JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

Abstract

מחלת עיניים אחורית כמו רטינופתיה סוכרתית משנה את הפיזיולוגיה של הרשתית. רטינופתיה סוכרתית מאופיינת על ידי ניתוק רשתית, פירוק של מחסום רשתית הדם (BRB), ו אנגיוגנזה ברשתית. מודל חולדת in vivo הוא כלי ניסיוני בעל ערך כדי לבחון את השינויים במבנה ובתפקוד של הרשתית. אנו מציעים שלוש טכניקות ניסיוניות שונות במודל החולדה כדי לזהות שינויים מורפולוגיים של תאי רשתית, כלי רשתית, ו BRB נפגע. היסטולוגיה רשתית משמשת לחקר המורפולוגיה של תאי רשתית שונים. כמו כן, מדידה כמותית מבוצעת על ידי ספירת תאי רשתית ומדידת עובי של שכבות רשתית שונות. בדיקת פירוק BRB משמשת כדי לקבוע את הדליפה של חלבונים חוץ-עיניים מהפלזמה לרקמה הזגוגית עקב התמוטטות של BRB. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית משמשת לחקר אנגיוגנזה ודליפת כלי דם על ידי הדמיית כלי דם ברשתית באמצעות צבע FITC-dextran.

Introduction

רטינופתיה סוכרתית (DR) היא אחד הסיבוכים המשניים המורכבים ביותר של סוכרת. זהו גם הגורם המוביל לעיוורון ניתן למניעה באוכלוסייה בגיל העבודה ברחבי העולם. במטא-אנליזה שנערכה לאחרונה בקרב 32.4 מיליון עיוורים, 830,000 (2.6%) אנשים היו עיוורים עקב DR1. שיעור אובדן הראייה המיוחס לסוכרת דורג במקום השביעי בשנת 2015 עם 1.06% (0.15-2.38) ברחבי העולם 2,3.

רטינופתיה סוכרתית מאובחנת על ידי חריגות בכלי הדם ברקמות העין האחוריות. מבחינה קלינית, הוא מחולק לשני שלבים - DR לא שגשוג (NPDR) ו DR שגשוג (PDR), המבוסס על כלי הדם ברשתית. היפרגליקמיה נחשבת הרגולטור החזק של DR כפי שהוא מסבך מספר מסלולים המעורבים neurodegeneration4,5, דלקת6,7, ו microvasculature8 ברשתית. סיבוכים מטבוליים מרובים הנגרמים עקב היפרגליקמיה כוללים הצטברות של מוצרי קצה גליקציה מתקדמים (AGEs), מסלול פוליאול, מסלול הקסוסמין, מסלול קינאז-C חלבון. מסלולים אלה אחראים על התפשטות התאים (תאי אנדותל), הגירה (pericytes) ואפופטוזיס (תאי רשתית עצבית, pericytes, ותאי אנדותל) המבוססים על שלבים שונים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מטבוליים אלה יכולים להוביל לשינויים פיזיולוגיים כגון ניתוק רשתית, אובדן תאי רשתית, פירוק מחסום רשתית הדם (BRB), מפרצות, ו אנגיוגנזה9.

סטרפטוזוטוצין (STZ) הנגרמת על ידי סוכרת מסוג 1 היא פרקטיקה מבוססת ומקובלת בחולדות להערכת סוכרת פתוגנזה וסיבוכיה. ההשפעות Diabetogenic של STZ נובעים הרס סלקטיבי של אי הלבלב β תאים10. כתוצאה מכך, בעלי החיים יעברו מחסור באינסולין, היפרגליקמיה, פולידיפסיה ופוליאוריה, שכולם אופייניים לסוכרת מסוג 1 אנושית11. עבור אינדוקציה סוכרת חמורה, STZ מנוהל ב 40-65 מ"ג /ק"ג משקל גוף תוך ורידי או תוך-פריטוני במהלך הבגרות. לאחר כ 72 שעות, בעלי חיים אלה מציגים רמות הגלוקוז בדם גדול מ 250 מ"ג / dL10,12.

כדי להבין את השינויים הפיזיולוגיים של הרשתית עקב ניוון עצבי, דלקת, אנגיוגנזה, טכניקות שונות צריך להיות אופטימיזציה במודלים בעלי חיים ניסיוניים. שינויים מבניים ותפקודיים בתאי רשתית וכלי רשתית ניתן ללמוד על ידי טכניקות שונות כגון היסטולוגיה, בדיקת התמוטטות BRB, אנגיוגרפיה פלואורסצנטית.

היסטולוגיה כוללת את חקר האנטומיה של תאים, רקמות ואיברים ברמה מיקרוסקופית. זה יוצר מתאם בין המבנה והתפקוד של תאים / רקמה. מספר שלבים מבוצעים כדי לדמיין ולזהות את השינויים המיקרוסקופיים במבנה הרקמה, ובכך להשוות עמיתים בריאים וחולים13. לפיכך, חיוני לתקנן כל שלב של היסטולוגיה בקפדנות. שלבים שונים המעורבים בהיסטולוגיה של הרשתית הם קיבוע הדגימה, חיתוך הדגימה, התייבשות, ניקוי, הספגה עם פרפין, הטמעת פרפין, חתך וכתמים (כתמי המטוקסילין ואאוזין)13,14.

ברשתית בריאה, הובלת מולקולות על פני הרשתית נשלטת על ידי BRB, המורכב מתאי אנדותל ופריקים בצד הפנימי, ותאי אפיתל פיגמנט רשתית בצד החיצוני. עם זאת, תאי אנדותל BRB פנימיים ו pericytes להתחיל ניוון במהלך המצב החולה, ו BRB נפגע גם 15. עקב התמוטטות BRB זו, מולקולות משקל מולקולרי נמוך רבות דולפות לתוך רקמת הזגוגית והרשתית16. ככל שהמחלה מתקדמת, מולקולות חלבון רבות אחרות (משקל מולקולרי נמוך וגבוה) דולפות גם הן לרקמת הזגוגית והרשתית עקב הפרעות הומאוסטזיס17. זה מוביל לסיבוכים שונים אחרים ובסופו של דבר בצקת מקולרית ועיוורון. לפיכך, כימות רמות החלבון בזגוגית והשוואת מצבים בריאים וסוכרתיים מדדים נפגע BRB.

אנגיוגרפיה פלואורסצנטית היא טכניקה המשמשת לחקר זרימת הדם של הרשתית והכורואיד באמצעות צבע פלואורסצנטי. הוא משמש כדי לדמיין vasculature של הרשתית choroid על ידי הזרקת צבע פלואורסצ'ין באמצעות מסלול תוך ורידי או הזרקת לב18. ברגע שהצבע מוזרק, הוא מגיע תחילה לעורקי הרשתית, ואחריו ורידים ברשתית. מחזור זה של צבע הושלם בדרך כלל בתוך 5 עד 10 דקות מן הזרקת צבע19. זוהי טכניקה חשובה לאבחון מחלות עיניים שונות בחלק האחורי, כולל רטינופתיה סוכרתית וניאווסקולריזציה choroidal20. זה עוזר לזהות שינויים כלליים וקטנים בכלי דם גדולים וקטנים בתנאים נורמליים וחולים.

Protocol

פרוטוקול זה פועל על פי כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים המסופקות על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד.

1. היסטולוגיה רשתית

  1. עידוד וקיבעון של העין
    1. המתת חסד של חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (בת 14 עד 15 שבועות) באמצעות מינון גבוה של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג) המוזרק דרך המסלול התוך-אפריטוני. אין דופק לגילוי מאשר את המוות בתוך 2-5 דקות.
    2. Enucleate העין על ידי ביצוע חתכים באמצעות להב אזמל על האף ואזורי הזמן של העין. לאחר מכן לחתוך לאורך הקצוות שלה באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו כדי להסיר את העין משקע מסלולית.
      הערה: לפני הקרבת חולדות, שמור על פתרונות קבועים מוכנים.
      אזהרה: פורמלדהיד מגרה את העור, העין, האף ודרכי הנשימה. זה יכול גם לגרום לסרטן כפי שהוא רגיש לעור חזק. ללבוש כפפות ולטפל בו מתחת למכסה המנוע21.
    3. לשטוף את העין ביסודיות עם 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) בצלחת פטרי כדי להסיר דם. הסר את עודף השומן המקיף את העין לחדירה קלה של הפתרון הקיבולנטי.
    4. מיד למקם את העין ב 5 מ"ל של פתרון קבוע בעזרת מלקחיים, ולוודא שהוא לא תקוע לקירות של בקבוקוני זכוכית. מערבבים בעדינות במשך כמה שניות ומחליפים את המכסה בתיוג מתאים. עין דגירה בתמיסה קבועה עבור 24 עד 48 שעות בתנאים כהים בטמפרטורת החדר.
  2. חיתוך רקמות
    1. לאחר קיבעון, להסיר את העין מן הפתרון הקבוע, לשטוף עם 10 מ"ל של PBS, ומניחים אותו בצלחת פטרי המכיל 10 מ"ל של PBS מקורר ב 4 °C (60 °F).
    2. באמצעות מיקרו מלקחיים, להחזיק את העין עם עצב הראייה ולעשות ניק ב pars plana בעזרת מספריים מיקרו. חותכים את כל השוליים של הקרנית כדי להפריד את הכוס הקדמית של העין. בעזרת מלקחיים, בחרו את העדשה בעדינות, השליכו אותה וחתכו את עצב הראייה.
    3. באמצעות מספריים מיקרו מעוקלים, לעשות קטע אורך של eyecup האחורי, עובר דרך הדיסק האופטי מחלק אותו לשני חצאים. מניחים אותו בבסיס הקלטת וסוגרים את המכסה כראוי ללא כל הפרעה לרקמה. סמן את הקלטות עם השם והתאריך של דגימת הרקמה.
  3. התייבשות, ניקוי, פרפין הספגה של רקמות
    1. לייבש את הרקמה החתוך על ידי העברה הדרגתית ב 80 מ"ל של 50%, 70%, 90%, ו 100% אתנול. בעת העברת הקלטות מריכוז אחד למשנהו, הקפד לטפטף אותן על נייר טישו נקי כדי למזער את הזיהום.
      הערה: אפשר לרקמה לעמוד בכל העברה למשך 30 דקות (פעמיים). הזמן הכולל הנצרך עבור שלב זה הוא כ 4 שעות.
    2. לאחר התייבשות, להעביר את הקלטות לתוך 80 מ"ל של קסילן במשך 30 דקות (פעמיים) כדי להחליף את האתנול עם קסילן.
      הערה: לאחר הדגירה עם קסילן, הרקמה הופכת שקופה.
      זהירות: קסילן היא תרכובת ארומטית עם טבעת בנזן. זה מגרה את העין ואת הרירית קרום ועלול גם לגרום לדיכאון.
    3. לבסוף, להפרות את הרקמה עם פרפין מחומם מראש ב 60 °C (60 °F) כדי להחליף קסילן ברקמה. מטפטפים את הקלטות מספר פעמים על נייר טישו כדי למזער את תכולת הקסילן ומניחים ב-200 מ"ל של פרפין (נוזל בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס) למשך 2 שעות (1 שעה x 2).
      אזהרה: הימנע משאיפת פרפין מומס, כפי שהוא מייצר טיפות שומנים זעירים אשר עלול לגרום אי נוחות בדרכי הנשימה.
  4. הטבעת פרפין
    1. הפעל את מכונת הטבעת פרפין לפחות 1 שעות לפני השימוש כדי להמיס את הפרפין וכדי שהתחנות יגיעו לטמפרטורות הרצויות. מלאו תבנית פלדה בשעווה פרפין מומסת על ידי הנחתה על משטח חם, ולאחר מכן הסירו קלטת אחת בכל פעם ממיכל הפרפין.
    2. מעבירים את תבנית הפלדה ממשטח חם למשטח קר (4 מעלות צלזיוס). בשלב זה, השעווה בתבנית תתחיל להתמצק. לפני שהוא מתמצק לחלוטין, מניחים את הרקמה בשעווה בעזרת מלקחיים ומכוונות את הרקמה כך שחלק הדיסק האופטי של הכוס האחורית פונה לבסיס התבנית.
      הערה: ודא שהרקמה אינה זזה ושמור על הכיוון הרצוי. אם לא, החזירו את התבנית למשטח העבודה החם עד שכל הפרפין נמס, ואז התחילו שוב בשלב 1.4.2.
    3. כאשר השעווה בתבנית מתחילה להתמצק, מניחים מיד את בסיס הקסטה על גבי התבנית. מלאו בזהירות את התבנית בפרפין מעל הקצה העליון של הקלטת והעבירו אותה באיטיות למשטח קר (קרוב למינוס 20 מעלות צלזיוס) להתמצקות מהירה. עד שהוא מתמצק, חזור על התהליך עם קלטות אחרות משלב 1.4.2.
    4. לאחר שכל התבניות מתמצקות, מפרידות את תבנית הפלדה מהקלטת. אם זה קשה, לחכות עוד קצת ולנסות שוב (לא להסיר אותו בכוח). ההפרדה הופכת לקלה יותר עם התגבשות מלאה. עכשיו הקלטת הופכת לבסיס של בלוק הפרפין שיוחזק במהלך חתך על ידי מיקרוטומיה.
      הערה: ניתן לאחסן בלוק זה בטמפרטורת החדר לשימוש נוסף. בשלב זה, ניתן לעצור את התהליך ולהמשיך מאוחר יותר (במידת הצורך).
  5. חלוקה לרמות
    1. התקן להב מיקרו-אטומי חד פעמי במחזיק הלהב. הסר שעוות פרפין עודפת סביב קלטות, כך שגם החלק העליון וגם החלק התחתון של הבלוקים יישארו מקבילים לסכין. התאם את החסימה למחזיק קלטות.
    2. לפתוח את גלגל היד כדי לקדם אותו עד פני השטח של הבלוק הוא במגע עם קצה הסכין. חותכים את שעוות הפרפין העודפת על הבלוק עד שהרקמה מדמיינת על פני השטח של הבלוק. הגדר את עובי המקטע ל -5 מיקרומטר וגזור סרט של חמישה עד שישה חלקים.
    3. באמצעות מלקחיים, העבר בעדינות את הרצועה על פני השטח של אמבט המים שחומם מראש (בסביבות 50 °C (סביב 50 °F) כדי לפתוח את הסרט. אסוף קטעים על מגלשת זכוכית מצופה אלבומין של מאייר על ידי החזקת השקופית מתחת למקטע. הרם בעדינות את המקטעים ואפשר למגלשות להתייבש אופקית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורת החדר בקופסאות יבשות למשך מספר חודשים. בשלב זה, ניתן לעצור את התהליך ולהמשיך מאוחר יותר.
  6. כתמים
    1. מחממים את השקופיות כדי להיות מוכתמות בתנור אוויר חם ב 60 °C (60 °F) במשך 1 שעות לפני השימוש עבור פרפין להמיס, ובצע את השלבים כאמור בטבלה 1.
      אזהרה: כתמי המטוקסילין ואאוזין רעילים כאשר הם נשאפים או נבלעים. הם דווחו כמסרטנים.
מגיבזמן עמידהחזרה (מספר פעמים)
קסילן5 דקות2
100% אתנול5 דקות2
90% אתנול5 דקות2
70% אתנול5 דקות2
50% אתנול5 דקות2
מים5 דקות2
המטוקסילין4 דקות1
שטיפת מים
1% אלכוהול חומצי ב-70% אתנול30 שניות1
שטיפת מים
המים של סקוט1 דקות1
שטיפת מים
50% אתנול1 דקות1
95% אתנול1 דקות1
0.25% אאוזין5 שניות1
שטיפת מים
מים2 דקות1
95% אתנול1 דקות1
100% אתנול1 דקות1
קסילן5 דקות2
Mountant וכיסוי

טבלה 1. הליך הכתמת המטוקסילן ואאוזין

2. בדיקת התמוטטות מחסום דם - מוח

  1. איסוף דם וזגוגית
    1. מרדים חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (14 עד 15 שבועות) באמצעות קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (8 מ"ג/ק"ג). אשר את מצב ההרדמה על ידי רפלקס משיכת דוושה (צביטת בוהן). לאסוף מיד 1 מ"ל של דם על ידי ניקוב לב לתוך חומצה אתילנדימינטטראצטטית (EDTA) צינור מצופה להפריד פלזמה מדם שלם.
    2. המתת חסד החולדה באמצעות מינון גבוה של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג), מוזרק דרך המסלול התוך-אפריטוני. אין דופק לגילוי מאשר את המוות בתוך 2-5 דקות. מסננים את העין ומניחים אותה מיד על קרח יבש.
    3. מניחים את העין בצלחת פטרי נקייה מעל קרח יבש (מומלץ) ומתחילים לנתח את העין כאמור בשלב 1.2.2.
    4. הסר את העדשה, למשוך את הזגוגית בזהירות מן הכוס האחורית באמצעות מלקחיים מיקרו ומניחים אותו בצינור הומוגניזציה המכיל שלושה עד ארבעה חרוזי זכוכית (2-4 מ"מ).
      הערה: מומלץ לבצע ניתוח על קרח יבש מכיוון שהסרת העדשה והזגוגית קלה יותר בתנאי הקפאה.
  2. הכנת דגימות
    1. הומור זגוגי הומוגני בהומוגניזר חרוזים במהירות בינונית במשך 10 שניות.
    2. להעביר את הדם (1 מ"ל) ודגימות זגוגית (10-20 μL) לתוך צינורות microcentrifuge וצנטריפוגה שתי הדגימות ב 5200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F).
      הערה: במקרה של הומוגניזציה מוצלחת, לזגוגית יש עקביות אחידה לאחר צנטריפוגה. עם זאת, במקרה של עקביות לא אחידה של זגוגית, חזור משלב 2.2.1 עם זמן הומוגניזציה מוגברת.
    3. לאסוף supernatant משתי הדגימות, ולדלל הומור זגוגית ודגימות פלזמה ביחס 1:10 ו 1:20, בהתאמה, עם PBS.
  3. כימות חלבונים ויחס חלבון זגוגית-פלזמה
    1. כדי כמות ריכוז חלבון הומור זגוגית ודגימות פלזמה, להוסיף 5 μL של דגימות מדוללות ל 250 μL של ריאגנט ברדפורד, לערבב היטב, ולקרוא את הספיגה ב 590 ננומטר בתוך 40 דקות.
      הערה: אם ערך הספיגה של הדגימות הוא מעל 1.0, לדלל את הדגימות עוד יותר ולחזור על ההליך משלב 2.2.3.
    2. לנרמל את רמת החלבון הזגוגית לרמת חלבון פלזמה מאותו חולדה ולמדוד את ההבדל לקפל בין חולדות בריאות לעומת חולי סוכרת.

3. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית

  1. FITC-dextran70000 הזרקת צבע
    1. להרדים חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (14 עד 15 שבועות) באמצעות 3% איזופלוראן ולאשר את רפלקס גמילה מהדוושה (צביטת בוהן). טובלים את הזנב בכוס המכילה מים חמים (37-40 מעלות צלזיוס). נקה את הזנב עם 70% אתנול לפני הזרקת הצבע. אתר את הווריד הצדדי של הזנב וסמן את מיקום ההזרקה בחלק התחתון של הזנב.
      הערה: אם החדרת המחט נכשלת, נסה להכניס למיקום אחר מעל המיקום הנוכחי (קצה לבסיס הזנב). עם זאת, מומלץ להזריק פעם אחת כמו דקירה חוזרת עלולה להוביל להתפתחות מתח בחולדה, אשר יכול לגרום vasoconstriction.
    2. להזריק 1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל FITC-dextran70000 פתרון צבע דרך הווריד הזנב ולאפשר את הצבע להסתובב במשך 5 דקות. המתת חסד החולדה עם מינון גבוה של pentobarbital (150mg/kg), מוזרק דרך המסלול התוך-אפריטוני. אין דופק לגילוי מאשר את המוות בתוך 2-5 דקות. Enucleate העין כאמור בשלב 1.1.1.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לתקן את העין בתמיסת פורמלדהיד של 4%, למשך לא יותר מ-30 דקות.
  2. הכנת הרכבה שטוחה
    1. להכנת תושבות שטוחות, שמרו על כלי הניתוח מוכנים יחד עם השקופיות והכיסויים. מניחים את העין בצלחת פטרי מלאה PBS צונן ולהתחיל לנתח את העין כאמור בשלב 1.2.2.2.
    2. עכשיו למקם את הקצה של מלקחיים מחודדים בין הסקלרה והרשתית. הזיזו אותו בעדינות לאורך כל שפת הכוס, וודאו שהרשתית אינה מחוברת לסקלרה בשום שלב. אם יש חסימה כלשהי, לחתוך לאט את החלק לאורך השפה באמצעות מספריים מיקרו מעוקלים.
    3. ברגע שהוא אישר כי הרשתית אינה מחוברת sclera מכל צד, לחתוך ליד הדיסק האופטי, מה שהופך חור קטן, כך הרשתית מתנתק לחלוטין מן הסקלרה. לאט לדחוף את הרשתית לתוך פתרון PBS ולהניח אותו על שקופית שטוחה נקייה בעזרת מרית או מלקחיים.
    4. באמצעות מיקרו מספריים או להבי אזמל, לעשות חתכים קלים ברקמת הרשתית, חלוקת אותו לארבעה רבעים. ודאו שהחתכים נמצאים במרחק של לפחות 2 מ"מ מהחור שהותיר הדיסק האופטי במרכז, כפי שמוצג באיור 1.
    5. הסר PBS עודף מצדי הרקמה באמצעות 0.2 מ"ל טיפים מבלי להפריע להרכבה השטוחה.
    6. מניחים טיפה של מדיום הרכבה נגד דהייה (50 μL עד 100 μL) על הרכבה שטוחה, לכסות עם כיסוי, ולדמיין מיד תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
      הערה: שמור על אור מינימלי במהלך כל ההליך.
  3. תצוגה חזותית של הרכבה שטוחה
    1. דמיינו את ההרכבה השטוחה מתחת למטרה של פי 10 של מיקרוסקופ קונפוקלי. בצע סריקת אריחים כדי ללכוד את כל ההרכבה השטוחה כתמונה אחת. מספר האריחים תלוי בגודל של הרכבה שטוחה ברשתית. כמו כן, לבצע Z-stacking כדי לדמיין את הוורידים והעורקים במוקדי שונים (גודל מועדף עבור Z-מחסנית הוא 5 מיקרומטר, תלוי באיזה, מספר צעדי Z-מחסנית משתנה).
    2. השתמש בגלאי PMT ו- HyD ב% רווח כמו 700-900 ו 100-150, בהתאמה. בחר טווח פליטה בין 510-530 ננומטר עבור צבע FITC-dextran.

תוצאות

היסטולוגיה רשתית
ברשתית הסוכרתית, תאי הרשתית עוברים ניוון. בנוסף, עובי שכבות הרשתית להגדיל עקב בצקת22. התמונות המתקבלות לאחר כתמי המטוקסילין ואאוזין יכולות לשמש לספירת תאים ומדידה של עובי שכבות שונות, כפי שמוצג באיור 2 באמצעות ImageJ.

Discussion

היסטולוגיה
היסטולוגיה רשתית מבוצעת כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים של תאי רשתית ושכבות. צעדים שונים, כולל בחירה של פתרון קבוע, משך קיבעון, התייבשות, והספגת פרפין, צריך להיות ממוטב. גודל הרקמה לא יעלה על 3 מ"מ, כמו חדירה קבועה הופכת איטית. 4% paraformaldehyde נפוץ מוביל ניתוק רשתית אפיל?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

מחברים רוצים להכיר המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR; ITR-2020-2882) למימון תמיכה לד"ר נירמל ג'יי. ברצוננו גם להודות למענק האוניברסיטה של הנציבות על מתן מלגת מחקר זוטרה למנשה מלאני ולמתקן המעבדה האנליטית המרכזית, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד על אספקת מתקן תשתיתי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Histology
Reagents
IsofluraneAbbottAnesthesia agent
Ketamine hydrochlorideTroikaa PharmaceuticalsAnesthesia agent
XylazineIndian Immunologicals LimitedAnesthesia agent
Pentobarbital sodiumZora PharmaEuthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % GlutaraldehydeHiMedia, AvraMB059, ASG2529Prepared in-house
EthanolHaymanF204325Dehydration
XyleneHiMediaMB-180Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin waxHiMediaGRM10702used for embedding tissue
GlycerolHiMediaTC503To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acidSisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acidHiMediaAS119For preparation of eosin
Scotts waterLeica3802900Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solutionSigma1.09254.0500Staining of nuclei
EosinHiMediaGRM115Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant mediaSigma6522Visualization and protection of retinal sections
Equipments
GlasswareBorosil
Corneal forcepStephens InstrumentsS5-1200Dissection
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissection
Curved micro scissorStephens InstrumentsS7-1311Dissection
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissection
Iris scissorStephens InstrumentsS7-1015Dissection
CassettesHiMediaPW1292To hold tissue during histology processing
Water bathGT SonicGT Sonic-D9Temperature maintenance
Paraffin embedding stationMyrEC 350Preparation of paraffin blocks
MicrotomeZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335ASectioning
BladesLeicaLeica 818Sectioning
SlidesHiMediaBG005Holding paraffin-tissue sections
CoverslipsHiMediaBG014CTo cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
Dry iceNot applicableNot applicableDissection
Bradford reagentSigmaB6916Protein quantification
Equipments
Corneal forcepStephens InstrumentsS5-1200Dissection
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissection
Curved micro scissorStephens InstrumentsS7-1311Dissection
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissection
Iris scissorStephens InstrumentsS7-1015Dissection
GlasswareBorosilNot applicable
EDTA coated tubesJ.K DiagnosticsNot applicableSeparate plasma from whole blood
Homogenization tubesMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFHomogenization of vitreous
Homogenization capsMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFHomogenization of vitreous
Glass beadsMP BiomedicalsSKU: 116914801Homogenization of vitreous
HomogeniserBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AHomogenization of vitreous
96-well plate - TransparentGrenierGN655101Protein quantification
Plate readerMolecular devicesSpectrMax M4Absorbance measurement
CentrifugeREMICPR240 PlusCentrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSOFITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMediaFITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185Prepared in-house
FluoroshiedSigmaF6182Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcepStephens InstrumentsS5-1200Dissection
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissection
Curved micro scissorStephens InstrumentsS7-1311Dissection
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissection
Iris scissorStephens InstrumentsS7-1015Dissection
GlasswareBorosilNot applicable
SlidesHiMediaBG005Flatmount preparation
CoverslipsHiMediaBG014CTo cover tissue after adding mounting media
Confocal microscopeLeicaDMi8Visualization of flatmount

References

  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
  4. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
  5. El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
  6. Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
  7. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  8. Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
  9. Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
  11. Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
  12. Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
  13. Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
  14. Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
  15. Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
  16. do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
  17. Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
  18. D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  19. Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
  20. Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
  21. Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
  22. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
  23. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  24. Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
  25. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
  26. D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  27. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved