Évaluation physiopathologique rétinienne dans un modèle de rat

Résumé

La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.

Résumé

Une maladie oculaire du segment postérieur comme la rétinopathie diabétique modifie la physiologie de la rétine. La rétinopathie diabétique se caractérise par un décollement de la rétine, une rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) et une angiogenèse rétinienne. Un modèle de rat in vivo est un outil expérimental précieux pour examiner les changements dans la structure et la fonction de la rétine. Nous proposons trois techniques expérimentales différentes dans le modèle du rat pour identifier les changements morphologiques des cellules rétiniennes, du système vasculaire rétinien et de la BRB compromise. L’histologie rétinienne est utilisée pour étudier la morphologie de diverses cellules rétiniennes. En outre, la mesure quantitative est effectuée par le nombre de cellules rétiniennes et la mesure de l’épaisseur de différentes couches rétiniennes. Un test de dégradation BRB est utilisé pour déterminer la fuite de protéines extraoculaires du plasma vers le tissu vitré en raison de la dégradation de BRB. L’angiographie par fluorescence est utilisée pour étudier l’angiogenèse et les fuites des vaisseaux sanguins en visualisant le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran.

Introduction

La rétinopathie diabétique (DR) est l’une des complications secondaires les plus complexes du diabète sucré. C’est aussi la principale cause de cécité évitable dans la population en âge de travailler dans le monde. Dans une méta-analyse récente portant sur 32,4 millions de personnes aveugles, 830 000 (2,6%) personnes étaient aveugles en raison de ^DR1. La proportion de perte de vision attribuée au diabète se classait au septième rang en 2015 à 1,06% (0,15-2,38) dans le ^monde2,3.

La rétinopathie diabétique est diagnostiquée par des anomalies vasculaires dans les tissus oculaires postérieurs. Cliniquement, il est divisé en deux étapes - DR non proliférative (NPDR) et DR proliférative (PDR), en fonction de la vascularisation de la rétine. L’hyperglycémie est considérée comme le puissant régulateur de la RD car elle implique plusieurs voies impliquées dans la neurodégénérescence4,5, l’inflammation6,7 et la microvascularisation8 dans la rétine. Les multiples complications métaboliques induites par l’hyperglycémie comprennent l’accumulation de produits finaux de glycation avancée (AGE), de la voie polyol, de la voie hexosamine et de la voie protéine kinase-C. Ces voies sont responsables de la prolifération cellulaire (cellules endothéliales), de la migration (péricytes) et de l’apoptose (cellules rétiniennes neurales, péricytes et cellules endothéliales) en fonction des différents stades de la rétinopathie diabétique. Ces altérations métaboliques peuvent entraîner des changements physiologiques tels que le décollement de la rétine, la perte de cellules rétiniennes, la dégradation de la barrière hémato-rétinienne (BRB), les anévrismes et l’angiogenèse9.

Le diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) est une pratique bien établie et bien acceptée chez le rat pour évaluer la pathogenèse du diabète et ses complications. Les effets diabétogènes de STZ sont dus à la destruction sélective des îlots pancréatiques ^{β-cellules10}. En conséquence, les animaux subiront une carence en insuline, une hyperglycémie, une polydipsie et une polyurie, qui sont toutes caractéristiques du diabète sucré de type 1 ^humain11. Pour l’induction sévère du diabète, STZ est administré à 40-65 mg / kg de poids corporel par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à l’âge adulte. Après environ 72 h, ces animaux présentent une glycémie supérieure à 250 mg/^dL10,12.

Pour comprendre les altérations physiologiques de la rétine dues à la neurodégénérescence, à l’inflammation et à l’angiogenèse, différentes techniques doivent être optimisées dans des modèles animaux expérimentaux. Les changements structurels et fonctionnels dans les cellules rétiniennes et les vaisseaux rétiniens peuvent être étudiés par diverses techniques telles que l’histologie, le test de dégradation BRB et l’angiographie par fluorescence.

L’histologie implique l’étude de l’anatomie des cellules, des tissus et des organes à un niveau microscopique. Il établit une corrélation entre la structure et la fonction des cellules/tissus. Plusieurs étapes sont effectuées pour visualiser et identifier les altérations microscopiques de la structure tissulaire, comparant ainsi les homologues sains et ^malades13. Par conséquent, il est essentiel de normaliser méticuleusement chaque étape de l’histologie. Diverses étapes de l’histologie rétinienne sont la fixation de l’échantillon, la coupe de l’échantillon, la déshydratation, le nettoyage, l’imprégnation avec de la paraffine, l’incorporation de paraffine, le sectionnement et la coloration (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine)^13,14.

Dans une rétine saine, le transport des molécules à travers la rétine est contrôlé par BRB, composé de cellules endothéliales et de péricytes sur la face interne, et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes sur la face externe. Cependant, les cellules endothéliales internes du BRB et les péricytes commencent à dégénérer pendant la maladie, et le BRB est également ^compromis15. En raison de cette dégradation de la BRB, de nombreuses molécules de faible poids moléculaire s’infiltrent dans le tissu vitré et ^rétinien16. Au fur et à mesure que la maladie progresse, de nombreuses autres molécules protéiques (poids moléculaire faible et élevé) s’infiltrent également dans les tissus vitrés et rétiniens en raison de troubles de l’homéostasie17. Il conduit à diverses autres complications et finalement à l’œdème maculaire et à la cécité. Par conséquent, la quantification des niveaux de protéines dans le vitré et la comparaison des états sains et diabétiques ont compromis la BRB.

L’angiographie par fluorescence est une technique utilisée pour étudier la circulation sanguine de la rétine et de la choroïde à l’aide d’un colorant fluorescent. Il est utilisé pour visualiser le système vasculaire de la rétine et de la choroïde en injectant du colorant fluorescéine par voie intraveineuse ou par injection ^cardiaque18. Une fois le colorant injecté, il atteint d’abord les artères rétiniennes, suivies des veines rétiniennes. Cette circulation du colorant est généralement terminée dans les 5 à 10 minutes suivant l’injection du ^colorant19. C’est une technique importante pour diagnostiquer diverses maladies oculaires du segment postérieur, y compris la rétinopathie diabétique et la néovascularisation ^{choroïdienne20}. Il aide à détecter les changements vasculaires majeurs et mineurs dans les conditions normales et malades.

Protocole

Ce protocole suit toutes les directives de soins aux animaux fournies par le Comité institutionnel d’éthique animale, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad.

1. Histologie rétinienne

1. Énucléation et fixation de l’œil
   1. Euthanasier un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le témoin apparié selon l’âge (âgé de 14 à 15 semaines) à l’aide d’une dose élevée de pentobarbital (150 mg / kg) injectée par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes.
   2. Énucléez l’œil en faisant des incisions à l’aide d’une lame de scalpel sur les régions nasale et temporale de l’œil. Ensuite, coupez le long de ses bords à l’aide de pinces et de micro-ciseaux pour retirer l’œil de l’orbite orbitale.
      REMARQUE: Avant de sacrifier des rats, gardez les solutions fixatrices prêtes.
      ATTENTION : Le formaldéhyde irrite la peau, les yeux, le nez et les voies respiratoires. Il peut également causer le cancer car il est un puissant sensibilisant cutané. Portez des gants et manipulez-les sous le ^capot21.
   3. Lavez soigneusement les yeux avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de Pétri pour éliminer le sang. Enlevez l’excès de graisse entourant l’œil pour une pénétration facile de la solution fixatrice.
   4. Placez immédiatement l’œil dans 5 mL de solution fixatrice à l’aide de pinces et assurez-vous qu’il n’est pas collé aux parois des flacons en verre. Remuez doucement pendant quelques secondes et remplacez le bouchon par un étiquetage approprié. Incuber l’œil en solution fixatrice pendant 24 à 48 h dans des conditions sombres à température ambiante.
2. Rognage des tissus
   1. Après fixation, retirer l’œil de la solution fixatrice, laver avec 10 mL de PBS et le placer dans une boîte de Petri contenant 10 mL de PBS réfrigérée à 4 °C.
   2. À l’aide de micro-pinces, maintenez l’œil avec le nerf optique et faites une entaille au pars plana à l’aide de micro ciseaux. Coupez toute la marge de la cornée pour séparer la coupe antérieure d’un œil. À l’aide d’une pince, prenez doucement la lentille, jetez-la et coupez le nerf optique.
   3. À l’aide de micro-ciseaux incurvés, faites une section longitudinale de l’œillet postérieur, en passant à travers le disque optique en le divisant en deux moitiés. Placez-le dans la base de la cassette et fermez correctement le couvercle sans perturber les tissus. Étiquetez les cassettes avec le nom et la date de l’échantillon de tissu.
3. Déshydratation, nettoyage et imprégnation paraffine des tissus
   1. Déshydrater les tissus coupés par transfert progressif dans 80 mL d’éthanol à 50 %, 70 %, 90 % et 100 %. Lors du transfert des cassettes d’une concentration à une autre, assurez-vous de les tamponner sur du papier de soie propre pour minimiser la contamination.
      REMARQUE: Laissez le tissu rester dans chaque transfert pendant 30 minutes (deux fois). Le temps total consommé pour cette étape est d’environ 4 h.
   2. Lors de la déshydratation, transférer les cassettes dans 80 mL de xylène pendant 30 min (deux fois) pour remplacer l’éthanol par du xylène.
      REMARQUE: Après l’incubation avec du xylène, le tissu devient translucide.
      ATTENTION : Le xylène est un composé aromatique avec un cycle benzénique. Il irrite les yeux et les muqueuses et peut également provoquer des dépressions.
   3. Enfin, imprégner le tissu avec de la paraffine préchauffée à 60 °C pour remplacer le xylène dans le tissu. Tamponner les cassettes plusieurs fois sur du papier de soie pour minimiser la teneur en xylène et placer dans 200 mL de paraffine (liquide à 60 °C) pendant 2 h (1 h x 2).
      ATTENTION: Évitez d’inhaler de la paraffine fondue, car elle produit de minuscules gouttelettes lipidiques qui peuvent causer une gêne respiratoire.
4. Intégration de paraffine
   1. Allumez la machine d’enrobage de paraffine au moins 1 h avant utilisation pour faire fondre la paraffine et pour que les stations atteignent les températures souhaitées. Remplissez un moule en acier avec de la cire de paraffine fondue en le plaçant sur une surface chaude, puis retirez une cassette à la fois du récipient de paraffine.
   2. Déplacez le moule en acier d’une surface chaude à une surface froide (4 °C). À ce stade, la cire dans le moule commencera à se solidifier. Avant qu’il ne se solidifie complètement, placez le tissu dans de la cire à l’aide d’une pince et orientez le tissu de sorte que la partie du disque optique de la coupe postérieure soit orientée vers la base du moule.
      REMARQUE: Assurez-vous que le tissu ne bouge pas et conserve l’orientation souhaitée. Si ce n’est pas le cas, remettez le moule sur la surface de travail chaude jusqu’à ce que toute la paraffine se liquéfie, puis recommencez à l’étape 1.4.2.
   3. Lorsque la cire dans le moule commence à se solidifier, placez immédiatement la base de la cassette sur le dessus du moule. Remplissez soigneusement le moule avec de la paraffine au-dessus du bord supérieur de la cassette et transférez-le lentement sur une surface froide (près de -20 ° C) pour une solidification rapide. Jusqu’à ce qu’il se solidifie, répétez le processus avec d’autres cassettes de l’étape 1.4.2.
   4. Une fois tous les moules solidifiés, séparez le moule en acier de la cassette. Si c’est difficile, attendez un peu plus longtemps et réessayez (ne le retirez pas de force). La séparation devient plus facile à la solidification complète. Maintenant, la cassette devient la base du bloc de paraffine à maintenir pendant la section par microtome.
      REMARQUE: Ce bloc peut être stocké à température ambiante pour une utilisation ultérieure. À ce stade, le processus peut être arrêté et poursuivi plus tard (si nécessaire).
5. Sectionnement
   1. Installez une lame de microtome jetable dans le porte-lame. Enlevez l’excès de cire de paraffine autour des cassettes afin que les parties supérieure et inférieure des blocs restent parallèles au couteau. Placez le bloc sur le support de cassette.
   2. Déverrouillez le volant pour l’avancer jusqu’à ce que la surface du bloc soit en contact avec le bord du couteau. Coupez l’excès de cire de paraffine sur le bloc jusqu’à ce que le tissu soit visualisé à la surface du bloc. Réglez l’épaisseur de la section à 5 μm et coupez un ruban de cinq à six sections.
   3. À l’aide d’une pince, transférez doucement le ruban sur la surface du bain-marie préchauffé (environ 50 °C) pour déplier le ruban. Collectez des sections sur une lame de verre recouverte d’albumine de Mayer en tenant la lame sous la section. Soulevez doucement les sections et laissez les glissières sécher horizontalement pendant la nuit à 37 °C.
      REMARQUE: Les lames peuvent être stockées à température ambiante dans des boîtes sèches pendant plusieurs mois. À cette étape, le processus peut être arrêté et poursuivi plus tard.
6. Coloration
   1. Chauffer les lames à teindre dans un four à air chaud à 60 °C pendant 1 h avant de les utiliser pour que la paraffine fonde, et suivre les étapes mentionnées dans le tableau 1.
      ATTENTION : Les taches d’hématoxyline et d’éosine sont toxiques lorsqu’elles sont inhalées ou ingérées. Ils ont été signalés comme étant cancérigènes.

Réactif	Temps d’arrêt	Répétition (nombre de fois)
Xylène	5 min	2
100% Éthanol	5 min	2
Éthanol à 90 %	5 min	2
70% d’éthanol	5 min	2
Éthanol à 50 %	5 min	2
Eau	5 min	2
Hématoxyline	4 min	1
Lavage à l’eau
1% d’alcool acide dans 70% d’éthanol	30 s	1
Lavage à l’eau
L’eau de Scott	1 min	1
Lavage à l’eau
Éthanol à 50 %	1 min	1
Éthanol à 95 %	1 min	1
0,25% Éosine	5 s	1
Lavage à l’eau
Eau	2 min	1
Éthanol à 95 %	1 min	1
100% Éthanol	1 min	1
Xylène	5 min	2
Mountant et couvercle

Tableau 1. Procédure de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

2. Test de dégradation de la barrière hémato-encéphalique

1. Prélèvement sanguin et vitré
   1. Anesthésier un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le témoin apparié selon l’âge (14 à 15 semaines) en utilisant de la kétamine (80 mg / kg) et de la xylazine (8 mg / kg). Confirmer l’état anesthésique par réflexe de retrait de la pédale (pincement de l’orteil). Prélever immédiatement 1 mL de sang par ponction cardiaque dans un tube revêtu d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour séparer le plasma du sang total.
   2. Euthanasier le rat à l’aide d’une forte dose de pentobarbital (150 mg/kg), injectée par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes. Énucléez l’œil et placez-le immédiatement sur de la glace carbonique.
   3. Placez l’œil dans une boîte de Petri propre au-dessus de la glace carbonique (recommandé) et commencez à disséquer l’œil comme mentionné à l’étape 1.2.2.
   4. Retirez la lentille, tirez soigneusement le vitré de la coupelle postérieure à l’aide de micro-pinces et placez-la dans un tube d’homogénéisation contenant trois à quatre billes de verre (2-4 mm).
      REMARQUE: La dissection sur la glace carbonique est recommandée car le retrait de la lentille et du vitré est plus facile dans des conditions de gel.
2. Préparation des échantillons
   1. Homogénéiser l’humeur vitrée dans un homogénéisateur de perles à vitesse moyenne pendant 10 s.
   2. Transférer les échantillons de sang (1 mL) et de vitre (10-20 μL) dans les tubes de microcentrifugation et centrifuger les deux échantillons à 5200 x g pendant 10 min à 4 °C.
      REMARQUE: En cas d’homogénéisation réussie, le vitré a une consistance uniforme après centrifugation. Cependant, dans le cas d’une consistance non uniforme du vitré, répétez à partir de l’étape 2.2.1 avec un temps d’homogénéisation accru.
   3. Prélever un surnageant dans les deux échantillons et diluer l’humeur vitrée et les échantillons de plasma dans un rapport de 1:10 et 1:20, respectivement, avec PBS.
3. Quantification des protéines et rapport protéines vitréo-plasmatiques
   1. Pour quantifier la concentration en protéines dans les échantillons d’humeur vitrée et de plasma, ajoutez 5 μL d’échantillons dilués à 250 μL de réactif de Bradford, mélangez bien et lisez l’absorbance à 590 nm en 40 minutes.
      REMARQUE: Si la valeur d’absorption des échantillons est supérieure à 1,0, diluer davantage les échantillons et répéter la procédure de l’étape 2.2.3.
   2. Normalisez le niveau de protéines vitréennes au niveau de protéines plasmatiques du même rat et mesurez la différence de pli entre les rats sains et diabétiques.

3. Angiographie par fluorescence

1. Injection de colorant _{FITC-dextran70000}
   1. Anesthésiez un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le contrôle apparié à l’âge (14 à 15 semaines) à l’aide d’isoflurane à 3% et confirmez le réflexe de retrait de la pédale (pincement des orteils). Trempez la queue dans un bécher contenant de l’eau tiède (37-40 °C). Nettoyez la queue avec 70% d’éthanol avant d’injecter le colorant. Localisez la veine latérale de la queue et marquez la position d’injection dans la partie inférieure de la queue.
      REMARQUE: Si l’insertion de l’aiguille échoue, essayez d’insérer à un autre endroit au-dessus de la position actuelle (pointe à la base de la queue). Cependant, il est conseillé d’injecter une fois car des piqûres répétées peuvent entraîner un développement de stress chez le rat, ce qui pourrait provoquer une vasoconstriction.
   2. Injecter 1 mL de solution de colorant _{FITC-dextran70000} de 50 mg/mL dans la veine caudale et laisser circuler le colorant pendant 5 min. Euthanasier le rat avec une forte dose de pentobarbital (150 mg / kg), injecté par voie intrapéritonéale. Aucun battement de cœur détectable ne confirme le décès dans les 2-5 minutes. Énucléez l’œil comme mentionné à l’étape 1.1.1.
      REMARQUE: Si nécessaire, l’œil peut être fixé dans une solution de formaldéhyde à 4%, pendant 30 minutes au maximum.
2. Préparation du montage plat
   1. Pour préparer des supports plats, gardez les outils de dissection prêts avec les glissières et les couvercles. Placez l’œil dans une boîte de Petri remplie de PBS réfrigéré et commencez à disséquer l’œil comme mentionné à l’étape 1.2.2.
   2. Maintenant, placez la pointe d’une pince pointue entre la sclérotique et la rétine. Déplacez-le doucement tout le long du bord de la coupe, en vous assurant que la rétine n’est attachée à la sclérotique à aucun moment. S’il y a une obstruction, coupez lentement cette partie le long de la jante à l’aide de micro-ciseaux incurvés.
   3. Une fois qu’il est confirmé que la rétine n’est attachée à la sclérotique d’aucun côté, coupez près du disque optique, en faisant un petit trou tel que la rétine se détache complètement de la sclérotique. Poussez lentement la rétine dans une solution PBS et placez-la sur une lame plate propre à l’aide d’une spatule ou d’une pince.
   4. À l’aide de micro-ciseaux ou de lames de scalpel, faites des coupes mineures dans le tissu rétinien, en le divisant en quatre quadrants. Assurez-vous que les coupes sont à au moins 2 mm du trou laissé par le disque optique au centre, comme illustré à la figure 1.
   5. Enlevez l’excès de PBS des côtés du tissu à l’aide d’embouts de 0,2 mL sans perturber le support plat.
   6. Placez une goutte de support de montage anti-décoloration (50 μL à 100 μL) sur un support plat, couvrez avec un couvercle et visualisez immédiatement sous un microscope confocal.
      REMARQUE: Maintenez un minimum de lumière pendant toute la procédure.
3. Visualisation du montage plat
   1. Visualisez la monture plate sous l’objectif 10x d’un microscope confocal. Effectuez une numérisation de tuiles pour capturer l’ensemble du montage plat en une seule image. Le nombre de tuiles dépend de la taille de la monture plate rétinienne. En outre, effectuez un empilement Z pour visualiser les veines et les artères dans différents foyers (la taille préférée pour Z-stack est de 5 μm, selon laquelle, le nombre d’étapes Z-stack varie).
   2. Utilisez le détecteur PMT et HyD à % de gain comme 700-900 et 100-150, respectivement. Choisissez une plage d’émission comprise entre 510 et 530 nm pour le colorant FITC-dextran.

Résultats

Histologie rétinienne
Dans la rétine diabétique, les cellules rétiniennes subissent une dégénérescence. De plus, l’épaisseur des couches rétiniennes augmente en raison de l’œdème22. Les images obtenues après coloration à l’hématoxyline et à l’éosine peuvent être utilisées pour le comptage cellulaire et la mesure de l’épaisseur de différentes couches, comme le montre la figure 2 à l’aide d’ImageJ.

Discussion

Histologie
L’histologie rétinienne est réalisée pour visualiser les changements morphologiques des cellules et des couches rétiniennes. Diverses étapes, y compris le choix de la solution fixative, la durée de fixation, la déshydratation et l’imprégnation à la paraffine, doivent être optimisées. La taille des tissus ne doit pas dépasser 3 mm, car la pénétration du fixateur devient lente. Le paraformaldéhyde à 4% couramment utilisé conduit à un décollement de la rétine même dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histology
Reagents
Isoflurane	Abbott		Anesthesia agent
Ketamine hydrochloride	Troikaa Pharmaceuticals		Anesthesia agent
Xylazine	Indian Immunologicals Limited		Anesthesia agent
Pentobarbital sodium	Zora Pharma		Euthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	Prepared in-house
Ethanol	Hayman	F204325	Dehydration
Xylene	HiMedia	MB-180	Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin wax	HiMedia	GRM10702	used for embedding tissue
Glycerol	HiMedia	TC503	To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acid	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acid	HiMedia	AS119	For preparation of eosin
Scotts water	Leica	3802900	Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution	Sigma	1.09254.0500	Staining of nuclei
Eosin	HiMedia	GRM115	Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant media	Sigma	6522	Visualization and protection of retinal sections
Equipments
Glassware	Borosil
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Cassettes	HiMedia	PW1292	To hold tissue during histology processing
Water bath	GT Sonic	GT Sonic-D9	Temperature maintenance
Paraffin embedding station	Myr	EC 350	Preparation of paraffin blocks
Microtome	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	Sectioning
Blades	Leica	Leica 818	Sectioning
Slides	HiMedia	BG005	Holding paraffin-tissue sections
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
Dry ice	Not applicable	Not applicable	Dissection
Bradford reagent	Sigma	B6916	Protein quantification
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
EDTA coated tubes	J.K Diagnostics	Not applicable	Separate plasma from whole blood
Homogenization tubes	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	Homogenization of vitreous
Homogenization caps	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	Homogenization of vitreous
Glass beads	MP Biomedicals	SKU: 116914801	Homogenization of vitreous
Homogeniser	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogenization of vitreous
96-well plate - Transparent	Grenier	GN655101	Protein quantification
Plate reader	Molecular devices	SpectrMax M4	Absorbance measurement
Centrifuge	REMI	CPR240 Plus	Centrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO	FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia	FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185	Prepared in-house
Fluoroshied	Sigma	F6182	Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
Slides	HiMedia	BG005	Flatmount preparation
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Confocal microscope	Leica	DMi8	Visualization of flatmount