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요약

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

초록

전자 결정학은 고해상도 구조 측정을 위한 강력한 도구입니다. 수용성 또는 막 단백질과 같은 거대 분자는 유리한 조건하에서 고도로 정렬된 2차원(2D) 결정으로 재배될 수 있다. 2D 이미지 처리를 통해 최종 재구성의 해상도에 성장된 2D 결정의 품질은 매우 중요합니다. 수년에 걸쳐, 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위해 지원 층으로 사용되었습니다. 이 방법은 또한 일체형 막 단백질의 2D 결정화에 적용될 수 있지만 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다. 지질 단층은 극지 지질 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지하고 비 극성, 아실 체인, 꼬리 분할을 공기로 분할하여 표면 장력을 깨고 수면을 평평하게 하는 공기-물 인터페이스에서 형성됩니다. 헤드 그룹의 충전 된 자연 또는 독특한 화학 적 moieties는 용액의 단백질에 대한 친화력을 제공하여 2D 어레이 형성에 대한 결합을 촉진합니다. 2D 어레이를 가진 새로 형성된 단층은 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 구리 그리드에서 전자 현미경(EM)으로 쉽게 이송될 수 있다. 이 작품에서, 우리는 극저온 전자 현미경 (극저온-EM) 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론을 기술합니다.

서문

2D 결정 또는 단백질의 헬릭 어레이를 통한 전자 회절은 유리한 경우1,2,3에서하위 나노미터 분해능을 달성할 수 있다. 특히 관심은 근원 환경1에서2D 멤브레인 단백질 어레이 또는 결정으로 재구성된다. 결정은 특정 공간 주파수에서 구조 적 인자의 강도를 향상시키는 신호 증폭기역할을하기 때문에, 전자 결정학은 단일 입자 저온-EM에 대한 것보다 작은 분자와 같은 고해상도에서 더 작은 크기로 대상을 프로빙 할 수 있습니다. 전자 빔은 주문된 2D 단백질 배열에 의해 확산될 수 있으며, 검출기4에이미지 평면이 기록되는 위치에 따라 회절 패턴 또는 격자 이미지를 생성한다. 그 때 디질화 된 강도는 추출 및 크리스탈의 2D 프로젝션 구조를 재구성하기 위해 처리 될 수있다. 전자는 엑스레이보다 더 큰 산란 단면을 가지며, 그 산란은 주로 분자5에서전자와 충전된 원자 사이의 쿨롬 상호 작용을 기반으로 하는 러더포드 모델을 따릅니다. 2D 멤브레인 결정의 두께는 일반적으로 100 nm 미만이며, 표본6내에서 발생하는 동적 산란없이 전자 전송에 적합합니다. 전자 결정학적 연구는 멤브레인 단백질및 지질 단백질 상호작용7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17의고해상도 구조 정보를 조사하는 강력한 도구로 나타났다.

지질 단층은 공기-물 인터페이스6에서조밀하게 포장된 인지질으로 구성된 단일 지질 층으로, 용해성 단백질 또는 말초막단백질(18)에대한 2D 어레이 형성을 지원할 수 있다. 지질의 밀도와 측면 압력에 따라 지질 분자는 수성 용액1,6,19에노출된 공기 및 친수성 헤드그룹에 확장된 아실 사슬을 사용하여 공기-물 인터페이스에 정렬된 2D 어레이를 형성할 수 있다. 지질 헤드그룹은 정전기 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있거나 특정 단백질 도메인을 결합하기 위한 친화성 태그를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카박스티펜틸)이 iminodiacetic acid]]2-Ni 2+)는폴리-히티딘 태그20,21로단백질을 묶는 지질 단층층을 형성하는 데 자주 사용된다. 또한, 콜레라 독소 B는 구조적 연구를 위한 지질 단층에서 간질산 GM1의 특정 펜타카라이드를 결합할 수있다(23,24). 지질 헤드그룹에 단백질을 고정함으로써 지질 단층은 고해상도 전자 결정연구를 위해 얇은 2D 어레이의 형성을 지원할 수 있습니다. 지질 단층 기술은 단백질의 구조 연구를 위한 전자 결정학에서 사용되었습니다, 예를 들어 스트렙타비딘2,25,부속서 V26,콜레라 독소27, 대장균 RNA 폴리머라제25,29,30,카박스형 쉘 단백질31 및 HIV-132 및 몰론 황두균 바이러스의 캡시드 단백질 33.지질 단층의 안정성 과 화학적 특성으로 인해, 시료 준비를 위한 다른 응용 분야는 극저온-EM이미징(34)에대해 탐구되었다. 그러나, 단백질 어레이 형성을 위해 최적화가 필요합니다.

여기에서, 우리는 극저온-EM 화상 진찰을 위한 지질 단층의 일반적인 준비의 광대한 세부 사항 및 형성된 단층의 질에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 고려사항을 제공합니다.

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프로토콜

1. 테플론 블록 준비

  1. 화학성 PTFE(폴리테트라플루오로로틸렌) 수지로부터 테플론 블록을 준비합니다. 일반 드릴을 사용하여 블록에 구멍을 만들고 그림 1에표시된 치수를 만듭니다.

2. 모노레이어 지질 제제

참고: 예상 작동 시간: 30-45분

  1. 지질 재고 준비
    1. 9:1 (v/v) 클로로폼/메탄올에 0.01 mg/mL 지질 혼합물을 준비하여 8.91mL의 클로로폼, 메탄올 0.99mL, 10 mg/mL 지질의 0.01mL를 사용한다.
  2. 테플론 플레이트 준비
    1. 메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다.
    2. 뜨거운 물로 15분간 씻으시면 됩니다.
    3. 증류수로 헹구는 다.
    4. 데프론 플레이트를 건조기에서 30분 간 건조시키고 사용하지 않을 때진공 상태로 유지하십시오(그림1).

3. 완충 저수지에 지질 단층의 형성

참고: 예상 작동 시간: 1.5시간

  1. 실험 당일 클로로폼/메탄올의 9:1 혼합물에서 0.01 mg/mL의 지질 혼합물을 신선하게 준비한다.
  2. 페트리 접시에 Type-1 필터 용지를 놓고 필터 용지 위에 테플론 블록을 정렬합니다.
  3. 테플론 플레이트의 우물을 버퍼의 60 μL로 채웁니다.
  4. 조심스럽게 해밀턴 주사기를 사용하여 드롭 (이상적으로 드롭 당 1 μL)에 의해 드롭 버퍼 표면 드롭의 상단에 지질 혼합물을 추가합니다.
  5. 페트리 접시에 습도를 유지하기 위해 증류수로 필터 용지를 적시십시오.
  6. 실온에서 60분 동안 배양하세요. 클로로폼은 증발해야 하며, 완충제 표면에 지질의 단층이 형성되어야 한다.

4. 지질 단층상에 EM 그리드 의 적용

참고: 예상 작동 시간: 1.5시간

  1. 각 버퍼 저장소의 상단에 빛을 배출하지 않고, 탄소 면을 아래로 가볍게 놓습니다.
  2. 조심스럽게 측면 주입에 단백질을 주입. 단백질의 약 1 μM 주위에 있는 마지막 단백질 농도를 출발점으로 사용하십시오. 실험 전에 단백질 농도를 미리 최적화합니다.
  3. 실온에서 60분 동안 배양하세요.
  4. 측면 사출 포트에 약 20-30 μL의 버퍼를 부드럽게 주입합니다. 이렇게 하면 테플론 블록의 표면 위에 그리드가 올립니다.
  5. 즉시 트위저로 그리드를 들고 물방울에서 수직으로 들어 올립니다.
  6. 음극 염색 또는 저온-TEM 이미징을 위한 단층 샘플을준비(그림 2). 단백질이 2D 어레이를 형성하는 경우, 이미지 파워 스펙트럼 또는 Fourier 주기도는 결정 대칭에 기초하여 공간 주파수에서 회절 강도를 표시합니다. 전력 스펙트럼에 회절 반점이 표시되지 않으면 단백질은 2D 결정을 형성할 가능성이 낮습니다.
  7. 전염 전자 현미경(TEM)을 사용하여 EM 그리드에서 지질 단층의 커버리지를 확인한다. 낮은 확대 전자 이미지는 덮여 단층의 형태를 식별하는 데 도움이됩니다. 일반적으로 단층으로 덮인 영역의 이미지 대비는 발견된 영역보다 약간 낮습니다. 또한, 계산된 2D 이미지 파워 스펙트럼은 2D 결정선의 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다.

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결과

EM 그리드에 증착된 지질 단층은 염색없이 전송 전자 현미경(TEM)으로 시각화될 수 있다. 단층의 존재는 빔 경로에 시편이 없는 영역과 의대조 차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 커버리지가 있는 영역은 비어 있는 구멍을 통해 전자 빔이 산란되지 않고 더 밝은조명(도 3)을나타내기 때문에 커버리지가 없는 영역보다 국부적 대비가 낮습니다.

2D 단층 결정?...

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토론

지질 단층은 생물학적 거대 분자의 구조 연구를 위한 대형 2D 결정의 성장을 용이하게 하는 강력한 도구입니다. 공기-물 인터페이스에서 온전한 지질 단층층을 성공적으로 준비하기 위해 지질 아실 체인의 산화가 단층의 포장 중단으로 이어질 수 있고 그로 인한 결정 형성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 당일에 지질을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 분말 형태로 구입한 지질은 일반적?...

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공개

저자는 선언할 이해상충이 없습니다.

감사의 말

이 원고의 준비는 부분적으로 P.-L.C에 미 육군 연구 실 (W911NF2010321)과 애리조나 주립 대학 시작 기금에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipetsFisher Scientific03-448-21
ChloroformSigma-AldrichC2432
Desiccator vacuumSouthern Labware55207
EM gridsElectron Microscopy SciencesCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paperGE Healthcare Life Sciences1001-090Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipetsFisher Scientific13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)Hamilton Company80465
Hamilton syringe (250 µL)Hamilton Company81165
Hamilton syringe (5 µL)Hamilton Company87930
Hamilton syringe (500 µL)Hamilton Company203080
MethanolSigma-AldrichM1775-1GA
Petri dishVWR25384-342100 mm × 15 mm
Teflon blockGrainger55UK0560 µL wells with side injection ports, manually made
TweezersElectron Microscopy Sciences78325Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleanerVWR97043-996

참고문헌

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