使用脂质单层方法进行电子晶体学研究的样品制备

摘要

几十年来，脂质单层一直被用作形成二维（2D）蛋白质晶体的基础，用于结构研究。它们在气水界面上稳定，可作为电子成像的薄支撑材料。在这里，我们介绍了为生物研究准备脂质单层的行之有效的步骤。

摘要

电子晶体学是高分辨率结构测定的有力工具。可溶性或膜蛋白等大分子可以在有利条件下生长成高有序的二维（2D）晶体。已种植的 2D 晶体的质量对于通过 2D 图像处理最终重建的分辨率至关重要。多年来，脂质单层已被用作支撑层，以培养外周膜蛋白和可溶性蛋白的二元结晶。该方法还可用于整体膜蛋白的二元结晶，但需要更广泛的经验调查，以确定洗涤剂和透析条件，以促进分隔到单层。在空气-水接口形成脂质单层，使极地脂质头组在水分相中保持水分，非极性乙酰链条、尾部分裂到空气中，打破表面张力，使水面变平。头部组的带电性质或独特的化学形态为溶液中的蛋白质提供了亲和力，促进二维阵列形成的结合。带有 2D 阵列的新形成的单层器可以很容易地转移到碳涂层铜网格上的电子显微镜 （EM）中，用于提升和支持晶体阵列。在这项研究中，我们描述了低温电子微观（低温-EM）成像的脂质单层方法。

引言

通过2D晶体或蛋白质螺旋阵列的电子衍射，在有利的情况下可以达到亚纳米分辨率^1，2，3。特别感兴趣的是重建的二元膜蛋白质阵列或晶体在其近本土环境^1。由于晶体充当信号放大器，可增强特定空间频率下结构因子的强度，因此电子晶体学允许探测比单粒子低温-EM尺寸较小的目标，如小分子。电子束可以通过有序的二维蛋白质阵列衍射，生成衍射模式或晶格图像，具体取决于图像平面记录在探测器⁴上的位置。然后，可以提取和处理衍射强度，以重建晶体的二维投影结构。电子的散射横截面比X射线大，其散射主要遵循卢瑟福模型，该模型基于电子与分子⁵中带电原子之间的库隆布相互作用。2D膜晶体的厚度通常小于100纳米，适合在标本⁶内不发生动态散射的电子传输。电子晶体学研究已被证明是探测膜蛋白和脂蛋白相互作用^{7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17}的高分辨率结构信息的有力工具。

脂质单层是一个单脂层，由空气-水接口⁶密集包装的磷脂组成，可协助可溶性蛋白质或外周膜蛋白¹⁸的二元阵列形成。根据脂质的密度及其横向压力，脂质分子可以在空气-水接口上形成有序的二维阵列，其乙酰链延伸到空气中，亲水性头组暴露在水溶液^{1，6，19。}脂质头组可以通过静电相互作用与蛋白质相互作用，也可以进行修改，以提供亲和力标记来结合特定的蛋白质域。例如， DOGS-NTA-Ni （1，2-二恶英-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-卡盒式）氨基酸）苏奇尼^）2-尼^2+）常用于形成脂质单层，将蛋白质与多组蛋白标签^20，21，22结合。此外，霍乱毒素B可以结合一个特殊的五氯苯甲酸GM1在脂质单层结构研究^23，24。通过将蛋白质固定在脂质头组上，脂质单层可以协助形成用于高分辨率电子晶体学研究的薄的 2D 阵列。脂质单层技术已用于蛋白质结构研究的电子晶体学， 如链球菌^素2，25，附件素^V26，霍乱毒素^27，大肠杆菌B亚单位^28，大肠杆菌RNA聚合酶25，29，30，卡盒体壳蛋白³¹和HIV-1³²和莫洛尼穆林白血病病毒^{的辣椒蛋白33.}由于脂质单层的稳定性和化学特性，已探索了冷冻-EM成像³⁴的样品制备应用。但是，蛋白质阵列的形成需要优化。

在这里，我们提供了关于脂质单层器用于低温-EM成像的一般准备的广泛细节，以及一些可能影响已形成单层质量的考虑。

研究方案

1. 特氟隆块准备

1. 从耐化学PTFE（聚氟乙烯）树脂中制备特氟龙块。使用一般钻头在块上打洞，然后用 图1中标出的尺寸。

2. 单层脂质制剂

注:估计运行时间:30-45分钟

1. 脂质库存准备
   1. 使用 8.91 mL 氯仿/甲醇、0.99 mL 甲醇和 0.01 mL 10 毫克/mL 脂质，在 9:1 （v/v） 氯仿/甲醇中准备 0.01 毫克/mL 脂质混合物。
2. 特氟隆板准备
   1. 在甲醇浴中将特氟隆板声波化 5 分钟。
   2. 用热水洗15分钟。
   3. 用蒸馏水冲洗。
   4. 在干燥器中干燥特氟隆板30分钟，不使用时保持真空（图1）。

3. 缓冲水库脂质单层的形成

注:估计运行时间:1.5 小时

1. 在实验当天，在氯仿/甲醇的9:1混合物中，新鲜制备0.01毫克/mL的脂质混合物。
2. 将 1 型滤纸放入培养皿中，并将特氟隆块放在滤纸上。
3. 将特氟隆板的井填充 60 微升的缓冲器。
4. 使用汉密尔顿注射器在缓冲表面逐滴（理想情况下每滴 1 μL）上仔细添加脂质混合物。
5. 用蒸馏水湿滤纸，以保持培养皿中的湿度。
6. 在室温下孵育60分钟。氯仿应蒸发，并形成缓冲器表面的单层脂质。

4. 在脂质单层上应用 EM 网格

注:估计运行时间:1.5 小时

1. 轻轻地将一个孔涂有碳涂层的 EM 网格放置，而无需发光、碳侧向下放置到每个缓冲储层的顶部。
2. 小心地将蛋白质注射到侧注射良好。以1μM左右的井中最终蛋白质浓度为起点。实验前预先优化蛋白质浓度。
3. 在室温下孵育60分钟。
4. 轻轻地将大约 20-30 μL 的缓冲液注入侧喷口。这将提高特氟隆块表面上方的网格。
5. 立即用钳子拿起网格，并垂直将其从水滴中抬起。
6. 准备单层样品进行阴性染色或低温-TEM成像（图2）。如果蛋白质形成二维阵列，图像功率谱或傅立中周期图将显示基于晶体对称性的空间频率的衍射强度。如果功率谱中未显示衍射点，则蛋白质不太可能形成二维晶体。
7. 使用传输电子显微镜 （TEM） 检查 EM 电网上脂质单层的覆盖范围。低放大电子图像有助于识别覆盖单层的形态。通常，单层覆盖区域的图像对比将略低于未覆盖区域。此外，计算的二D图像功率谱将有助于识别 2D 晶体的位置。

结果

沉积在 EM 网格上的脂质单层可以在传输电子显微镜 （TEM） 下可视化，而不会弄脏。单层存在可以通过与光束路径中没有任何标本的区域对比差来识别。与无覆盖区域相比，脂质单层覆盖区域的局部对比度较低，因为穿过空孔的电子束没有散射，显示更亮的照明（图3）。

要筛选 2D 单层结晶的条件，使用负污渍 EM 或低温 EM 成像调查标本的图像。当舞台?...

讨论

脂质单层是促进大型二元晶体生长的强大工具，用于生物大分子的结构研究。为了在空气-水接口成功准备一个完整的脂质单层，强烈建议在实验当天新鲜制备脂质，因为脂质乙酰链的氧化可能导致单层包装中断，并对由此产生的晶体形成产生不利影响。购买的粉末形式的脂质应使用氯仿的混合物溶解:甲醇溶剂，这是通常用来溶解磷脂^35。氯仿:甲醇溶剂可以预制并储存在密封的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996