشكل جيد واحد حيث هناك حاجة إلى مستويات عالية من التعرض للضوء ، واختيار العديد من الخلايا الفردية أقل جدوى ، فإن الطريقة المقترحة تستفيد من قدرة هذا المجهر على تصوير العديد من الخلايا المختلفة في مناطق مختلفة من البئر والعودة إلى تلك الخلايا نفسها في نقاط زمنية مختلفة لإعادة تصويرها. وبفضل التطبيع مع خط الأساس الذي يتم تنفيذه لكل معيار محسوب على كل خلية من الخلايا ذات الاهتمام، فإنه يأخذ تعقيد نظام الميتوكوندريا في الاعتبار ويحقق في تأثير العلاج على كل خلية بالنسبة لصورتها الأساسية الخاصة. قدرة المجهر على تنفيذ هذا النوع من التصوير بشكل مستقل على ما يصل إلى 16 بئرا في وقت واحد (تصوير 5 خلايا لكل بئر) يسمح بتغاير نظام الميتوكوندريا يؤخذ في الاعتبار بشكل صحيح أثناء التحليل دون التغير التجريبي الذي يأتي مع تصوير ظروف مختلفة في أيام مختلفة.

نوعية الثقافات، ومستويات العدوى الفيروسية التي تعبر عن الاستشعار الحيوي LV-G1-MitoTimer، ونوع المجهر والأهداف، واختيار الخلايا المناسبة هي متغيرات حاسمة يجب أن تبقى متسقة قدر الإمكان في هذا البروتوكول. كثافة الخلية، ونوع المتجه، والثدي الفيروسي يمكن تكييفها وفقا للسؤال. على الرغم من أن العمل السابق يظهر أن التعبير LV-G1-MitoTimer ليس له عواقب ضارة على وظيفة الميتوكوندريا وديناميات21،22،26،27، فمن الضروري التحقق من أن التركيز ليس ساما للخلايا (على سبيل المثال ، التحقق من العدد الإجمالي للخلايا المسيطرة بشكل جيد). كما يتم استخدام مستوى واحد التنسيق، وينبغي أن تكون الخلايا الفلكية: (1) مسطحة قدر الإمكان، (2) معزولة عن غيرها من الخلايا المسماة (لتبسيط التحليل في حالة التشريد في الطبق)، و (3) امتلاك مستويات عالية من الفلورية. كما يمكن أن تكون الخلايا في الثقافة متغيرة للغاية في مورفولوجيا، يمكن أن يكون نظام الميتوكوندريا غير متجانسة للغاية. وفي هذا السياق، فإن تحليل مؤشرات الاستثمار (وليس الخلية بأكملها) يعوض عن بعض المناطق الإشكالية، مثل المناطق المحيطة بالنوى، ويقلل من التباين. من الضروري القيام خط الأساس على خلايا مشابهة نسبيا وعينة أكبر عدد ممكن من الخلايا. وبالتالي ، فإن مجاهر الحصول على المحتوى العالي والتحليل مناسبة بشكل مثالي. خلال هذا الرصد الطولي، من المهم أيضا عدم تعريض الخلايا للضوء بشكل مفرط لتجنب تبييض الحساس الحيوي.

لا تخلو طريقة التصوير هذه من تعقيداتها ، وفي جميع أنحاء البروتوكول ، يتم تضمين العديد من الملاحظات ، والتي تأخذ في الاعتبار استكشاف الأخطاء وإصلاحها التي تمت خلال الاختبارات السابقة باستخدام المجهر. على سبيل المثال، اختيار طلاء لوحة المستخدمة يعتمد على المقايسة المقصودة، ولكن تم تضمين توصيات لخيارات أنسب للثقافات الأولية astrocyte. بالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء اكتساب الصورة على ما لا يقل عن 5 خلايا لكل حالة بسبب التباين بين الخلايا. وبشكل أكثر تحديدا، فإن بعض الخلايا التي تم اختيارها في التصوير الأساسي سوف تموت، وبعضها سيخرج من إطار منطقة اكتساب الصور المخصصة، وبعضها سيغير مورفولوجياها، مما يجعل من الصعب جدا تخصيص الميتوكوندريا في التحليل. تصوير العديد من الخلايا من البداية تزيد من احتمال وجود حجم عينة كبيرة بما يكفي من الخلايا لتحليل في نهاية التجربة. بالإضافة إلى الجوانب الأكثر تعقيدا لتقنية التصوير هذه ، هناك بعض القيود الصريحة فيما يتعلق بمن يمكنه الاستفادة من هذا النوع من التصوير والتحليل. من أجل الاستفادة الكاملة من أتمتة الحصول على الصورة ، يجب أن يكون المجهر المستخدم نظام التركيز البؤري التلقائي الذي يمكنه التعامل مع سرعة الفواصل الزمنية بين الصور (أي كل 3 ق في هذا البروتوكول) ويمكن أن يركز باستمرار على الخلية المعنية قبل التقاط كل صورة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون برنامج JOBS ، الذي يقوم بأتمتة عملية الحصول على الصورة بأكملها ، تصبح هذه الطريقة شاقة ويحتمل أن تكون مستحيلة اعتمادا على عدد الخلايا التي يتم تصويرها لأنها تتطلب العثور على كل خلية وتصويرها يدويا مرة أخرى في النقطة الزمنية المناسبة. وأخيرا، فإن طريقة التصوير هذه ليست محصنة ضد مسألة الbleaching الضوئي. لهذا السبب ، كما هو الحال مع أي طريقة اقتناء طويلة الأجل ، من المهم اختيار علامات الفلورسنت الأقل عرضة للbleaching وتصميم الحصول على الصورة لتجنب هذه المشكلة قدر الإمكان.

تختلف هذه التقنية عن التقنيات الأخرى المستخدمة حاليا بطريقة حاسمة. على عكس دراسات الفاصل الزمني الأخرى ، لا تتطلب هذه التقنية التصوير على نفس الوضع في البئر طوال الوقت ، ولا تتطلب حركة يدوية للوح لتصوير مناطق أخرى. وهذا يسمح للباحثين القدرة على تصوير العديد من الخلايا في العديد من الظروف في إطار زمني واحد 24 ساعة. وبالتالي، فإن القدرة على إجراء هذا التصوير والتحليل على العديد من الخلايا في كل بئر تعطي نفس المعلومات السكانية التي يمكن للمرء الحصول عليها من دراسة مجموعة كبيرة من الخلايا على نطاق واسع مع توفير تدابير محددة إضافية من كل خلية مصورة. في حين أن بعض الخصائص لهذه الطريقة قد لا تنطبق على أساليب أخرى لاكتساب الصور (المبينة أعلاه) ، فإن الفوائد تفوق المضاعفات مع نوع التحليل الممكن بعد الاستحواذ. تسمح هذه التقنية للباحثين برؤية التداعيات الدقيقة للعلاجات المختلفة على نظام الميتوكوندريا ، وبالتالي ، على الخلايا الفلكية المستزرعة.

بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة قابلة للتخصيص بشكل كبير للعديد من الأسئلة العلمية المختلفة المتعلقة بسلوك الميتوكوندريا وأدوارها في سياقات محددة. هنا يتناول البروتوكول المحدد على وجه التحديد مع الخلايا الفلكية المثقفة. ومع ذلك، يمكن استخدام العديد من أنواع الخلايا الأخرى، والعلاجات التي يمكن اختبارها محدودة فقط من خلال الأسئلة التي يتم التحقيق فيها. هذا النوع من التصوير لديه القدرة على تعزيز المعرفة الجماعية وفهم سلوك الميتوكوندريا ، والآليات الأساسية التي تؤدي إلى خلل الميتوكوندريا ، وآثار العديد من الأمراض على الديناميات الفطرية الموجودة في أنواع مختلفة من الخلايا.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من خلال زمالة مؤسسة Synapsis الممنوحة ل K.R. ومستشفى جامعة لوزان (CHUV). الكتاب أشكر نيكون لمساعدتهم ، ولا سيما J. Gannevat.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide 8 WellIBIDI80807
19 G needlePlexus SANTEPL001213
21 G needlePlexus SANTEPL000142
25 G needlePlexus SANTEPL000133
Bovin Serum AlbuminLIFE TECH15260037
CameraHAMAMATSUORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM)THERMOFISHER61965059
Glutamax SupplementTHERMOFISHER35050061
Horse SerumSIGMA16050122
LensNikon InstrumentsCFI Plan Fluor 100x Oil
Light EnginesLUMENCORSPECTRA X
Linear-encoded motorized platineNikon InstrumentsN/A
MicroscopeNikon InstrumentsECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity moduleOKOLABH201-NIKON-TI-S-ER
PBS 1x liquidTHERMOFISHER20012068
Penicillin-StreptomycinSIGMA15140122
Petri dishes 100 mmSIGMAP5731
Petri dishes 35 mmSIGMACLS430165
Pregnant RatsCHARLES RIVERS3
Software Nikon NIS-HCNikon InstrumentsNIS-Elements HC
Sofware PrismGraphPadV8.02
Stericup 500 mLMERCK MILLIPORE10412701

References

  1. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  2. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  3. Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
  4. Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
  5. MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
  6. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
  7. Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
  8. Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
  9. Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
  10. Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
  11. Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
  12. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  13. Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
  14. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
  15. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
  16. de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
  17. Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  18. Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
  19. Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
  20. Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
  21. Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
  22. Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
  23. Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
  24. Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
  25. Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
  26. Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
  27. Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved