JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Özet

Elektron kristalografisi yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için güçlü bir araçtır. Çözünür veya membran proteinleri gibi makromoleküller uygun koşullar altında yüksek dereceli iki boyutlu (2D) kristaller halinde yetiştirilebilir. Yetiştirilen 2D kristallerin kalitesi, 2D görüntü işleme yoluyla nihai yeniden yapılandırmanın çözümü için çok önemlidir. Yıllar içinde lipid monolayerler, periferik membran proteinlerinin yanı sıra çözünür proteinlerin 2D kristalizasyonunu teşvik etmek için destekleyici bir tabaka olarak kullanılmıştır. Bu yöntem, integral membran proteinlerinin 2D kristalizasyonuna da uygulanabilir, ancak tek katmanlıya bölünmeyi teşvik etmek için deterjan ve diyaliz koşullarını belirlemek için daha kapsamlı ampirik inceleme gerektirir. Hava-su arayüzünde, polar lipid kafa gruplarının sulu fazda nemlendirilmesi ve polar olmayan, akil zincirleri, kuyrukların havaya bölünmesi, yüzey gerilimini kırması ve su yüzeyini düzleştirmesi için bir lipid monolayer oluşur. Baş gruplarının yüklü doğası veya ayırt edici kimyasal moieties, çözeltideki proteinler için benzeşim sağlayarak 2D dizi oluşumu için bağlamayı teşvik eder. 2D dizili yeni oluşturulmuş bir monolayer, kristal diziyi kaldırmak ve desteklemek için kullanılan karbon kaplı bir bakır ızgara üzerinde bir elektron mikroskobuna (EM) kolayca aktarılabilir. Bu çalışmada kriyojenik elektron mikroskobik (kriyo-EM) görüntüleme için lipid monolayer metodolojisini anlatıyoruz.

Giriş

2D kristaller veya sarmal protein dizileri aracılığıyla elektron kırınımı, uygun durumlarda nanometre altı çözünürlükleri elde edebilir1,2,3. Özellikle ilgi çekici olan, 2D membran protein dizileri veya kristalleri yakın yerel ortamlarında yeniden inşa edilir1. Bir kristal, belirli uzamsal frekanslardaki yapısal faktörlerin yoğunluklarını artıran bir sinyal amplifikatörü görevi gördüğü için, elektron kristalografisi, tek parçacıklı kriyo-EM'ye göre küçük moleküller gibi yüksek çözünürlüklerde daha küçük boyutlu bir hedefin yoklasını sağlar. Elektron ışını, görüntü düzleminin dedektör4'tekaydedildiği yere bağlı olarak bir kırınım deseni veya kafes görüntüsü oluşturarak, sipariş edilen bir 2D protein dizisi tarafından dağıtılabilir. Dağınık yoğunluklar daha sonra kristalin 2D projeksiyon yapısını yeniden oluşturmak için çıkarılabilir ve işlenebilir. Elektronlar X ışınlarından daha büyük bir saçılma kesitlerine sahiptir ve saçılımı çoğunlukla elektronlar ve moleküldeki yüklü atomlar arasındaki Coulomb etkileşimini temel alan Rutherford modelini izler5. 2D membran kristallerinin kalınlıkları genellikle 100 nm'den azdır, numune6içinde dinamik saçılma olmadan elektron iletimi için uygundur. Elektron kristalografik çalışmalarının membran proteinlerinin ve lipid-protein etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü yapısal bilgilerini araştırmak için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Lipid monolayer, hava suyu arayüzünde yoğun olarak paketlenmiş fosfolipidlerden oluşan tek bir lipit tabakasıdır6Çözünür proteinler veya periferik membran proteinleri için 2D dizi oluşumuna yardımcı olabilir18. Lipitlerin yoğunluğuna ve yanal basıncına bağlı olarak, lipid molekülleri, havaya uzatılan akil zincirleri ve sulu çözelti 1,6,19'damaruz kalan hidrofilik kafa grupları ile hava-su arayüzünde sıralı bir2Ddizi oluşturabilir. Lipid kafa grubu elektrostatik etkileşim yoluyla proteinlerle etkileşime girebilir veya belirli bir protein etki alanını bağlamak için bir benzeşim etiketi sağlamak için değiştirilebilir. Örneğin, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentyl)iminodi süksinil]2- Ni2+) proteinleri poli-histidin etiketi20 , 21,22 ile bağlamak için genellikle bir lipid monolayeroluştururkenkullanılır. Ayrıca, kolera toksini B, ganglioside GM1'in belirli bir pentasaccharide'ini yapısal çalışmalar için bir lipid monolayerine bağlayabilir23,24. Lipid kafa gruplarına proteinleri tutturarak, lipid monolayer yüksek çözünürlüklü elektron kristalografik çalışmalar için ince olan 2D dizilerin oluşumuna yardımcı olabilir. Lipid monolayer tekniği elektron kristalografisinde proteinlerin yapısal etütlerinde kullanılmıştır, streptavidin2,25, annexin V26, kolera toksini27, E. coli gyrase B alt bira28, E. coli RNA polimeraz25,29,30, karboksiom kabuk proteinleri31 ve HIV-132 ve Moloney murine lösemi virüsünün kapsid proteinleri gibi 33. Lipid monolayer stabilitesi ve kimyasal özelliği nedeniyle, kriyo-EM görüntüleme için numune hazırlama için farklı uygulamalar araştırılmıştır34. Bununla birlikte, protein dizisi oluşumu için optimizasyona ihtiyaç duyulacaktır.

Burada, lipid monolayerlerin kriyo-EM görüntüleme için genel hazırlığı ve oluşan monolayerlerin kalitesini etkileyebilecek bazı hususlar hakkında kapsamlı ayrıntılar sunuyoruz.

Protokol

1. Teflon blok hazırlığı

  1. Teflon bloğunu kimyasallara dayanıklı PTFE (politetrafloroetilen) reçinesinden hazırlayın. Genel bir matkap ve ardından Şekil 1'deetiketlenen boyutları kullanarak blokta delikler açın.

2. Monolayer lipid hazırlama

NOT: Tahmini çalışma süresi: 30-45 dakika

  1. Lipid stok hazırlığı
    1. 8,91 mL kloroform, 0,99 mL metanol ve 10 mg/mL lipitlerin 0,01 mL'lik karışımını 9:1 (v/v) kloroform/metanol olarak hazırlayın.
  2. Teflon plaka hazırlama
    1. Metanol banyosunda 5 dakika boyunca bir Teflon plakası sonicate.
    2. 15 dakika sıcak suyla yıkayın.
    3. Damıtılmış su ile durulayın.
    4. Teflon plakasını bir kurutucuda 30 dakika kurutun ve kullanılmadığında vakum altında tutun (Şekil 1).

3. Tampon rezervuar üzerinde lipid monolayer oluşumu

NOT: Tahmini çalışma süresi: 1,5 saat

  1. Deney günü 9:1 kloroform/metanol karışımında 0,01 mg/mL'lik bir lipit karışımını taze olarak hazırlayın.
  2. Petri kabına Tip-1 filtre kağıdı yerleştirin ve Teflon bloğunu filtre kağıdının üzerine yerleştirin.
  3. Teflon plakanın kuyularını tamponun 60 μL'si ile doldurun.
  4. Bir Hamilton şırınnası kullanarak tampon yüzeyin üzerine damla damla (düşme başına ideal olarak 1 μL) lipid karışımını dikkatlice ekleyin.
  5. Petri kabındaki nemi korumak için filtre kağıdını damıtılmış suyla ıslatın.
  6. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatır. Kloroform buharlaşmalı ve tamponun yüzeyinde bir tek katmanlı lipit oluşturulmalıdır.

4. Lipid monolayer üzerine EM ızgarası uygulanması

NOT: Tahmini çalışma süresi: 1,5 saat

  1. Her tampon rezervuarının üstüne, parlama deşarjı yapmadan, karbon tarafı aşağı doğru delikli bir karbon kaplı EM ızgarası yerleştirin.
  2. Proteinleri dikkatlice yan enjeksiyona iyice enjekte edin. Başlangıç noktası olarak yaklaşık 1 μM protein kuyusunda nihai protein konsantrasyonlarını kullanın. Deneyden önce protein konsantrasyonu önceden optimize edin.
  3. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatır.
  4. Yan enjeksiyon portuna yaklaşık 20-30 μL tamponu hafifçe enjekte edin. Bu, ızgarayı Teflon bloğunun yüzeyinin üzerine yükseltecektir.
  5. Izgarayı hemen bir cımbızla alın ve damlacığı dikey olarak kaldırın.
  6. Negatif boyama veya kriyo-TEM görüntüleme için monolayer örnekleri hazırlayın (Şekil 2). Proteinler bir 2D dizi oluşturursa, görüntü güç spektrumu veya Fourier periodogramı kristal simetriye dayalı mekansal frekanslarda kırınım yoğunlukları gösterecektir. Güç spektrumunda kırınım lekesi gösterilmezse, proteinlerin 2D kristal oluşturması olası değildir.
  7. İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak EM ızgarası üzerindeki lipid monolayer kapsamını kontrol edin. Daha düşük büyütülmüş bir elektron görüntüsü, kapsanan monolayer'ın morfolojisini tanımlamak için yararlıdır. Genellikle, monolayer kaplı alanın görüntü kontrastı, ortaya çıkarılan alanlardan biraz daha düşük olacaktır. Buna ek olarak, hesaplanan 2D görüntü güç spektrumu, 2D kristalin konumunu belirlemeye yardımcı olacaktır.

Sonuçlar

EM ızgarasına biriken bir lipid monolayer, lekelenmeden bir iletim elektron mikroskobu (TEM) altında görselleştirilebilir. Monolayer varlığı, kiriş yolunda herhangi bir örnek olmadan alandan kontrast farkı ile tanınabilir. Lipid monolayer kapsama alanına sahip alanlar, kapsama alanı olmayanlara göre daha düşük yerel kontrasta sahiptir, çünkü boş deliklerden geçen elektron ışını saçılmaz ve daha parlak bir aydınlatma gösterir (Şekil 3).

Tartışmalar

Lipid monolayer, biyolojik makromoleküllerin yapısal çalışmaları için büyük 2D kristallerin büyümesini kolaylaştıran güçlü bir araçtır. Hava-su arayüzünde bozulmamış bir lipid monolayerini başarıyla hazırlamak için, lipitlerin deney günü taze olarak hazırlanması şiddetle tavsiye edilir, çünkü lipid akil zincirinin oksitlenmesi monolayerde paketleme bozulmasına yol açabilir ve ortaya çıkan kristal oluşumunu olumsuz yönde etkileyebilir. Toz halinde satın alınan lipitler, fosfolipid...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu makalenin hazırlanması, ABD Ordu Araştırma Ofisi (W911NF2010321) ve Arizona Eyalet Üniversitesi başlangıç fonları tarafından P.-L.C kısmen desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipetsFisher Scientific03-448-21
ChloroformSigma-AldrichC2432
Desiccator vacuumSouthern Labware55207
EM gridsElectron Microscopy SciencesCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paperGE Healthcare Life Sciences1001-090Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipetsFisher Scientific13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)Hamilton Company80465
Hamilton syringe (250 µL)Hamilton Company81165
Hamilton syringe (5 µL)Hamilton Company87930
Hamilton syringe (500 µL)Hamilton Company203080
MethanolSigma-AldrichM1775-1GA
Petri dishVWR25384-342100 mm × 15 mm
Teflon blockGrainger55UK0560 µL wells with side injection ports, manually made
TweezersElectron Microscopy Sciences78325Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleanerVWR97043-996

Referanslar

  1. Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
  2. Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
  3. Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
  4. Wang, H. -. W., Wang, J. -. W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
  5. Williams, D. B., Carter, C. B. . Transmission electron microscopy. , (2016).
  6. Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
  7. Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
  8. Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
  9. Hite, R. K., Chiu, P. -. L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
  10. Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
  11. Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
  12. Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
  13. Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
  14. Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
  15. Chiu, P. -. L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
  16. Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
  17. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
  18. Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
  19. Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
  20. Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
  21. Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
  22. Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
  23. Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
  24. Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
  25. Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
  26. Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
  27. Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
  28. Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
  29. Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
  30. Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
  31. Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
  32. Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
  33. Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
  34. Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
  35. Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
  36. Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
  37. Dietrich, J., nien-Bryan, C. . Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , (2005).
  38. Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
  39. De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -. M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
  40. Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
  41. Rémigy, H. -. W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
  42. Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
  43. Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
  44. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  45. Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır