Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Resumo

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Resumo

A cristalografia eletrônica é uma ferramenta poderosa para a determinação da estrutura de alta resolução. Macromoléculas como proteínas solúveis ou membranas podem ser cultivadas em cristais bidimensionais altamente ordenados (2D) em condições favoráveis. A qualidade dos cristais 2D cultivados é crucial para a resolução da reconstrução final via processamento de imagem 2D. Ao longo dos anos, monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D de proteínas de membrana integral, mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover o particionamento da monocamadas. Uma monocamada lipídica se forma na interface ar-água de tal forma que os grupos de cabeça lipídica polar permanecem hidratados na fase aquosa e nas cadeias aciíticas não polares, divisória de caudas no ar, quebrando a tensão superficial e achatando a superfície da água. A natureza carregada ou as características químicas distintas dos grupos chefes fornecem afinidade por proteínas em solução, promovendo a vinculação para a formação de matriz 2D. Uma monocamada recém-formada com a matriz 2D pode ser prontamente transferida para um microscópio eletrônico (EM) em uma grade de cobre revestida de carbono usada para levantar e suportar a matriz cristalina. Neste trabalho, descrevemos uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens microscópicas de elétrons criogênicos (crio-EM).

Introdução

A difração eletrônica através de cristais 2D ou matrizes helicoidais de proteínas podem alcançar resoluções subnômetros em casos favoráveis^1,2,3. De particular interesse são matrizes de proteína de membrana 2D reconstituídas ou cristais em seus ambientes quase nativos¹. Como um cristal age como um amplificador de sinal aumentando a intensidade dos fatores estruturais em frequências espaciais específicas, a cristalografia eletrônica permite sondar um alvo com um tamanho menor em altas resoluções, como pequenas moléculas, do que aquelas para crio-EM de uma única partícula. O feixe de elétrons pode ser difracionado por uma matriz 2D ordenada de proteínas, gerando um padrão de difração ou uma imagem de rede, dependendo de onde o plano de imagem é gravado no detector⁴. As intensidades ditracadas podem então ser extraídas e processadas para reconstruir uma estrutura de projeção 2D do cristal. Os elétrons têm uma seção transversal de dispersão maior do que os raios-X e sua dispersão segue principalmente o modelo rutherford baseado na interação coulomb entre os elétrons e os átomos carregados na molécula⁵. As espessuras dos cristais de membrana 2D são geralmente inferiores a 100 nm, adequadas para transmissão eletrônica sem dispersão dinâmica ocorrendo dentro da amostra⁶. Estudos cristalográficos eletrônicos têm se mostrado uma poderosa ferramenta para sondar informações estruturais de alta resolução de proteínas de membrana e interações lipídica-proteínas^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}.

Uma monocamada lipídica é uma única camada lipídica composta de fosfolipídios densamente embalados em uma interface ar-água⁶, que pode auxiliar a formação de matriz 2D para proteínas solúveis ou proteínas de membrana periférica¹⁸. Dependendo da densidade dos lipídios e de sua pressão lateral, as moléculas lipídicas podem formar uma matriz 2D ordenada na interface ar-água com suas correntes de aciis estendidas ao ar e grupos de cabeça hidrofílicos expostos na solução aquosa^1,6,19. O headgroup lipídico pode interagir com proteínas através da interação eletrostática ou pode ser modificado para fornecer uma etiqueta de afinidade para ligar um domínio proteico específico. Por exemplo, os DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)imino ácido diacético)succinyl]^2- Ni²⁺) é frequentemente usado na formação de uma monocamada lipídica para ligar as proteínas com uma tag poli-histidina^20,21,22. Além disso, a toxina da cólera B pode ligar um pentasacarídeo particular do ganglioside GM1 em uma monocamada lipídica para estudos estruturais^23,24. Ancorando as proteínas nos grupos de cabeça lipídicos, a monocamada lipídica pode auxiliar na formação das matrizes 2D que são finas para estudos cristalográficos de alta resolução. A técnica de monocamadas lipídica tem sido usada na cristalografia eletrônica para estudos estruturais de proteínas, tais como streptavidin^2,25, anexo V²⁶, cólera toxina²⁷, E. coli gyrase B subunit²⁸, E. coli RNA polymerase^25,29,30, carboxysome shell proteins³¹ e as proteínas capsid do vírus ^{HIV-1 32 e Mol muroneyine leucemia 33}. Devido à estabilidade e propriedade química da monocamide lipídica, diferentes aplicações para preparação da amostra foram exploradas para a imagem crio-EM³⁴. No entanto, a otimização será necessária para a formação de matrizes proteicas.

Aqui, fornecemos extensos detalhes da preparação geral de monocamadas lipídicas para imagens crio-EM e algumas considerações que podem afetar a qualidade das monocamadas formadas.

Protocolo

1. Preparação do bloco de Teflon

1. Prepare o bloco de Teflon a partir de resina PTFE resistente a produtos químicos (politetrafluoroetileno). Faça furos no bloco usando uma broca geral seguida pelas dimensões rotuladas na Figura 1.

2. Preparação lipídica de monocamadas

NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 30-45 minutos

1. Preparação de estoque lipídida
   1. Prepare uma mistura lipídica de 0,01 mg/mL em 9:1 (v/v) clorofórmio/metanol usando 8,91 mL de clorofórmio, 0,99 mL de metanol e 0,01 mL de lipídios de 10 mg/mL.
2. Preparação da placa de Teflon
   1. Sonicate uma placa de Teflon em um banho de metanol por 5 minutos.
   2. Lave com água quente por 15 minutos.
   3. Enxágüe com água destilada.
   4. Seque a placa de Teflon em um dessecador por 30 minutos e mantenha-a sob vácuo quando não estiver em uso(Figura 1).

3. Formação de monocamide lipídica no reservatório tampão

NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 1,5 horas

1. Prepare recentemente uma mistura lipídica de 0,01 mg/mL em uma mistura de clorofórmio/metanol no dia do experimento.
2. Coloque um papel filtro Tipo-1 em uma placa de Petri e organize o bloco Teflon em cima do papel filtro.
3. Encha os poços da placa Teflon com 60 μL do buffer.
4. Adicione cuidadosamente a mistura lipídica em cima da superfície tampão gota a gota (idealmente 1 μL por gota) usando uma seringa Hamilton.
5. Molhe o papel filtro com água destilada para manter a umidade na placa de Petri.
6. Incubar em temperatura ambiente por 60 minutos. O clorofórmio deve evaporar, e uma monocamada de lipídio na superfície do tampão deve ser formada.

4. Aplicação de uma grade EM em uma monocamadas lipídica

NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 1,5 horas

1. Coloque suavemente uma grade EM revestida de carbono furada sem descarregamento de brilho, lado carbono para baixo, no topo de cada reservatório tampão.
2. Injete cuidadosamente proteínas na injeção lateral. Use concentrações proteicas finais no poço em torno de 1 μM de proteína como ponto de partida. Pré-otimizar a concentração de proteínas antes do experimento.
3. Incubar por 60 minutos em temperatura ambiente.
4. Injete suavemente aproximadamente 20-30 μL de tampão na porta de injeção lateral. Isso levantará a grade acima da superfície do bloco Teflon.
5. Pegue imediatamente a grade com uma pinça e levante-a verticalmente da gota.
6. Prepare amostras de monocamadas para coloração negativa ou imagen crio-TEM(Figura 2). Se as proteínas formarem uma matriz 2D, o espectro de energia de imagem ou o periodograma Fourier mostrarão intensidades de difração nas frequências espaciais com base na simetria cristalina. Se não forem mostrados pontos de difração no espectro de energia, é improvável que as proteínas formem um cristal 2D.
7. Verifique a cobertura da monocameira lipídica na grade EM usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Uma imagem de elétrons mais amplieada é útil para identificar a morfologia da monocamada coberta. Normalmente, o contraste de imagem da área coberta por monocamadas será ligeiramente menor do que o das áreas descobertas. Além disso, o espectro de energia de imagem 2D computado ajudará a identificar a localização do cristalino 2D.

Resultados

Uma monocamada lipídica depositada na grade EM pode ser visualizada sob um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) sem coloração. A presença da monocamadas pode ser reconhecida pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime no caminho do feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm menor contraste local do que as sem cobertura, uma vez que o feixe de elétrons através dos orifícios vazios não tem dispersão e mostra uma iluminação mais brilhante(...

Discussão

Uma monocamada lipídica é uma ferramenta poderosa que facilita o crescimento de grandes cristais 2D para estudos estruturais de macromoléculas biológicas. Para preparar com sucesso uma monocamada lipídica intacta na interface ar-água, é fortemente recomendável que os lipídios sejam preparados recentemente no dia do experimento, pois a oxidação da cadeia lipídica do acil pode levar à interrupção da embalagem na monocamada e afetar negativamente a formação de cristais resultante. Lipídios comprados em for...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996