Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Resumo

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Resumo

A cristalografia eletrônica é uma ferramenta poderosa para a determinação da estrutura de alta resolução. Macromoléculas como proteínas solúveis ou membranas podem ser cultivadas em cristais bidimensionais altamente ordenados (2D) em condições favoráveis. A qualidade dos cristais 2D cultivados é crucial para a resolução da reconstrução final via processamento de imagem 2D. Ao longo dos anos, monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D de proteínas de membrana integral, mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover o particionamento da monocamadas. Uma monocamada lipídica se forma na interface ar-água de tal forma que os grupos de cabeça lipídica polar permanecem hidratados na fase aquosa e nas cadeias aciíticas não polares, divisória de caudas no ar, quebrando a tensão superficial e achatando a superfície da água. A natureza carregada ou as características químicas distintas dos grupos chefes fornecem afinidade por proteínas em solução, promovendo a vinculação para a formação de matriz 2D. Uma monocamada recém-formada com a matriz 2D pode ser prontamente transferida para um microscópio eletrônico (EM) em uma grade de cobre revestida de carbono usada para levantar e suportar a matriz cristalina. Neste trabalho, descrevemos uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens microscópicas de elétrons criogênicos (crio-EM).

Introdução

A difração eletrônica através de cristais 2D ou matrizes helicoidais de proteínas podem alcançar resoluções subnômetros em casos favoráveis^1,2,3. De particular interesse são matrizes de proteína de membrana 2D reconstituídas ou cristais em seus ambientes quase nativos¹. Como um cristal age como um amplificador de sinal aumentando a intensidade dos fatores estruturais em frequências espaciais específicas, a cristalografia eletrônica permite sondar um alvo com um tamanho menor em altas resoluções, como pequenas moléculas, do que aquelas para crio-EM de u....

Protocolo

1. Preparação do bloco de Teflon

1. Prepare o bloco de Teflon a partir de resina PTFE resistente a produtos químicos (politetrafluoroetileno). Faça furos no bloco usando uma broca geral seguida pelas dimensões rotuladas na Figura 1.

2. Preparação lipídica de monocamadas

NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 30-45 minutos

1. Preparação de estoque lipídida
   1. Prepare uma mistura lipídica de 0,01 mg/mL em 9:1 (v/v) clorofórmio/metanol usando 8,91 mL de clorofórmio, 0,99 mL de metanol e 0,01 mL de lipídios de 10 mg/mL.

Resultados

Uma monocamada lipídica depositada na grade EM pode ser visualizada sob um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) sem coloração. A presença da monocamadas pode ser reconhecida pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime no caminho do feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm menor contraste local do que as sem cobertura, uma vez que o feixe de elétrons através dos orifícios vazios não tem dispersão e mostra uma iluminação mais brilhante(.......

Discussão

Uma monocamada lipídica é uma ferramenta poderosa que facilita o crescimento de grandes cristais 2D para estudos estruturais de macromoléculas biológicas. Para preparar com sucesso uma monocamada lipídica intacta na interface ar-água, é fortemente recomendável que os lipídios sejam preparados recentemente no dia do experimento, pois a oxidação da cadeia lipídica do acil pode levar à interrupção da embalagem na monocamada e afetar negativamente a formação de cristais resultante. Lipídios comprados em for.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996