Évaluation physiopathologique rétinienne dans un modèle de rat

Résumé

La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.

Résumé

Une maladie oculaire du segment postérieur comme la rétinopathie diabétique modifie la physiologie de la rétine. La rétinopathie diabétique se caractérise par un décollement de la rétine, une rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) et une angiogenèse rétinienne. Un modèle de rat in vivo est un outil expérimental précieux pour examiner les changements dans la structure et la fonction de la rétine. Nous proposons trois techniques expérimentales différentes dans le modèle du rat pour identifier les changements morphologiques des cellules rétiniennes, du système vasculaire rétinien et de la BRB compromise. L’histologie rétinienne est utilisée pour étudier la morphologie de diverses cellules rétiniennes. En outre, la mesure quantitative est effectuée par le nombre de cellules rétiniennes et la mesure de l’épaisseur de différentes couches rétiniennes. Un test de dégradation BRB est utilisé pour déterminer la fuite de protéines extraoculaires du plasma vers le tissu vitré en raison de la dégradation de BRB. L’angiographie par fluorescence est utilisée pour étudier l’angiogenèse et les fuites des vaisseaux sanguins en visualisant le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran.

Introduction

La rétinopathie diabétique (DR) est l’une des complications secondaires les plus complexes du diabète sucré. C’est aussi la principale cause de cécité évitable dans la population en âge de travailler dans le monde. Dans une méta-analyse récente portant sur 32,4 millions de personnes aveugles, 830 000 (2,6%) personnes étaient aveugles en raison de ^DR1. La proportion de perte de vision attribuée au diabète se classait au septième rang en 2015 à 1,06% (0,15-2,38) dans le ^monde2,3.

La rétinopathie diabétique est diagnostiquée par des anomalies vasculaires dans le....

Protocole

Ce protocole suit toutes les directives de soins aux animaux fournies par le Comité institutionnel d’éthique animale, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad.

1. Histologie rétinienne

1. Énucléation et fixation de l’œil
   1. Euthanasier un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le témoin apparié selon l’âge (âgé de 14 à 15 semaines) à l’aide d’une dose élevée de pentobarbital (150 mg / kg) injectée par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes.
   2. Énucléez l’œil en faisant des incisions à l’aide d’une lame de scalpel sur les régions nasale et tempora....

Résultats

Histologie rétinienne
Dans la rétine diabétique, les cellules rétiniennes subissent une dégénérescence. De plus, l’épaisseur des couches rétiniennes augmente en raison de l’œdème22. Les images obtenues après coloration à l’hématoxyline et à l’éosine peuvent être utilisées pour le comptage cellulaire et la mesure de l’épaisseur de différentes couches, comme le montre la figure 2 à l’aide d’ImageJ.

Discussion

Histologie
L’histologie rétinienne est réalisée pour visualiser les changements morphologiques des cellules et des couches rétiniennes. Diverses étapes, y compris le choix de la solution fixative, la durée de fixation, la déshydratation et l’imprégnation à la paraffine, doivent être optimisées. La taille des tissus ne doit pas dépasser 3 mm, car la pénétration du fixateur devient lente. Le paraformaldéhyde à 4% couramment utilisé conduit à un décollement de la rétine même dans.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histology
Reagents
Isoflurane	Abbott		Anesthesia agent
Ketamine hydrochloride	Troikaa Pharmaceuticals		Anesthesia agent
Xylazine	Indian Immunologicals Limited		Anesthesia agent
Pentobarbital sodium	Zora Pharma		Euthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	Prepared in-house
Ethanol	Hayman	F204325	Dehydration
Xylene	HiMedia	MB-180	Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin wax	HiMedia	GRM10702	used for embedding tissue
Glycerol	HiMedia	TC503	To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acid	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acid	HiMedia	AS119	For preparation of eosin
Scotts water	Leica	3802900	Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution	Sigma	1.09254.0500	Staining of nuclei
Eosin	HiMedia	GRM115	Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant media	Sigma	6522	Visualization and protection of retinal sections
Equipments
Glassware	Borosil
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Cassettes	HiMedia	PW1292	To hold tissue during histology processing
Water bath	GT Sonic	GT Sonic-D9	Temperature maintenance
Paraffin embedding station	Myr	EC 350	Preparation of paraffin blocks
Microtome	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	Sectioning
Blades	Leica	Leica 818	Sectioning
Slides	HiMedia	BG005	Holding paraffin-tissue sections
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
Dry ice	Not applicable	Not applicable	Dissection
Bradford reagent	Sigma	B6916	Protein quantification
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
EDTA coated tubes	J.K Diagnostics	Not applicable	Separate plasma from whole blood
Homogenization tubes	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	Homogenization of vitreous
Homogenization caps	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	Homogenization of vitreous
Glass beads	MP Biomedicals	SKU: 116914801	Homogenization of vitreous
Homogeniser	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogenization of vitreous
96-well plate - Transparent	Grenier	GN655101	Protein quantification
Plate reader	Molecular devices	SpectrMax M4	Absorbance measurement
Centrifuge	REMI	CPR240 Plus	Centrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO	FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia	FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185	Prepared in-house
Fluoroshied	Sigma	F6182	Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
Slides	HiMedia	BG005	Flatmount preparation
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Confocal microscope	Leica	DMi8	Visualization of flatmount