Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

Zusammenfassung

Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.

Zusammenfassung

Eine Augenerkrankung des hinteren Segments wie die diabetische Retinopathie verändert die Physiologie der Netzhaut. Die diabetische Retinopathie ist gekennzeichnet durch eine Netzhautablösung, den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) und die retinale Angiogenese. Ein In-vivo-Rattenmodell ist ein wertvolles experimentelles Werkzeug, um die Veränderungen in der Struktur und Funktion der Netzhaut zu untersuchen. Wir schlagen drei verschiedene experimentelle Techniken im Rattenmodell vor, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen, retinalen Gefäßen und kompromittiertem BRB zu identifizieren. Die Netzhauthistologie wird verwendet, um die Morphologie verschiedener Netzhautzellen zu untersuchen. Die quantitative Messung erfolgt auch durch retinale Zellzählung und Dickenmessung verschiedener Netzhautschichten. Ein BRB-Abbauassay wird verwendet, um das Austreten von extraokularen Proteinen aus dem Plasma in Glaskörper aufgrund des Abbaus von BRB zu bestimmen. Die Fluoreszenzangiographie wird verwendet, um die Angiogenese und das Austreten von Blutgefäßen zu untersuchen, indem retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff sichtbar gemacht werden.

Einleitung

Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine der komplexesten sekundären Komplikationen des Diabetes mellitus. Es ist auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Bevölkerung im erwerbsfähigen Alter weltweit. In einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse von 32,4 Millionen blinden Menschen waren 830.000 (2,6%) Menschen aufgrund von ^DR1 blind. Der Anteil des Sehverlusts, der auf Diabetes zurückzuführen ist, belegte 2015 mit 1,06% (0,15-2,38) weltweit den siebten ^Platz2,3.

Die diabetische Retinopathie wird durch Gefäßanomalien im hinteren Augengewebe diagnostiziert. Klinisch ist es in zwei Stadien unterteilt - Non-Proliferative DR (NPDR) und Proliferative DR (PDR), basierend auf der Vaskularisation in der Netzhaut. Hyperglykämie gilt als der potente Regulator von DR, da sie mehrere Wege impliziert, die an Neurodegeneration4,5, ^{Entzündungen6,7} und Mikrovaskulaturen8 in der Netzhaut beteiligt sind. Zu den multiplen metabolischen Komplikationen, die aufgrund von Hyperglykämie induziert werden, gehören die Anhäufung von fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs), Polyolweg, Hexosaminweg und Proteinkinase-C-Signalweg. Diese Signalwege sind verantwortlich für die Zellproliferation (Endothelzellen), Migration (Perizyten) und Apoptose (neuronale Netzhautzellen, Perizyten und Endothelzellen), die auf verschiedenen Stadien der diabetischen Retinopathie basieren. Diese metabolischen Veränderungen können zu physiologischen Veränderungen wie Netzhautablösung, Verlust von Netzhautzellen, Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB), Aneurysmen und Angiogenese ^führen9.

Streptozotocin (STZ) -induzierter Typ-1-Diabetes ist eine etablierte und akzeptierte Praxis bei Ratten zur Bewertung der Diabetes-Pathogenese und ihrer Komplikationen. Diabetogene Wirkungen von STZ sind auf die selektive Zerstörung der Pankreasinsel β-Zellen ^{zurückzuführen10.} Infolgedessen erleiden die Tiere Insulinmangel, Hyperglykämie, Polydipsie und Polyurie, die alle für den menschlichen Typ-1-Diabetes mellitus charakteristisch ^sind11. Bei schwerer Diabetes-Induktion wird STZ bei 40-65 mg/kg Körpergewicht intravenös oder intraperitoneal im Erwachsenenalter verabreicht. Nach etwa 72 h weisen diese Tiere einen Blutzuckerspiegel von mehr als 250 mg/^dL10,12 auf.

Um die physiologischen Veränderungen der Netzhaut durch Neurodegeneration, Entzündung und Angiogenese zu verstehen, sollten verschiedene Techniken in experimentellen Tiermodellen optimiert werden. Strukturelle und funktionelle Veränderungen in Netzhautzellen und Netzhautgefäßen können durch verschiedene Techniken wie Histologie, BRB-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie untersucht werden.

Histologie beinhaltet das Studium der Anatomie von Zellen, Geweben und Organen auf mikroskopischer Ebene. Es stellt eine Korrelation zwischen der Struktur und Funktion von Zellen/Gewebe her. Es werden mehrere Schritte durchgeführt, um die mikroskopischen Veränderungen in der Gewebestruktur zu visualisieren und zu identifizieren und dabei gesunde und kranke Gegenstücke zu ^{vergleichen13}. Daher ist es wichtig, jeden Schritt der Histologie sorgfältig zu standardisieren. Verschiedene Schritte in der Netzhauthistologie sind die Fixierung der Probe, das Trimmen der Probe, Dehydratisierung, Clearing, Imprägnierung mit Paraffin, Paraffineinbettung, Schnitt und Färbung (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung)^13,14.

In einer gesunden Netzhaut wird der Transport von Molekülen über die Netzhaut durch BRB gesteuert, das aus Endothelzellen und Perizyten auf der Innenseite und retinalen Pigmentepithelzellen auf der Außenseite besteht. Innere BRB-Endothelzellen und Perizyten beginnen jedoch während des erkrankten Zustands zu degenerieren, und BRB ist ebenfalls ^{kompromittiert15.} Aufgrund dieses BRB-Abbaus gelangen viele niedermolekulare Moleküle in Glaskörper und ^{Netzhautgewebe16.} Wenn die Krankheit fortschreitet, treten aufgrund von Homöostasestörungen auch viele andere Proteinmoleküle (niedriges und hohes Molekulargewicht) in Glaskörper und Netzhautgewebe ^aus17. Es führt zu verschiedenen anderen Komplikationen und letztendlich zu Makulaödemen und Blindheit. Daher kompromittierten die Quantifizierung der Proteinspiegel im Glaskörper und der Vergleich von gesunden und diabetischen Zuständen das BRB.

Die Fluoreszenzangiographie ist eine Technik, die verwendet wird, um die Blutzirkulation der Netzhaut und der Aderhaut mit Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen. Es wird verwendet, um das Gefäßsystem der Netzhaut und der Aderhaut zu visualisieren, indem Fluoresceinfarbstoff über intravenösen Weg oder Herzinjektion injiziert ^wird18. Sobald der Farbstoff injiziert ist, erreicht er zuerst die Netzhautarterien, gefolgt von Netzhautvenen. Diese Zirkulation von Farbstoff wird normalerweise innerhalb von 5 bis 10 Minuten nach der Injektion von ^Farbstoff19 abgeschlossen. Es ist eine wichtige Technik zur Diagnose verschiedener Augenerkrankungen des hinteren Segments^, einschließlich diabetischer Retinopathie und choroidaler Neovaskularisation20. Es hilft, größere und kleine Gefäßveränderungen unter normalen und kranken Zuständen zu erkennen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt allen Tierpflegerichtlinien, die von der Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, zur Verfügung gestellt werden.

1. Netzhauthistologie

1. Enukleation und Fixierung des Auges
   1. Euthanasieren Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen alt) mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min.
   2. Enukleieren Sie das Auge, indem Sie Einschnitte mit einer Skalpellklinge an den Nasen- und Schläfenregionen des Auges vornehmen. Schneiden Sie dann mit einer Pinzette und einer Mikroschere entlang der Kanten, um das Auge aus der Orbitalhöhle zu entfernen.
      HINWEIS: Bevor Sie Ratten opfern, halten Sie die Fixierlösungen bereit.
      ACHTUNG: Formaldehyd reizt Haut, Auge, Nase und Atemwege. Es kann auch Krebs verursachen, da es ein starker Hautsensibilisator ist. Trage Handschuhe und behandle sie unter der ^Kapuze21.
   3. Waschen Sie das Auge gründlich mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Petrischale, um Blut zu entfernen. Entfernen Sie das überschüssige Fett, das das Auge umgibt, um das Eindringen in die Fixierlösung zu erleichtern.
   4. Legen Sie das Auge sofort mit Hilfe einer Pinzette in 5 ml Fixierlösung und stellen Sie sicher, dass es nicht an Wänden von Glasfläschchen klebt. Rühren Sie einige Sekunden lang vorsichtig um und ersetzen Sie die Kappe durch die richtige Beschriftung. Inkubieren Sie das Auge in Fixierlösung für 24 bis 48 h unter dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur.
2. Trimmen von Gewebe
   1. Entfernen Sie nach der Fixierung das Auge aus der Fixierlösung, waschen Sie es mit 10 ml PBS und legen Sie es in eine Petrischale mit 10 ml PBS, gekühlt bei 4 ° C.
   2. Halten Sie mit einer Mikropinzette das Auge mit dem Sehnerv fest und machen Sie mit Hilfe einer Mikroschere einen Nick an Pars plana . Schneiden Sie den gesamten Rand der Hornhaut durch, um die vordere Tasse eines Auges zu trennen. Wählen Sie die Linse mit einer Pinzette vorsichtig aus, verwerfen Sie sie und schneiden Sie den Sehnerv ab.
   3. Machen Sie mit einer gekrümmten Mikroschere einen Längsschnitt der hinteren Augenmuschel, der durch die optische Scheibe verläuft und sie in zwei Hälften teilt. Legen Sie es in den Boden der Kassette und schließen Sie den Deckel richtig, ohne das Gewebe zu stören. Beschriften Sie die Kassetten mit dem Namen und Datum der Gewebeprobe.
3. Dehydratisierung, Clearing und Paraffinimprägnierung von Gewebe
   1. Dehydrieren Sie das getrimmte Gewebe durch allmählichen Transfer in 80 ml von 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol. Während Sie die Kassetten von einer Konzentration in eine andere übertragen, achten Sie darauf, sie auf sauberes Seidenpapier zu tupfen, um die Kontamination zu minimieren.
      HINWEIS: Lassen Sie das Gewebe bei jedem Transfer 30 Minuten (zweimal) stehen. Der Gesamtzeitaufwand für diesen Schritt beträgt ca. 4 h.
   2. Nach der Dehydratisierung die Kassetten für 30 min (zweimal) in 80 ml Xylol überführen, um das Ethanol durch Xylol zu ersetzen.
      HINWEIS: Nach der Inkubation mit Xylol wird das Gewebe durchscheinend.
      ACHTUNG: Xylol ist eine aromatische Verbindung mit einem Benzolring. Es reizt das Auge und die Schleimhaut und kann auch Depressionen verursachen.
   3. Zum Schluss das Gewebe mit vorgewärmtem Paraffin bei 60 °C imprägnieren, um Xylol im Gewebe zu ersetzen. Tupfen Sie die Kassetten mehrmals auf Seidenpapier, um den Xylolgehalt zu minimieren, und legen Sie 200 ml Paraffin (Flüssigkeit bei 60 °C) für 2 h (1 h x 2) ein.
      VORSICHT: Vermeiden Sie das Einatmen von geschmolzenem Paraffin, da es winzige Lipidtröpfchen produziert, die Atembeschwerden verursachen können.
4. Paraffin-Einbettung
   1. Schalten Sie die Paraffin-Einbettmaschine mindestens 1 Stunde vor Gebrauch ein, um das Paraffin zu schmelzen und die Stationen die gewünschten Temperaturen zu erreichen. Füllen Sie eine Stahlform mit geschmolzenem Paraffinwachs, indem Sie sie auf eine heiße Oberfläche legen, und entfernen Sie dann jeweils eine Kassette aus dem Paraffinbehälter.
   2. Bewegen Sie die Stahlform von einer heißen zu einer kalten Oberfläche (4 °C). An diesem Punkt beginnt sich das Wachs in der Form zu verfestigen. Bevor es sich vollständig verfestigt, legen Sie das Gewebe mit Hilfe einer Pinzette in Wachs und richten Sie das Gewebe so aus, dass der optische Bandscheibenteil der hinteren Tasse der Basis der Form zugewandt ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe nicht bewegt und behalten Sie die gewünschte Ausrichtung. Ist dies nicht der Fall, legen Sie die Form wieder auf die warme Arbeitsfläche, bis sich das gesamte Paraffin verflüssigt, und beginnen Sie dann erneut mit Schritt 1.4.2.
   3. Wenn das Wachs in der Form zu erstarren beginnt, legen Sie sofort den Kassettenfuß auf die Form. Füllen Sie die Form vorsichtig mit Paraffin über dem oberen Rand der Kassette und geben Sie sie langsam auf eine kalte Oberfläche (in der Nähe von -20 ° C) für eine schnelle Erstarrung. Bis es sich verfestigt, wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Kassetten aus Schritt 1.4.2.
   4. Sobald alle Formen verfestigt sind, trennen Sie die Stahlform von der Kassette. Wenn es schwierig ist, warten Sie etwas länger und versuchen Sie es erneut (entfernen Sie es nicht gewaltsam). Die Trennung wird bei vollständiger Erstarrung einfacher. Nun wird die Kassette zur Basis des Paraffinblocks, der während des Schnitts per Mikrotom gehalten werden soll.
      HINWEIS: Dieser Block kann zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden. An dieser Stelle kann der Prozess gestoppt und später (falls erforderlich) fortgesetzt werden.
5. Schnittdarstellung
   1. Installieren Sie eine Einweg-Mikrotomklinge in den Klingenhalter. Entfernen Sie überschüssiges Paraffinwachs um Kassetten herum, so dass sowohl der obere als auch der untere Teil der Blöcke parallel zum Messer bleiben. Befestigen Sie den Block am Kassettenhalter.
   2. Entriegeln Sie das Handrad, um es vorwärts zu bewegen, bis die Oberfläche des Blocks mit der Kante des Messers in Kontakt kommt. Schneiden Sie das überschüssige Paraffinwachs auf den Block, bis das Gewebe auf der Oberfläche des Blocks sichtbar ist. Stellen Sie die Schnittstärke auf 5 μm ein und schneiden Sie ein Band von fünf bis sechs Abschnitten ab.
   3. Übertragen Sie das Band vorsichtig mit einer Pinzette auf die Oberfläche des vorgewärmten Wasserbades (ca. 50 °C), um das Band zu entfalten. Sammeln Sie Abschnitte auf einem Glasobjektträger, der mit Mayers Albumin beschichtet ist, indem Sie den Objektträger unter den Abschnitt halten. Heben Sie die Abschnitte vorsichtig an und lassen Sie die Rutschen über Nacht bei 37 °C horizontal trocknen.
      HINWEIS: Dias können bei Raumtemperatur in trockenen Boxen für mehrere Monate gelagert werden. In diesem Schritt kann der Prozess gestoppt und später fortgesetzt werden.
6. Färbung
   1. Erhitzen Sie die zu befleckenden Objektträger in einem Heißluftofen 1 h lang bei 60 °C, bevor sie das Paraffin zum Schmelzen verwenden, und befolgen Sie die in Tabelle 1 genannten Schritte.
      ACHTUNG: Hämatoxylin- und Eosinflecken sind giftig, wenn sie eingeatmet oder eingenommen werden. Es wurde berichtet, dass sie krebserregend sind.

Reagenz	Stehzeit	Wiederholung (Anzahl der Male)
Xylol	5 Minuten	2
100% Ethanol	5 Minuten	2
90% Ethanol	5 Minuten	2
70% Ethanol	5 Minuten	2
50% Ethanol	5 Minuten	2
Wasser	5 Minuten	2
Hämatoxylin	4 Minuten	1
Wasserwäsche
1% Säurealkohol in 70% Ethanol	30 Sek.	1
Wasserwäsche
Scotts Wasser	1 min	1
Wasserwäsche
50% Ethanol	1 min	1
95% Ethanol	1 min	1
0,25% Eosin	5 s	1
Wasserwäsche
Wasser	2 min	1
95% Ethanol	1 min	1
100% Ethanol	1 min	1
Xylol	5 Minuten	2
Halterung und Deckglas

Tabelle 1. Hämatoxylin- und Eosin-Färbeverfahren

2. Blut-Hirn-Differenz-Abbau-Assay

1. Blut- und Glaskörperentnahme
   1. Anästhesien Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen) mit Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (8 mg / kg). Bestätigen Sie den Anästhesiezustand durch Pedal-Rückzugsreflex (Zehenklemme). Sammeln Sie sofort 1 ml Blut durch Herzpunktion in ein mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichtetes Rohr, um Plasma aus Vollblut zu trennen.
   2. Euthanasie die Ratte mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min. Enukleieren Sie das Auge und legen Sie es sofort auf Trockeneis.
   3. Legen Sie das Auge in eine saubere Petrischale über Trockeneis (empfohlen) und beginnen Sie mit der Sezierung des Auges, wie in Schritt 1.2.2 erwähnt.
   4. Entfernen Sie die Linse, ziehen Sie den Glaskörper vorsichtig mit einer Mikropinzette aus der hinteren Tasse und legen Sie ihn in ein Homogenisierungsröhrchen mit drei bis vier Glasperlen (2-4 mm).
      HINWEIS: Die Dissektion auf Trockeneis wird empfohlen, da das Entfernen der Linse und des Glaskörpers unter Gefrierbedingungen einfacher ist.
2. Vorbereitung von Proben
   1. Glaskörper in einem Perlenhomogenisator bei mittlerer Geschwindigkeit für 10 s homogenisieren.
   2. Die Blut- (1 ml) und Glaskörperproben (10-20 μL) werden in die Mikrozentrifugenröhrchen überführt und beide Proben bei 5200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
      HINWEIS: Bei erfolgreicher Homogenisierung hat Glaskörper nach der Zentrifugation eine einheitliche Konsistenz. Bei ungleichmäßiger Konsistenz von Glaskörpern wiederholen Sie jedoch Schritt 2.2.1 mit erhöhter Homogenisierungszeit.
   3. Sammeln Sie Überstände aus beiden Proben und verdünnen Sie Glaskörper- und Plasmaproben im Verhältnis 1:10 bzw. 1:20 mit PBS.
3. Proteinquantifizierung und Glas-Plasma-Protein-Verhältnis
   1. Um die Proteinkonzentration in Glaskörper- und Plasmaproben zu quantifizieren, fügen Sie 5 μL verdünnte Proben zu 250 μL Bradford-Reagenz hinzu, mischen Sie gut und lesen Sie die Absorption bei 590 nm innerhalb von 40 Minuten ab.
      HINWEIS: Wenn der Absorptionswert der Proben über 1,0 liegt, verdünnen Sie die Proben weiter und wiederholen Sie das Verfahren aus Schritt 2.2.3.
   2. Normalisieren Sie den Glaskörperproteinspiegel auf den Plasmaproteinspiegel derselben Ratte und messen Sie den Faltenunterschied zwischen gesunden und diabetischen Ratten.

3. Fluoreszenzangiographie

1. _{FITC-dextran70000} Farbstoffinjektion
   1. Betäuben Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen) mit 3% Isofluran und bestätigen Sie den Pedalentzugsreflex (Zehenkneipe). Tauchen Sie den Schwanz in ein Becherglas mit warmem Wasser (37-40 °C). Reinigen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol, bevor Sie den Farbstoff injizieren. Suchen Sie die seitliche Vene des Schwanzes und markieren Sie die Injektionsposition im unteren Teil des Schwanzes.
      HINWEIS: Wenn das Einführen der Nadel fehlschlägt, versuchen Sie, an einer anderen Stelle über der aktuellen Position (Spitze zur Basis des Schwanzes) einzuführen. Es wird jedoch empfohlen, einmal zu injizieren, da wiederholtes Stechen zu Stressentwicklung bei der Ratte führen kann, was zu einer Vasokonstriktion führen kann.
   2. Injizieren Sie 1 ml 50 mg/ml _{FITC-dextran70000} Farbstofflösung durch die Schwanzvene und lassen Sie den Farbstoff für 5 min zirkulieren. Euthanasieren Sie die Ratte mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min. Das Auge wie in Schritt 1.1.1 erwähnt enukleieren.
      HINWEIS: Bei Bedarf kann das Auge in 4% iger Formaldehydlösung für nicht mehr als 30 min fixiert werden.
2. Vorbereitung der flachen Montage
   1. Um flache Halterungen vorzubereiten, halten Sie die Sezierwerkzeuge zusammen mit den Schlitten und Deckgläsern bereit. Legen Sie das Auge in eine Petrischale, die mit gekühltem PBS gefüllt ist, und beginnen Sie mit der Sezierung des Auges, wie in Schritt 1.2.2 erwähnt.
   2. Legen Sie nun die Spitze einer spitzen Pinzette zwischen die Sklera und die Netzhaut. Bewegen Sie es vorsichtig entlang des gesamten Randes der Tasse und stellen Sie sicher, dass die Netzhaut an keiner Stelle an der Sklera befestigt ist. Wenn es ein Hindernis gibt, schneiden Sie diesen Teil langsam entlang der Felge mit einer gekrümmten Mikroschere ab.
   3. Sobald bestätigt ist, dass die Netzhaut von keiner Seite an der Sklera befestigt ist, schneiden Sie in der Nähe der optischen Scheibe ab und machen Sie ein kleines Loch, so dass sich die Netzhaut vollständig von der Sklera löst. Drücken Sie die Netzhaut langsam in PBS-Lösung und legen Sie sie mit Hilfe eines Spatels oder einer Pinzette auf einen sauberen, flachen Objektträger.
   4. Machen Sie mit einer Mikroschere oder Skalpellklingen kleinere Schnitte im Netzhautgewebe und teilen Sie es in vier Quadranten auf. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte mindestens 2 mm von dem Loch entfernt sind, das die optische Scheibe in der Mitte hinterlassen hat, wie in Abbildung 1 dargestellt.
   5. Entfernen Sie überschüssiges PBS von den Seiten des Gewebes mit 0,2 ml Spitzen, ohne die flache Halterung zu stören.
   6. Legen Sie einen Tropfen Anti-Fading-Montagemedium (50 μL bis 100 μL) auf eine flache Halterung, decken Sie es mit einem Deckglas ab und visualisieren Sie es sofort unter einem konfokalen Mikroskop.
      HINWEIS: Halten Sie während des gesamten Vorgangs ein Minimum an Licht aufrecht.
3. Visualisierung der flachen Halterung
   1. Visualisieren Sie die flache Halterung unter dem 10-fachen Objektiv eines konfokalen Mikroskops. Führen Sie Kachelscans durch, um die gesamte flache Montierung als einzelnes Image zu erfassen. Die Anzahl der Fliesen hängt von der Größe der retinalen flachen Montierung ab. Führen Sie auch ein Z-Stacking durch, um die Venen und Arterien in verschiedenen Herden zu visualisieren (bevorzugte Größe für Z-Stack beträgt 5 μm, je nachdem, je nachdem, welche Anzahl der Z-Stack-Schritte variiert).
   2. Verwenden Sie PMT- und HyD-Detektor mit % Verstärkung wie 700-900 bzw. 100-150. Wählen Sie den Emissionsbereich zwischen 510-530 nm für FITC-Dextran-Farbstoff.

Ergebnisse

Netzhauthistologie
In der diabetischen Netzhaut erleiden Netzhautzellen eine Degeneration. Darüber hinaus nimmt die Dicke der Netzhautschichten aufgrund von ^Ödem22 zu. Die nach der Hämatoxylin- und Eosinfärbung erhaltenen Bilder können für die Zellzählung und die Messung der Dicke verschiedener Schichten verwendet werden, wie in Abbildung 2 mit ImageJ gezeigt.

Blut-Netzhaut-Barriere-Abbau-Assay

Diskussion

Histologie
Die Netzhauthistologie wird durchgeführt, um die morphologischen Veränderungen von Netzhautzellen und -schichten zu visualisieren. Verschiedene Schritte, einschließlich der Wahl der fixativen Lösung, der Fixationsdauer, der Dehydratation und der Paraffinimprägnierung, müssen optimiert werden. Die Gewebegröße sollte 3 mm nicht überschreiten, da die fixative Penetration langsam wird. Das häufig verwendete 4%ige Paraformaldehyd führt aufgrund der relativ hohen Osmolarität der Lösu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histology
Reagents
Isoflurane	Abbott		Anesthesia agent
Ketamine hydrochloride	Troikaa Pharmaceuticals		Anesthesia agent
Xylazine	Indian Immunologicals Limited		Anesthesia agent
Pentobarbital sodium	Zora Pharma		Euthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	Prepared in-house
Ethanol	Hayman	F204325	Dehydration
Xylene	HiMedia	MB-180	Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin wax	HiMedia	GRM10702	used for embedding tissue
Glycerol	HiMedia	TC503	To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acid	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acid	HiMedia	AS119	For preparation of eosin
Scotts water	Leica	3802900	Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution	Sigma	1.09254.0500	Staining of nuclei
Eosin	HiMedia	GRM115	Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant media	Sigma	6522	Visualization and protection of retinal sections
Equipments
Glassware	Borosil
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Cassettes	HiMedia	PW1292	To hold tissue during histology processing
Water bath	GT Sonic	GT Sonic-D9	Temperature maintenance
Paraffin embedding station	Myr	EC 350	Preparation of paraffin blocks
Microtome	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	Sectioning
Blades	Leica	Leica 818	Sectioning
Slides	HiMedia	BG005	Holding paraffin-tissue sections
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
Dry ice	Not applicable	Not applicable	Dissection
Bradford reagent	Sigma	B6916	Protein quantification
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
EDTA coated tubes	J.K Diagnostics	Not applicable	Separate plasma from whole blood
Homogenization tubes	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	Homogenization of vitreous
Homogenization caps	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	Homogenization of vitreous
Glass beads	MP Biomedicals	SKU: 116914801	Homogenization of vitreous
Homogeniser	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogenization of vitreous
96-well plate - Transparent	Grenier	GN655101	Protein quantification
Plate reader	Molecular devices	SpectrMax M4	Absorbance measurement
Centrifuge	REMI	CPR240 Plus	Centrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO	FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia	FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185	Prepared in-house
Fluoroshied	Sigma	F6182	Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
Slides	HiMedia	BG005	Flatmount preparation
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Confocal microscope	Leica	DMi8	Visualization of flatmount