JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وقد استخدمت monolayers الدهون كأساس لتشكيل بلورات البروتين ثنائي الأبعاد (2D) للدراسات الهيكلية لعقود. فهي مستقرة في واجهة الهواء والماء ويمكن أن تكون بمثابة مادة داعمة رقيقة للتصوير الإلكتروني. هنا نقدم الخطوات المثبتة على إعداد monolayers الدهون للدراسات البيولوجية.

Abstract

علم البلورات الإلكترونية هو أداة قوية لتحديد هيكل عالية الدقة. يمكن زراعة الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات القابلة للذوبان أو الأغشية إلى بلورات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) مرتبة للغاية في ظل ظروف مواتية. نوعية بلورات 2D نمت أمر بالغ الأهمية لقرار إعادة الإعمار النهائي عن طريق معالجة الصور 2D. على مر السنين، استخدمت monolayers الدهون كطبقة داعمة لتعزيز بلورة 2D من بروتينات الغشاء المحيطي، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على بلورة ثنائية الأبعاد لبروتينات الأغشية المتكاملة ولكنها تتطلب إجراء تحقيق تجريبي أكثر شمولا لتحديد المنظفات وظروف غسيل الكلى لتعزيز التقسيم إلى طبقة أحادية. تتشكل طبقة أحادية الدهون في واجهة الهواء والماء بحيث تظل مجموعات رأس الدهون القطبية رطبة في المرحلة المائية وتقسم سلاسل acyl غير القطبية والذيول إلى الهواء ، مما يكسر التوتر السطحي ويسطح سطح الماء. توفر الطبيعة المشحونة أو moieties الكيميائية المميزة للمجموعات الرأسية تقاربا للبروتينات في المحلول ، مما يعزز الربط لتشكيل الصفيف 2D. يمكن نقل طبقة أحادية تم تشكيلها حديثا مع الصفيف ثنائي الأبعاد بسهولة إلى المجهر الإلكتروني (EM) على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون تستخدم لرفع ودعم الصفيف البلوري. في هذا العمل، ونحن نصف منهجية أحادية الطبقة الدهون للتصوير المجهري الإلكتروني المبردة (cryo-EM).

Introduction

يمكن أن يحقق الحيود الإلكتروني من خلال بلورات 2D أو صفائف حلية من البروتينات دقة دون نانومتر في الحالات المواتية1و2و3. من أهمية خاصة هي إعادة تشكيلها صفائف البروتين غشاء 2D أو بلورات في بيئاتها شبه الأصلية1. ولأن الكريستال يعمل كمضخم إشارة يعزز شدة العوامل الهيكلية على ترددات مكانية محددة، فإن علم البلورات الإلكترونية يسمح بالتحقيق في هدف بحجم أصغر بدقات عالية، مثل الجزيئات الصغيرة، من تلك الخاصة بالتبريد-EM أحادي الجسيمات. يمكن أن ينتشر شعاع الإلكترون من خلال مجموعة بروتينات 2D مرتبة ، مما يولد نمطا للانعراج أو صورة شعرية اعتمادا على مكان تسجيل مستوى الصورة على الكاشف4. ويمكن بعد ذلك استخراج الكثافات المنتشرة ومعالجتها لإعادة بناء هيكل إسقاط 2D من الكريستال. الإلكترونات لديها أكبر تشتت المقطع العرضي من الأشعة السينية وتشتتها يتبع في الغالب نموذج رذرفورد على أساس التفاعل كولومب بين الإلكترونات والذرات المشحونة في جزيء5. سمك بلورات الغشاء ثنائي الأبعاد عادة ما تكون أقل من 100 نانومتر، ومناسبة لانتقال الإلكترون دون التشتت الديناميكي الذي يحدث داخل العينة6. وقد ثبت أن الدراسات البلورية الإلكترونية أداة قوية للتحقيق في المعلومات الهيكلية عالية الدقة من بروتينات الأغشية والتفاعلات البروتين الدهني7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17.

و monolayer الدهون هي طبقة واحدة من الدهون تتكون من فوسفوليبيدات معبأة بكثافة في واجهة الهواء والماء6، والتي يمكن أن تساعد في تشكيل صفيف 2D للبروتينات القابلة للذوبان أو بروتينات الغشاء المحيطي18. اعتمادا على كثافة الدهون وضغطها الجانبي ، يمكن أن تشكل جزيئات الدهون صفيفا ثنائي الأبعاد مرتبا على واجهة الهواء والماء مع سلاسل أسيل الممتدة إلى الهواء ومجموعات الرأس الهيدروفيلية المكشوفة في المحلول المائي1و6و19. يمكن أن تتفاعل المجموعة الرأسية الدهنية مع البروتينات عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي أو يمكن تعديلها لتوفير علامة تقارب لربط مجال بروتين معين. على سبيل المثال، وDINGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni 2+) غالبا ما يستخدم في تشكيل أحادي الطبقة الدهنية لربط البروتينات مع علامة البولي هيستيدين20،21،22. أيضا ، يمكن للسموم الكوليرا B ربط pentasaccharide معينة من gm1 ganglioside في monolayer الدهون للدراسات الهيكلية23،24. من خلال ترسيخ البروتينات على مجموعات الرأس الدهنية ، يمكن أن تساعد الطبقة الأحادية الدهنية في تكوين الصفائف 2D الرقيقة للدراسات البلورية الإلكترونية عالية الدقة. وقد استخدمت تقنية monolayer الدهون في علم البلورات الإلكترونية للدراسات الهيكلية للبروتينات، مثل streptavidin2،25، annexin V26، الكوليرا السم27، E. coli gyrase B subunit28، E. coli RNA polymerase25،29،30، carboxysome قذيفة البروتينات31 والبروتينات capsid من فيروس نقص المناعة البشرية -1 32 ومولوني مورين فيروس سرطان الدم 33.نظرا للاستقرار والخصائص الكيميائية للدهون monolayer، وقد تم استكشاف تطبيقات مختلفة لإعداد عينة للتصوير cryo-EM34. ومع ذلك، سوف تكون هناك حاجة إلى التحسين لتشكيل صفيف البروتين.

هنا، ونحن نقدم تفاصيل مستفيضة عن الإعداد العام من monolayers الدهون للتصوير cryo-EM وبعض الاعتبارات التي يمكن أن تؤثر على نوعية monolayers شكلت.

Protocol

1. تفلون كتلة إعداد

  1. إعداد كتلة تفلون من مقاومة للمواد الكيميائية PTFE (البوليتيترافلوروإيثيلين) الراتنج. قم بعمل ثقوب على الكتلة باستخدام حفر عام متبوعا بالأبعاد المسماة في الشكل 1.

2. إعداد الدهون أحادية الطبقة

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 30- 45 دقيقة

  1. إعداد مخزون الدهون
    1. إعداد خليط الدهون 0.01 ملغم / مل في 9:1 (v/v) الكلوروفورم / الميثانول باستخدام 8.91 مل من الكلوروفورم، 0.99 مل من الميثانول و 0.01 مل من 10 ملغم / مل الدهون.
  2. إعداد لوحة تفلون
    1. Sonicate لوحة تفلون في حمام الميثانول لمدة 5 دقائق.
    2. يغسل بالماء الساخن لمدة 15 دقيقة.
    3. شطف بالماء المقطر.
    4. جفف صفيحة تفلون في مجفف لمدة 30 دقيقة وأبقها تحت الفراغ عندما لا تكون قيد الاستخدام(الشكل 1).

3. تشكيل أحادية الطبقة الدهنية على خزان العازلة

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 1.5 ساعة

  1. إعداد طازج خليط من الدهون 0.01 ملغ / مل في خليط 9:1 من الكلوروفورم / الميثانول في يوم التجربة.
  2. ضع ورقة فلتر من النوع 1 في طبق بيتري وقم بترتيب كتلة تفلون أعلى ورقة التصفية.
  3. ملء الآبار من لوحة تفلون مع 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
  4. إضافة بعناية خليط الدهون على رأس سطح العازلة قطرة قطرة (من الناحية المثالية 1 ميكرولتر لكل قطرة) باستخدام حقنة هاملتون.
  5. بلل ورق الفلتر بالماء المقطر للحفاظ على الرطوبة في طبق بيتري.
  6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. يجب أن يتبخر الكلوروفورم ، ويجب تشكيل طبقة أحادية من الدهون على سطح العازلة.

4. تطبيق شبكة EM على أحادي الطبقة الدهنية

ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 1.5 ساعة

  1. ضع بلطف شبكة EM المغلفة بالكربون دون تفريغ توهج ، جانب الكربون لأسفل ، على الجزء العلوي من كل خزان عازل.
  2. حقن البروتينات بعناية في حقن الجانب جيدا. استخدام تركيزات البروتين النهائي في البئر حوالي 1 ميكرومتر من البروتين كنقطة انطلاق. قبل تحسين تركيز البروتين قبل التجربة.
  3. احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. حقن بلطف ما يقرب من 20-30 ميكرولتر من العازلة في منفذ الحقن الجانب. هذا سيرفع الشبكة فوق سطح كتلة تفلون.
  5. التقط الشبكة مباشرة بملاقط وارفعها عموديا عن القطيرات.
  6. إعداد عينات أحادية الطبقة لتلطيخ سلبي أو التصوير بالتبريد-TEM (الشكل 2). إذا كانت البروتينات تشكل صفيف 2D، فإن طيف قوة الصورة أو فورير بالفترة تظهر كثافة الحيود في الترددات المكانية على أساس التماثل الكريستالي. إذا لم تظهر بقع حيود في طيف الطاقة ، من غير المرجح أن تشكل البروتينات بلورة ثنائية الأبعاد.
  7. تحقق من تغطية طبقة الدهون الأحادية على شبكة EM باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الحركة (TEM). صورة الإلكترون أقل تضخيما مفيدة لتحديد مورفولوجيا طبقة أحادية مغطاة. عادة، سيكون تباين الصورة للمنطقة المغطاة أحادية الطبقة أقل قليلا من المناطق المكشوفة. بالإضافة إلى ذلك، سيساعد طيف طاقة الصورة 2D المحسوب في تحديد موقع البلورية 2D.

النتائج

يمكن تصور طبقة أحادية الدهون المودعة على شبكة EM تحت المجهر الإلكتروني ناقل الحركة (TEM) دون تلطيخ. يمكن التعرف على وجود أحادي الطبقة من خلال الفرق التباين من المنطقة دون أي عينة في مسار شعاع. المناطق التي لديها تغطية أحادية الطبقة الدهنية لديها تباين محلي أقل من تلك التي لا تغطيها ، لأن شعاع ?...

Discussion

طبقة أحادية الدهون هي أداة قوية تسهل نمو بلورات كبيرة 2D للدراسات الهيكلية للجزيئات الكبيرة البيولوجية. لإعداد طبقة أحادية الدهون سليمة بنجاح في واجهة الهواء والماء، فمن المستحسن بشدة أن يتم إعداد الدهون طازجة في يوم التجربة، لأن أكسدة سلسلة أسيل الدهون يمكن أن يؤدي إلى اضطراب التعبئة في ...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

Acknowledgements

تم دعم إعداد هذه المخطوطة جزئيا من قبل مكتب أبحاث الجيش الأمريكي (W911NF2010321) وصناديق بدء تشغيل جامعة ولاية أريزونا إلى P.-L.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipetsFisher Scientific03-448-21
ChloroformSigma-AldrichC2432
Desiccator vacuumSouthern Labware55207
EM gridsElectron Microscopy SciencesCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paperGE Healthcare Life Sciences1001-090Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipetsFisher Scientific13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)Hamilton Company80465
Hamilton syringe (250 µL)Hamilton Company81165
Hamilton syringe (5 µL)Hamilton Company87930
Hamilton syringe (500 µL)Hamilton Company203080
MethanolSigma-AldrichM1775-1GA
Petri dishVWR25384-342100 mm × 15 mm
Teflon blockGrainger55UK0560 µL wells with side injection ports, manually made
TweezersElectron Microscopy Sciences78325Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleanerVWR97043-996

References

  1. Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
  2. Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
  3. Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
  4. Wang, H. -. W., Wang, J. -. W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
  5. Williams, D. B., Carter, C. B. . Transmission electron microscopy. , (2016).
  6. Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
  7. Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
  8. Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
  9. Hite, R. K., Chiu, P. -. L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
  10. Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
  11. Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
  12. Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
  13. Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
  14. Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
  15. Chiu, P. -. L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
  16. Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
  17. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
  18. Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
  19. Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
  20. Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
  21. Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
  22. Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
  23. Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
  24. Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
  25. Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
  26. Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
  27. Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
  28. Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
  29. Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
  30. Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
  31. Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
  32. Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
  33. Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
  34. Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
  35. Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
  36. Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
  37. Dietrich, J., nien-Bryan, C. . Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , (2005).
  38. Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
  39. De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -. M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
  40. Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
  41. Rémigy, H. -. W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
  42. Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
  43. Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
  44. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  45. Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved