التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

Summary

اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. تعد الأنسجة وفحص انهيار الحاجز الدموي والشبكية وتصوير الأوعية الفلورية تقنيات قيمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية ، والتي يمكن أن تعزز الفحص الفعال للأدوية ضد اعتلال الشبكية السكري.

Abstract

يغير مرض العين في الجزء الخلفي مثل اعتلال الشبكية السكري فسيولوجيا الشبكية. يتميز اعتلال الشبكية السكري بانفصال الشبكية ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي (BRB) ، وتكوين الأوعية الدموية في الشبكية. نموذج الفئران في الجسم الحي هو أداة تجريبية قيمة لدراسة التغيرات في بنية ووظيفة شبكية العين. نقترح ثلاث تقنيات تجريبية مختلفة في نموذج الفئران لتحديد التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية ، والأوعية الدموية الشبكية ، و BRB المعرضة للخطر. يستخدم علم أنسجة الشبكية لدراسة مورفولوجيا خلايا الشبكية المختلفة. أيضا ، يتم إجراء القياس الكمي عن طريق عدد خلايا الشبكية وقياس سمك طبقات الشبكية المختلفة. يستخدم اختبار انهيار BRB لتحديد تسرب البروتينات خارج العين من البلازما إلى الأنسجة الزجاجية بسبب انهيار BRB. يستخدم تصوير الأوعية الدموية الفلوري لدراسة تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية عن طريق تصور الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran.

Introduction

اعتلال الشبكية السكري (DR) هو واحد من أكثر المضاعفات الثانوية تعقيدا لمرض السكري. كما أنه السبب الرئيسي للعمى الذي يمكن الوقاية منه بين السكان في سن العمل في جميع أنحاء العالم. في تحليل تلوي حديث ل 32.4 مليون شخص كفيف ، كان 830،000 شخص (2.6٪) مكفوفين بسبب ^DR1. احتلت نسبة فقدان البصر المنسوبة إلى مرض السكري المرتبة السابعة في عام 2015 بنسبة 1.06٪ (0.15-2.38) على مستوى ^{العالم2,3}.

يتم تشخيص اعتلال الشبكية السكري عن طريق تشوهات الأوعية الدموية في أنسجة العين الخلفية. سريريا ، ينقسم إلى مرحلتين - DR غير التكاثري (NPDR) و DR التكاثري (PDR) ، بناء على الأوعية الدموية في شبكية العين. يعتبر ارتفاع السكر في الدم المنظم القوي ل DR لأنه ينطوي على العديد من المسارات المشاركة في التنكس ^{العصبي4,5} والالتهاب ^6,7 والأوعية الدموية ^{الدقيقة8} في شبكية العين. تشمل المضاعفات الأيضية المتعددة الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم تراكم المنتجات النهائية المتقدمة للغليكاتيون (AGEs) ، ومسار البوليول ، ومسار الهيكسوسامين ، ومسار بروتين كيناز-سي. هذه المسارات مسؤولة عن تكاثر الخلايا (الخلايا البطانية) ، والهجرة (pericytes) ، وموت الخلايا المبرمج (خلايا الشبكية العصبية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا البطانية) بناء على مراحل مختلفة من اعتلال الشبكية السكري. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات الأيضية إلى تغيرات فسيولوجية مثل انفصال الشبكية ، وفقدان خلايا الشبكية ، وانهيار حاجز الدم والشبكية (BRB) ، وتمدد الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية ^{الدموية9}.

مرض السكري من النوع 1 الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) هو ممارسة راسخة ومقبولة جيدا في الفئران لتقييم التسبب في مرض السكري ومضاعفاته. ترجع الآثار السكرية ل STZ إلى التدمير الانتقائي لخلايا جزيرة البنكرياس β ¹⁰. ونتيجة لذلك ، ستخضع الحيوانات لنقص الأنسولين ، وارتفاع السكر في الدم ، و polydipsia ، و polyuria ، وكلها خصائص لمرض السكري من النوع 1 ^{البشري11}. بالنسبة لتحريض مرض السكري الحاد ، يتم إعطاء STZ عند 40-65 مجم / كجم من وزن الجسم عن طريق الوريد أو داخل الصفاق خلال مرحلة البلوغ. بعد حوالي 72 ساعة ، تقدم هذه الحيوانات مستويات الجلوكوز في الدم أكبر من 250 ملغ / ديسيلتر ^10,12.

لفهم التغيرات الفسيولوجية في شبكية العين بسبب التنكس العصبي والالتهابات وتكوين الأوعية الدموية ، يجب تحسين التقنيات المختلفة في النماذج الحيوانية التجريبية. يمكن دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في خلايا الشبكية وأوعية الشبكية من خلال تقنيات مختلفة مثل علم الأنسجة وفحص انهيار BRB وتصوير الأوعية الفلورية.

يتضمن علم الأنسجة دراسة تشريح الخلايا والأنسجة والأعضاء على المستوى المجهري. وهو ينشئ علاقة بين بنية ووظيفة الخلايا / الأنسجة. يتم تنفيذ عدة خطوات لتصور وتحديد التغيرات المجهرية في بنية الأنسجة ، وبالتالي مقارنة النظراء الأصحاء والمريضين ¹³. وبالتالي ، من الضروري توحيد كل خطوة من خطوات علم الأنسجة بدقة. الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها علم أنسجة الشبكية هي تثبيت العينة ، وتقليم العينة ، والجفاف ، وإزالة ، والتشريب بالبارافين ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتلطيخ (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين) ^13،14.

في شبكية العين السليمة ، يتم التحكم في نقل الجزيئات عبر شبكية العين بواسطة BRB ، الذي يتكون من الخلايا البطانية والخلايا المحيطة على الجانب الداخلي ، والخلايا الظهارية الصباغية الشبكية على الجانب الخارجي. ومع ذلك ، تبدأ الخلايا البطانية BRB الداخلية والخلايا المحيطة في التدهور أثناء الحالة المريضة ، كما أن BRB معرض للخطر ^أيضا15. بسبب هذا الانهيار BRB ، تتسرب العديد من جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية ¹⁶. مع تقدم المرض ، تتسرب العديد من جزيئات البروتين الأخرى (الوزن الجزيئي المنخفض والمرتفع) أيضا إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية بسبب اضطراب التوازن ¹⁷. يؤدي إلى مضاعفات أخرى مختلفة وفي نهاية المطاف وذمة بقعية وعمى. وبالتالي ، فإن تحديد مستويات البروتين في الجسم الزجاجي ومقارنة الحالات الصحية والسكري يضر بمقاييس BRB.

تصوير الأوعية الفلورية هو تقنية تستخدم لدراسة الدورة الدموية للشبكية والمشيمية باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم استخدامه لتصور الأوعية الدموية في شبكية العين والمشيمية عن طريق حقن صبغة الفلوريسين عبر الوريد أو حقن ^القلب18. بمجرد حقن الصبغة ، تصل أولا إلى شرايين الشبكية ، تليها أوردة الشبكية. عادة ما يتم الانتهاء من هذا الدوران للصبغة في غضون 5 إلى 10 دقائق من حقن ^{الصبغة19}. إنها تقنية مهمة لتشخيص مختلف أمراض العين في الجزء الخلفي، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري والأوعية الدموية الجديدة ^{المشيمية20}. يساعد على اكتشاف التغيرات الرئيسية والثانوية في الأوعية الدموية في الحالات الطبيعية والمريضة.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول جميع إرشادات رعاية الحيوان التي تقدمها لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد.

1. أنسجة الشبكية

1. استئصال العين وتثبيتها
   1. القتل الرحيم لفأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغ / كجم) عن طريق الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق.
   2. استئصال العين عن طريق إجراء شقوق باستخدام شفرة مشرط على المناطق الأنفية والصدغية من العين. ثم قطع على طول حوافها باستخدام ملقط ومقص صغير لإزالة العين من المقبس المداري.
      ملاحظة: قبل التضحية بالفئران ، حافظ على الحلول المثبتة جاهزة.
      تحذير: الفورمالديهايد يهيج الجلد والعين والأنف والجهاز التنفسي. يمكن أن يسبب أيضا السرطان لأنه محسس قوي للجلد. ارتد القفازات وتعامل معها تحت غطاء ^{المحرك21}.
   3. اغسل العين جيدا ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري لإزالة الدم. إزالة الدهون الزائدة المحيطة بالعين لسهولة اختراق المحلول المثبت.
   4. ضع العين على الفور في 5 مل من محلول التثبيت بمساعدة الملقط ، وتأكد من أنها ليست عالقة على جدران القوارير الزجاجية. حرك بلطف لبضع ثوان واستبدل الغطاء بوضع العلامات المناسبة. احتضان العين في محلول مثبت لمدة 24 إلى 48 ساعة في الظروف المظلمة في درجة حرارة الغرفة.
2. تقليم الأنسجة
   1. بعد التثبيت ، قم بإزالة العين من المحلول المثبت ، واغسلها ب 10 مل من PBS ، وضعها في طبق بتري يحتوي على 10 مل من PBS المبرد عند 4 درجات مئوية.
   2. باستخدام ملقط صغير ، امسك العين بالعصب البصري واصنع في pars plana بمساعدة مقص صغير. قطع من خلال كامل هامش القرنية لفصل الكوب الأمامي من العين. باستخدام الملقط ، اختر العدسة بلطف ، وتخلص منها ، واقطع العصب البصري.
   3. باستخدام مقص صغير منحني ، قم بعمل قسم طولي من كأس العين الخلفي ، يمر عبر القرص البصري ويقسمه إلى نصفين. ضعه في قاعدة الكاسيت وأغلق الغطاء بشكل صحيح دون أي إزعاج للأنسجة. قم بتسمية الكاسيت باسم عينة الأنسجة وتاريخها.
3. الجفاف وإزالة وتشريب البارافين للأنسجة
   1. تجفيف الأنسجة المشذبة عن طريق النقل التدريجي في 80 مل من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 90 ٪ ، و 100 ٪ من الإيثانول. أثناء نقل الكاسيت من تركيز إلى آخر ، تأكد من ربتها على ورق نظيف لتقليل التلوث.
      ملاحظة: اسمح للمنديل بالوقوف في كل عملية نقل لمدة 30 دقيقة (مرتين). إجمالي الوقت المستغرق لهذه الخطوة هو حوالي 4 ساعات.
   2. عند الجفاف ، انقل الكاسيت إلى 80 مل من الزيلين لمدة 30 دقيقة (مرتين) لاستبدال الإيثانول بالزيلين.
      ملاحظة: بعد الحضانة مع الزيلين ، يصبح النسيج شفافا.
      تحذير: الزيلين هو مركب عطري مع حلقة البنزين. يهيج العين والأغشية المخاطية وقد يسبب أيضا الاكتئاب.
   3. أخيرا ، قم بتشريب الأنسجة بالبارافين المسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية ليحل محل الزيلين في الأنسجة. ضعي الكاسيت عدة مرات على المناديل الورقية لتقليل محتوى الزيلين وضعيه في 200 مل من البارافين (السائل عند 60 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة (1 ساعة × 2).
      تحذير: تجنب استنشاق البارافين المذاب ، لأنه ينتج قطرات دهنية صغيرة قد تسبب عدم الراحة في الجهاز التنفسي.
4. تضمين البارافين
   1. قم بتشغيل آلة تضمين البارافين قبل 1 ساعة على الأقل من الاستخدام لإذابة البارافين ولكي تصل المحطات إلى درجات الحرارة المطلوبة. املأ قالبا فولاذيا بشمع البارافين المذاب عن طريق وضعه على سطح ساخن ، ثم قم بإزالة كاسيت واحد في كل مرة من حاوية البارافين.
   2. انقل القالب الفولاذي من سطح ساخن إلى سطح بارد (4 درجات مئوية). عند هذه النقطة ، سيبدأ الشمع الموجود في القالب في التصلب. قبل أن يتصلب تماما ، ضع الأنسجة في الشمع بمساعدة الملقط وقم بتوجيه الأنسجة بحيث يواجه جزء القرص البصري من الكوب الخلفي قاعدة القالب.
      ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة لا تتحرك والحفاظ على اتجاهها المطلوب. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فضع القالب مرة أخرى على سطح العمل الدافئ حتى تسييل البارافين بالكامل ، ثم ابدأ مرة أخرى بالخطوة 1.4.2.
   3. عندما يبدأ الشمع في القالب في التصلب ، ضع قاعدة الكاسيت على الفور فوق القالب. املأ القالب بعناية بالبارافين فوق الحافة العلوية للكاسيت وانقله ببطء إلى سطح بارد (بالقرب من -20 درجة مئوية) للتصلب السريع. حتى يتم تصلبه ، كرر العملية مع أشرطة الكاسيت الأخرى من الخطوة 1.4.2.
   4. بمجرد تصلب جميع القوالب ، افصل القالب الفولاذي عن الكاسيت. إذا كان الأمر صعبا ، فانتظر لفترة أطول قليلا وحاول مرة أخرى (لا تقم بإزالته بقوة). يصبح الفصل أسهل عند التصلب الكامل. الآن يصبح الكاسيت قاعدة كتلة البارافين التي سيتم الاحتفاظ بها أثناء التقسيم بواسطة microtome.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذه الكتلة في درجة حرارة الغرفة لمزيد من الاستخدام. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف العملية واستمرارها لاحقا (إذا لزم الأمر).
5. التقسيم
   1. قم بتثبيت شفرة ميكروتوم يمكن التخلص منها في حامل الشفرة. قم بإزالة شمع البارافين الزائد حول أشرطة الكاسيت بحيث تظل الأجزاء العلوية والسفلية من الكتل موازية للسكين. قم بتركيب الكتلة على حامل الكاسيت.
   2. افتح العجلة اليدوية لدفعها حتى يتلامس سطح الكتلة مع حافة السكين. قم بتقليم شمع البارافين الزائد على الكتلة حتى يتم تصور الأنسجة على سطح الكتلة. اضبط سمك القسم على 5 ميكرومتر وقم بقص شريط من خمسة إلى ستة أقسام.
   3. باستخدام الملقط ، انقل الشريط برفق إلى سطح الحمام المائي الدافئ مسبقا (حوالي 50 درجة مئوية) لكشف الشريط. اجمع المقاطع على شريحة زجاجية مغلفة بألبومين ماير عن طريق الضغط باستمرار على الشريحة أسفل القسم. ارفع الأقسام برفق واترك الشرائح تجف أفقيا طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في صناديق جافة لعدة أشهر. في هذه الخطوة ، يمكن إيقاف العملية ومتابعتها لاحقا.
6. تلطيخ
   1. سخني الشرائح ليتم تلطيخها في فرن الهواء الساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل استخدامها حتى يذوب البارافين ، واتبع الخطوات كما هو مذكور في الجدول 1.
      تحذير: تكون بقع الهيماتوكسيلين والإيوسين سامة عند استنشاقها أو تناولها. وقد أفيد بأنها مسرطنة.

الكاشف	وقت الوقوف	التكرار (عدد المرات)
زيلين	5 دقائق	2
100٪ إيثانول	5 دقائق	2
90٪ إيثانول	5 دقائق	2
70٪ إيثانول	5 دقائق	2
50٪ إيثانول	5 دقائق	2
الماء	5 دقائق	2
هيماتوكسيلين	4 دقائق	1
غسل المياه
1٪ الكحول الحمضي في 70٪ الإيثانول	30 ثانية	1
غسل المياه
ماء سكوت	1 دقيقة	1
غسل المياه
50٪ إيثانول	1 دقيقة	1
95٪ إيثانول	1 دقيقة	1
0.25٪ أوزين	5 ثانية	1
غسل المياه
الماء	2 دقيقة	1
95٪ إيثانول	1 دقيقة	1
100٪ إيثانول	1 دقيقة	1
زيلين	5 دقائق	2
حامل وغطاء

الجدول 1. إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين

2. فحص انهيار الحاجز الدموي الدماغي

1. تجمع الدم والجسم الزجاجي
   1. تخدير فأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام الكيتامين (80 ملغ / كغ) و xylazine (8 ملغ / كغ). تأكد من حالة التخدير عن طريق سحب الدواسة المنعكس (قرصة إصبع القدم). جمع على الفور 1 مل من الدم عن طريق ثقب القلب في أنبوب مغلفة حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) لفصل البلازما عن الدم الكامل.
   2. القتل الرحيم للفئران باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغم / كغ) ، عن طريق الحقن من خلال الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق. قم باستئصال العين ووضعها على الفور على الثلج الجاف.
   3. ضع العين في طبق بتري نظيف فوق الثلج الجاف (مستحسن) وابدأ في تشريح العين كما هو مذكور في الخطوة 1.2.2.
   4. قم بإزالة العدسة، واسحب الجسم الزجاجي بعناية من الكوب الخلفي باستخدام ملقط صغير وضعه في أنبوب تجانس يحتوي على ثلاث إلى أربع حبات زجاجية (2-4 مم).
      ملاحظة: يوصى بالتشريح على الثلج الجاف لأن إزالة العدسة والجسم الزجاجي أسهل في ظل ظروف التجميد.
2. إعداد العينات
   1. تجانس الفكاهة الزجاجية في مجانس الخرز بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان.
   2. نقل عينات الدم (1 مل) والجسم الزجاجي (10-20 ميكرولتر) إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي على حد سواء العينات عند 5200 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: في حالة التجانس الناجح ، يكون للزجاج اتساق موحد بعد الطرد المركزي. ومع ذلك ، في حالة الاتساق غير المنتظم للزجاج ، كرر من الخطوة 2.2.1 مع زيادة وقت التجانس.
   3. جمع supernatant من كلتا العينتين ، وتخفيف الفكاهة الزجاجية وعينات البلازما بنسبة 1: 10 و 1: 20 ، على التوالي ، مع PBS.
3. القياس الكمي للبروتين ونسبة بروتين البلازما الزجاجية
   1. لقياس تركيز البروتين في عينات الفكاهة والبلازما الزجاجية ، أضف 5 ميكرولتر من العينات المخففة إلى 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد ، واخلطها جيدا ، واقرأ الامتصاص عند 590 نانومتر في غضون 40 دقيقة.
      ملاحظة: إذا كانت قيمة امتصاص العينات أعلى من 1.0، فقم بتخفيف العينات بشكل أكبر وكرر الإجراء من الخطوة 2.2.3.
   2. تطبيع مستوى البروتين الزجاجي إلى مستوى بروتين البلازما من نفس الفئران وقياس الفرق بين الفئران الصحية مقابل الفئران السكرية.

3. تصوير الأوعية الدموية الفلورية

1. _{FITC-dextran70000} حقن صبغة
   1. تخدير الفئران الذكور ويستار السكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع السيطرة المتطابقة مع العمر (14 إلى 15 أسبوعا) باستخدام 3 ٪ من الايزوفلوران وتأكيد رد فعل انسحاب دواسة (قرصة إصبع القدم). اغمس الذيل في كوب يحتوي على ماء دافئ (37-40 درجة مئوية). نظف الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل حقن الصبغة. حدد موقع الوريد الجانبي للذيل وحدد موضع الحقن في الجزء السفلي من الذيل.
      ملاحظة: في حالة فشل إدخال الإبرة، حاول الإدراج في موقع آخر أعلى الموضع الحالي (طرف إلى قاعدة الذيل). ومع ذلك ، ينصح بالحقن مرة واحدة لأن الوخز المتكرر قد يؤدي إلى تطور الإجهاد في الفئران ، مما قد يسبب تضيق الأوعية.
   2. حقن 1 مل من محلول صبغة _{FITC-dextran70000 50} ملغم/مل من خلال الوريد الذيل واسمح للصبغة بالدوران لمدة 5 دقائق. القتل الرحيم للفئران بجرعة عالية من البنتوباربيتال (150 ملغ / كغ) ، عن طريق الحقن من خلال الطريق داخل الصفاق. لا توجد نبضات قلب يمكن اكتشافها تؤكد الوفاة في غضون 2-5 دقائق. استئصال العين كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تثبيت العين في محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ ، لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
2. إعداد جبل مسطح
   1. لإعداد حوامل مسطحة ، حافظ على أدوات التشريح جاهزة مع الشرائح والأغطية. ضع العين في طبق بتري مملوء ب PBS المبرد وابدأ في تشريح العين كما هو مذكور في الخطوة 1.2.2.
   2. الآن ضع طرف ملقط مدبب بين الصلبة والشبكية. حركها برفق على طول حافة الكوب ، مع التأكد من عدم ربط شبكية العين بالصلبة في أي وقت. إذا كان هناك أي عائق ، فقم بقطع هذا الجزء ببطء على طول الحافة باستخدام مقص صغير منحني.
   3. بمجرد التأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة من أي جانب ، يتم قطعها بالقرب من القرص البصري ، مما يجعل ثقبا صغيرا بحيث تنفصل الشبكية تماما عن الصلبة. ادفع شبكية العين ببطء إلى محلول PBS وضعها على شريحة مسطحة نظيفة بمساعدة ملعقة أو ملقط.
   4. باستخدام مقص دقيق أو شفرات مشرط ، قم بإجراء جروح طفيفة في أنسجة الشبكية ، وتقسيمها إلى أربعة أرباع. تأكد من أن الجروح على بعد 2 مم على الأقل من الثقب الذي تركه القرص البصري في المركز ، كما هو موضح في الشكل 1.
   5. قم بإزالة PBS الزائد من جوانب الأنسجة باستخدام أطراف 0.2 مل دون إزعاج الحامل المسطح.
   6. ضع قطرة من وسط التركيب المضاد للتلاشي (50 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر) على حامل مسطح ، وقم بتغطيته بغطاء ، وتصور على الفور تحت المجهر البؤري.
      ملاحظة: حافظ على الحد الأدنى من الضوء أثناء الإجراء بأكمله.
3. تصور جبل مسطح
   1. تصور الحامل المسطح تحت هدف 10x للمجهر البؤري. قم بإجراء مسح ضوئي للتجانب لالتقاط الحامل المسطح بالكامل كصورة واحدة. يعتمد عدد البلاط على حجم الحامل المسطح للشبكية. أيضا ، قم بإجراء تكديس Z لتصور الأوردة والشرايين في بؤر مختلفة (الحجم المفضل ل Z-stack هو 5 ميكرومتر ، اعتمادا على أي منها ، يختلف عدد خطوات Z-stack).
   2. استخدم كاشف PMT و HyD بنسبة ربح 700-900 و 100-150 ، على التوالي. اختر نطاق الانبعاثات بين 510-530 نانومتر لصبغة FITC-dextran.

النتائج

أنسجة الشبكية
في شبكية العين السكرية ، تخضع خلايا الشبكية للتنكس. بالإضافة إلى ذلك ، يزداد سمك طبقات الشبكية بسبب الوذمة ²². يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين لعدد الخلايا وقياس سمك الطبقات المختلفة ، كما هو موضح في

Discussion

علم الأنسجة
يتم إجراء علم الأنسجة الشبكية لتصور التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية وطبقاتها. يجب تحسين العديد من الخطوات ، بما في ذلك اختيار الحل المثبت ، ومدة التثبيت ، والجفاف ، وتشريب البارافين. يجب ألا يتجاوز حجم الأنسجة 3 مم ، حيث يصبح الاختراق المثبت بطيئا. يؤدي البارفو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histology
Reagents
Isoflurane	Abbott		Anesthesia agent
Ketamine hydrochloride	Troikaa Pharmaceuticals		Anesthesia agent
Xylazine	Indian Immunologicals Limited		Anesthesia agent
Pentobarbital sodium	Zora Pharma		Euthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	Prepared in-house
Ethanol	Hayman	F204325	Dehydration
Xylene	HiMedia	MB-180	Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin wax	HiMedia	GRM10702	used for embedding tissue
Glycerol	HiMedia	TC503	To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acid	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acid	HiMedia	AS119	For preparation of eosin
Scotts water	Leica	3802900	Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution	Sigma	1.09254.0500	Staining of nuclei
Eosin	HiMedia	GRM115	Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant media	Sigma	6522	Visualization and protection of retinal sections
Equipments
Glassware	Borosil
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Cassettes	HiMedia	PW1292	To hold tissue during histology processing
Water bath	GT Sonic	GT Sonic-D9	Temperature maintenance
Paraffin embedding station	Myr	EC 350	Preparation of paraffin blocks
Microtome	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	Sectioning
Blades	Leica	Leica 818	Sectioning
Slides	HiMedia	BG005	Holding paraffin-tissue sections
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
Dry ice	Not applicable	Not applicable	Dissection
Bradford reagent	Sigma	B6916	Protein quantification
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
EDTA coated tubes	J.K Diagnostics	Not applicable	Separate plasma from whole blood
Homogenization tubes	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	Homogenization of vitreous
Homogenization caps	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	Homogenization of vitreous
Glass beads	MP Biomedicals	SKU: 116914801	Homogenization of vitreous
Homogeniser	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogenization of vitreous
96-well plate - Transparent	Grenier	GN655101	Protein quantification
Plate reader	Molecular devices	SpectrMax M4	Absorbance measurement
Centrifuge	REMI	CPR240 Plus	Centrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO	FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia	FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185	Prepared in-house
Fluoroshied	Sigma	F6182	Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
Slides	HiMedia	BG005	Flatmount preparation
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Confocal microscope	Leica	DMi8	Visualization of flatmount