JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر اختبار ACT1-CUP1 ، وهو فحص نمو النحاس ، قراءة سريعة لربط الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA) وتأثير عوامل الربط الطافرة على وظيفة spliceosomal. توفر هذه الدراسة بروتوكولا وتسلط الضوء على التخصيص الممكن لمعالجة مسألة الربط ذات الأهمية.

Abstract

ساهمت الطفرات التي أدخلت في spliceosome أو ركيزته بشكل كبير في فهمنا لتعقيدات وظيفة spliceosomal. سواء كانت مرتبطة بالمرض أو مختارة وظيفيا ، فقد تمت دراسة العديد من هذه الطفرات باستخدام مقايسات النمو في الكائن الحي النموذجي Saccharomyces cerevisiae (الخميرة). يوفر مقايسة نمو النحاس الخاصة بالربط ، أو مقايسة ACT1-CUP1 ، تحليلا شاملا للطفرة على مستوى النمط الظاهري. يستخدم اختبار ACT1-CUP1 المراسلين الذين يمنحون تحمل النحاس عند تقطيعه بشكل صحيح. وهكذا ، في وجود النحاس ، ترتبط التغيرات في صلاحية الخميرة بالتغيرات في إنتاج mRNA من خلال الربط. في تجربة نموذجية ، يتم تحدي spliceosome الخميرة مع مراسلي الربط غير التوافقيين المختلفين وطفرة عامل الربط ذات الأهمية للكشف عن أي تأثير تآزري أو مضاد على الربط. هنا يتم تقديم وصف كامل لإعداد الألواح النحاسية ، وطلاء خلايا الخميرة ، وتقييم البيانات. يتم وصف مجموعة مختارة من التجارب المجانية ، مع تسليط الضوء على تنوع مراسلي ACT1-CUP1. يعد اختبار ACT1-CUP1 أداة مفيدة في صندوق أدوات الربط بفضل القراءة المباشرة للتأثير (التأثيرات) الطفرية والإمكانيات النسبية من الاستخدام المستمر في هذا المجال.

Introduction

ال spliceosome هو آلة بيولوجية كبيرة تحفز إزالة الإنترونات ، المناطق غير المشفرة في الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA)1,2. غالبا ما يكون توصيف تأثير طفرة نقطة واحدة في 1 من ما يقرب من 100 بروتين و 5 RNAs غير مشفرة غامضا عند دراسة البروتين أو الحمض النووي الريبي بمعزل عن غيره. يمكن تقييم التغيير في وظيفة المكون المتحور بشكل أفضل في الجسم الحي في سياق spliceosome الكامل والفعال.

مقايسة نمو النحاس الموصوفة هنا هي مقياس سريع لكفاءة الربط في Saccharomyces cerevisiae أو الخميرة الناشئة. تم تطوير هذا الفحص بواسطة C.F. Lesser و C. Guthrie ونشر في عام 1993 ، ويجمع بين سهولة العمل مع كائن نموذجي بسيط والقراءة المباشرة لصلاحية الخلية3. ترتبط الجدوى بمدى قدرة spliceosomes في هذه الخلايا على التعرف على نص المراسل ولصقه.

يطلق على مقايسة نمو النحاس هذه بشكل أكثر شيوعا مقايسة ACT1-CUP1. ينشأ اسم ACT1-CUP1 من الجينين المندمجين لإنشاء مراسل لكفاءة الربط. ACT1 هو جين الأكتين في الخميرة ، والذي يتم التعبير عنه بشكل كبير ويحتوي على إنترونمقسم بكفاءة 4,5. Cup1p هو مخلب نحاسي يعزل النحاس في الخلية لمنع التداخل مع الوظائف الخلوية العادية6،7،8. يحتوي مراسل ACT1-CUP1 على هذه الجينات بالتسلسل بحيث يكون CUP1 في إطار القراءة المناسب فقط في حالة حدوث الربط قبل mRNA لإنترون ACT1 (الشكل 1). يحتوي بروتين الاندماج الناتج على أول 21 حمضا أمينيا من الأكتين وبروتين Cup1p كامل الطول ، مما يزيد من صلاحية الخميرة في بيئة غنية بالنحاس3. وبالتالي ، فإن الزيادة في كمية الربط للمراسل تؤدي إلى تركيز أعلى من Cup1p ومقاومة أعلى للنحاس (الشكل 1). بالمقارنة مع جينات المراسل الأخرى ، يؤثر CUP1 على بقاء الخلية حتى عند المستويات المنخفضة ، وله نطاق حساسية واسع ، ويمكن استخدامه للاختيار المباشر لطفرات الربط3،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، CUP1 غير ضروري لنمو الخميرة القياسي ، وبالتالي لا يتأثر التوازن الخلوي أثناء الإعداد لهذا الفحص. مكملا لمقايسات الحذف أو نمو درجة الحرارة ، يوفر ACT1-CUP1 معلومات حول التأثيرات على الربط في ظل ظروف نمو الخميرة المثلى.

يتعرف spliceosome على ركيزته من خلال ثلاثة تسلسلات intronic ، وهي موقع لصق 5 '(5' SS) ، وموقع الفرع (BS) ، وموقع لصق 3 '(3' SS). تم إنشاء العديد من مراسلي ACT1-CUP1 الذين يحتويون على تسلسلات غير توافقية في هذه المواقع. يتم عرض مجموعة مختارة من مراسلي ACT1-CUP1 الأكثر شيوعا في الشكل 1 والجدول 1. نظرا لأن spliceosome يتفاعل مع كل موقع لصق بشكل فريد في نقاط مختلفة في دورة الربط ، يمكن اختبار متانة spliceosome في خطوات مختلفة بناء على استخدام المراسل غير الإجماعي. يتم تسمية المراسلين غير التوافقيين على الموقع المتحور داخل intron والقاعدة التي تم تحويرها إليها. على سبيل المثال ، A3c هو مراسل لديه طفرة في 5 'SS ، وتحديدا الموضع 3 من الأدينوزين بالإجماع إلى السيتوزين. سيتفاعل هذا المراسل بقوة مع طفرات spliceosome التي تؤثر على اختيار واستخدام SS 5 '. في دراستهم الأولية ، حدد Lesser و Guthrie أي طفرات SS 5 'تمنع الربط3. في وقت لاحق من نفس العام ، تم نشر مراسلين غير متفقين عليهم في جميع مواقع لصق الثلاثة بواسطة Burgess و Guthrie في شاشة مثبطة للطفرات في ATPase Prp16p9. بمقارنة الإجماع مع المراسلين غير التوافقيين ، كان اختبار ACT1-CUP1 مفتاحا مهما لفهم متانة وانتقائية spliceosome الخميرة واستنتاج وظيفة spliceosomes حقيقيات النوى الأخرى.

نظرا لأن مراسلي ACT1-CUP1 غير المتفق عليهم يقومون بتوعية الجسيم لمزيد من الاضطراب ، يمكن وصف تأثير طفرة عامل الربط الفردي من خلال المراسلين الذين يؤثر عليهم بشكل إيجابي أو سلبي. تم تطبيق هذا على ربط أسئلة البحث بعدة طرق. أولا ، يمكن استخدام اختبار ACT1-CUP1 كفحص جيني للطفرات في عوامل الربط. على سبيل المثال ، يعمل Prp8p ، أكبر بروتين ربط ، كمنصة يحفز عليها قلب الحمض النووي الريبي ل spliceosome تفاعل الربط. تم استنتاج ذلك ، جزئيا ، من خلال كيفية تحسين أو تقليل طفرات Prp8p من الربط بين مراسلي ACT1-CUP1 المختلفين10،11،12،13،14،15،16،17. كما تم فحص مكونات البروتين الأخرى من spliceosome باستخدام ACT1-CUP1 ، بما في ذلك Hsh155p و Cwc2p و Cef1p و Ecm2p18،19،20،21،22،23،24،25. كما تمت دراسة العتبات النشطة ل Prp16p وأربعة ATPases أخرى تشارك في الانتقال spliceosomal مع هذا الفحص9،26،27،28،29،30. كما تمت دراسة الحمض النووي الريبي الصغير (snRNAs) على نطاق واسع باستخدام ACT1-CUP1 لتحديد تسلسلات ما قبل mRNA التي تنسقها والتغيرات في البنية الثانوية التي تمر بها snRNAs أثناء الربط3،31،32،33،34،35،36،37.

يتطلب اختبار ACT1-CUP1 سلالة خميرة حيث تم التخلص من جميع نسخ جين CUP1. نظرا لأن CUP1 يمكن أن يكون له رقم نسخة مرتفع 6,38 ، فإن التحضير لسلالة خروج المغلوب الكاملة يمكن أن يتطلب جولات متعددة أو فحصا مكثفا. نتيجة لذلك ، غالبا ما يتم مشاركة سلالات خميرة cup1Δ بين المختبرات ، كما فعل الصحفيون.

إذا تم تقييم الطفرة (الطفرات) في عامل الربط من نسخة بلازميد ، فيجب التخلص من الجين من النوع البري لهذا العامل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تسمح خلفية الخميرة باختيار اثنين على الأقل من البلازميدات ، أحدهما يحتوي على مراسل ACT1-CUP1 ، تاريخيا على بلازميد اختيار المغذيات الليوسين ، والآخر يحتوي على طفرة أو اضطراب في آلية الربط التي ستتم دراستها (الشكل 2). عادة ، في فحص واحد ، ستختبر سلالات الخميرة المتعددة ، كل منها يحمل اضطراب ربط الاستعلام (QSP) ومراسل مختلف ، تأثير الاستعلام على الربط.

تسمح المتغيرات المستقلة في اختبار ACT1-CUP1 للباحث بتقييم شدة QSP. هذه المتغيرات المستقلة هي تركيز النحاس واختيار العديد من مراسلي الربط غير المتفق عليهم. أولا ، نظرا لأن سلالات الخميرة تزرع على ألواح تحتوي على مجموعة من تركيزات النحاس (الشكل 2) ، فإن إعداد الفحص يتضمن اختيار تدرج التركيزات المستخدمة. يمكن للدراسات استخدام تدرج تركيز النحاس للدورة للحصول على قراءة أولية للجدوى ثم تكرار الفحص بتدرج أدق لتحديد الاختلافات الدقيقة في الجدوى. المتغير الثاني هو النطاق الواسع لمراسلي ACT1-CUP1 الذين يمكن اختبارهم (الشكل 1 والجدول 1). إذا كان QSP يؤثر على صلاحية الخميرة بشكل مختلف في وجود مراسل غير توافقي مقابل النوع البري ، فيمكن التوصل إلى استنتاج مفاده أن QSP يؤثر على خطوة في الربط أو منطقة من spliceosome مهمة أثناء التعرف على أو معالجة تلك المنطقة من الإنترون.

صندوق أدوات الخميرة واسع النطاق ، واختبار ACT1-CUP1 هو جزء لا يتجزأ من أبحاث الربط. غالبا ما يتم إجراء اختبار ACT1-CUP1 جنبا إلى جنب مع تحليل جيني وهيكلي و / أو كيميائي حيوي أكثر تعمقا حول تأثير QSP. نظرا لأن هذه الدراسات الأكثر تفصيلا لها عموما إجراء أطول و / أو سعر أعلى ، فإن النهج المتكرر هو فحص المسوخ المثيرة للاهتمام باستخدام ACT1-CUP1 أولا.

يتم توفيره هنا بروتوكول فحص ACT1-CUP1 ، بما في ذلك تحضير الألواح النحاسية. يوفر هذا الفحص للباحثين إجابة أولية لتأثير QSP على الربط والمناطق الداخلية الأكثر تأثرا بالاضطراب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. بناء سلالة الخميرة

  1. توليد أو الحصول على سلالة S. cerevisiae التي تشمل خلفيتها leu2 و cup1Δ. لتوليد هذه الخلفية ، استخدم طريقة الخميرة الراسخة التي تستخدم أسيتات الليثيوم والحمض النووي39 الذي تقطعت به السبل.
    ملاحظة: قد تحتوي سلالات الخميرة أحادية الصيغة الصبغية على نسخة واحدة أو نسختين أو أكثر من CUP1 6,38. ارجع إلى المعلومات الجينومية لسلالة الخميرة المختارة عند تصميم بادئات خروج المغلوب لإحاطة موقع (مواقع) جين CUP1.
  2. قم بإجراء تحويل الخميرة لدمج QSP إما عن طريق الدمج الجيني أو على البلازميد. استخدم بروتوكولا راسخا مثل تلك الموصوفة في البحث السابق40،41،42.
  3. قم بإجراء تحويل الخميرة مع السلالة (السلالات) الناتجة من الخطوة 1.2. لإضافة بلازميد مراسل ACT1-CUP1 المطلوب.
    ملاحظة: يجب الحفاظ على الخلايا على لوحات ووسائط تسرب الليوسين (-Leu) لضمان الاحتفاظ ببلازميدات مراسل ACT1-CUP1 بعد هذا التحول.
  4. نفذ الخطوات 1.2. و 1.3. لكل QSP وكل بلازميد مراسل ACT1-CUP1 ليتم اختباره ، بما في ذلك سلالات التحكم.

2. إعداد لوحة النحاس

  1. حدد نطاق تركيز النحاس الذي يناسب المراسلين المراد اختبارهم (انظر الجدول 1 لمعرفة فتك المراسلين الذين يستخدمون بشكل متكرر).
    ملاحظة: مثال على نطاق تركيز النحاس الشامل هو 30 تركيزا مختلفا للنحاس من 0 mM، 0.025 mM، 0.05 mM، 0.075 mM، 0.1 mM، 0.15 mM، 0.2 mM، 0.25 mM، 0.3 mM، 0.35 mM، 0.4 mM، 0.45 mM، 0.5 mM، 0.6 mM، 0.7 mM، 0.8 mM، 0.9 mM، 1.0 mM، 1.1 mM، 1.2 mM، 1.3 mM، 1.4 مليM، 1.5 mM، 1.6 mM، 1.7 mM، 1.8 mM، 1.9 mM، 2.0 mM، 2.25 mM، و 2.5 mM Cu2+.
  2. اصنع محلول مخزون من 1 M CuSO4 ومرشح معقم من خلال مرشح معقم PES (polyethersulfone) 0.22 ميكرومتر.
  3. لكل صفيحة نحاسية مرغوبة ، قم بإعداد تخفيف 2 مل من مخزون CuSO4 في ماء معقم.
    ملاحظة: نظرا لأن اللوحة التي تحتوي على 0 mM Cu 2+ سيتم دائما تحليلها وتصويرها كمرجع ، فمن المستحسن عمل لوحين 0 mM Cu2+ ، أحدهما في البداية والآخر في نهاية خطوة الطلاء (الخطوة 3.4.).
    1. احسب كمية المخزون لتركيز النحاس النهائي المطلوب في 40 مل من حجم اللوحة (الجدول التكميلي 1).
    2. أضف الكمية المحسوبة من الماء المعقم ومخزون 1 M CuSO4 إلى أنبوب معقم سعة 2 مل.
  4. صب لوحات لفحص ACT1-CUP1.
    ملاحظة: بديل للبروتوكول أدناه هو الجمع بين الوسائط والأجار في البداية في حاوية كبيرة والقسمة بعد التعقيم في حاويات أصغر لتحقيق تركيزات نحاسية مختلفة لكل لوحة. أيا كانت الطريقة المتبعة ، من المهم التأكد من أن تركيز الوسائط متسق بين جميع الألواح على الرغم من أن لكل منها تركيز نحاسي مختلف.
    1. قم بتسمية كل طبق فارغ ليتم سكبه بتركيز النحاس النهائي الذي سيحتوي عليه. قم بإعداد لوحة مربعة واحدة على الأقل لكل تركيز نحاسي ليتم اختبارها.
    2. قم بتسمية زجاجة 100 مل لكل تركيز نحاسي ليتم اختبارها.
    3. أضف إلى كل زجاجة 790 مجم من أجار (2٪ وزن / وزن أجار) وقضيب تقليب.
    4. في دورق كبير ، امزج وسائط النمو -Leu لصب جميع الألواح النحاسية. لكل طبق يتم صنعه ، قم بإذابة 265 مجم من قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) و 64 مجم من مزيج التسرب ناقص الليوسين (وأي مغذيات أخرى قد تكون مطلوبة للحفاظ على بلازميد QSP في الخلايا) في 34 مل من الماء منزوع الأيونات.
    5. أضف 34 مل من محلول وسائط النمو -Leu إلى كل زجاجة سعة 100 مل معدة وغطاء بورق الألمنيوم. قم بتسمية الرقاقة بتركيز النحاس المقصود.
    6. الأوتوكلاف لتعقيم وحل أجار باستخدام دورة السائل الموصى بها للأوتوكلاف.
    7. في أسرع وقت ممكن ، أضف 4 مل من 20٪ وزن / فولت جلوكوز (معقم مصفى) إلى كل زجاجة.
    8. قم بمطابقة الملصقات وأضف التخفيفات 2 مل من CuSO4 إلى الزجاجة المقصودة.
      ملاحظة: نظرا لأنه يمكن تصنيع عشرات الألواح النحاسية في نفس الوقت ، ولكل منها تركيز مختلف ، فإن وضع علامات على جميع الزجاجات والأنابيب والألواح بوضوح بتركيز النحاس المقصود سيمنع الارتباك أثناء صب اللوحة.
    9. استخدم صفيحة تقليب للخلط لمدة ~ 30 ثانية وصب أو ماصة 35 مل في اللوحة المصنفة ، وتجنب الفقاعات. اتركيه ليبرد قبل التخزين أو الاستخدام.
      ملاحظة: في كثير من الأحيان ، تصنع لوحات 1 يوم أو 2 أيام قبل الفحص وتخزينها في 4 °C حتى بضع ساعات قبل الاستخدام. يجب أن تكون الألواح في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل بدء الطلاء (الخطوة 3.4.).

3. مقايسة ACT1-CUP1

  1. قم بإخراج السلالات المرغوبة على ألواح -Leu.
    ملاحظة: في حالة العمل من مخزون التبريد ، يجب توخي الحذر لضمان إحياء الخلايا بشكل كاف من التخزين قبل الطلاء. الإجراء الموصى به لذلك هو الخروج من المخزون المبرد والسماح له بالنمو لمدة 3-5 أيام عند 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، أعد وضع حامل صغير واتركه ينمو لمدة 2-3 أيام أخرى عند 30 درجة مئوية.
  2. قم بتنمية الثقافات الليلية في 10 مل من الوسائط.
    1. قم بإعداد وسائط نمو -Leu باستخدام نفس النسب الموضحة في الخطوة 2.4.2. لكل 10 مل من الوسائط ، أضف 66 مجم من قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) و 16 مجم من مزيج التسرب ناقص الليوسين إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات. تمر عبر مرشح معقم PES 0.22 ميكرومتر.
    2. لكل سلالة خميرة ، أضف 9 مل من وسائط نمو -Leu و 1 مل من 20٪ وزن / فولت جلوكوز (معقم مصفى) إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
    3. باستخدام عصا معقمة أو طرف ماصة ، اجمع عينة صغيرة (~ 1 مم) من الخميرة وقم بتلقيح الوسائط.
    4. هز جميع الثقافات الليلية عند 180 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا كانت متوفرة، يمكن استخدام الدوارات بدلا من الاهتزاز.
  3. تمييع السلالات إلى OD600 0.5 ± 0.05 في 10 ٪ الجلسرين.
    1. لكل سلالة ، أضف 100 ميكرولتر من الثقافة إلى كوفيت يحتوي على 900 ميكرولتر من الماء.
    2. قم بقياس OD600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    3. احسب التخفيف المطلوب ليكون عندOD 600 من 0.5 في الحجم النهائي 2 مل.
    4. تمييع كل سلالة إلى OD600 0.5 في 10 ٪ الجلسرين (معقمة).
    5. أعد قياس OD600 للتأكد من أن كثافة الخلية ضمن النطاق المطلوب من 0.5 ± 0.05.
  4. لوحة السلالات على لوحات النحاس.
    ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لطلاء السلالات ، بما في ذلك السحب اليدوي لأحجام 5-10 ميكرولتر ، باستخدام ماصة متكررة أو متعددة القنوات ، أو الختم باستخدام مكرر دبوس. يتم وصف هذه الطريقة الأخيرة أدناه ، على الرغم من أن معظم الخطوات ستكون متشابهة بغض النظر عن الطريقة.
    1. قم بإعداد موقع عمل معقم وموقد بنسن مضاء.
    2. بالنسبة لجهاز النسخ المتماثل المكون من 48 سنا ، ماصة 200 ميكرولتر من كل سلالة مخففة في بئر منفصل من لوحة 96 بئر. املأ المساحات الفارغة في الشبكة 6 × 8 ب 200 ميكرولتر من 10٪ من الجلسرين (معقم).
      ملاحظة: يوجد مثال على مخطط الطلاء لتسع سلالات خميرة في الجدول التكميلي 2.
    3. اغمس جهاز النسخ المتماثل في طبق ضحل من الإيثانول بنسبة 95٪ (v / v) واللهب لتعقيمه. اتركه يبرد لمدة 2 دقيقة على الأقل بعد إطفاء اللهب لتجنب الحرارة التي تصدم الخلايا.
    4. ضع أربع لوحات بالقرب من الموقد وأزل الأغطية.
    5. اغمس جهاز النسخ المتماثل في لوحة 96 بئرا وارفعه لأعلى بحركة واحدة سريعة.
    6. ضعه برفق على الطبق وصخر برفق ذهابا وإيابا لتسهيل النقل الجيد.
    7. ارفع لأعلى بحركة سريعة واحدة وضعها في نفس الاتجاه بالضبط في لوحة 96 بئر.
    8. كرر لما يصل إلى ثلاث لوحات أخرى. كرر عملية غمس جهاز النسخ المتماثل في الإيثانول ، واللهب للتعقيم ، والانتظار لتبرد كل أربع أطباق.
    9. بعد طلاء الصفيحة ، تحرك بحركة سلسة إلى الجانب ولكن لا يزال داخل مظلة التعقيم للهب.
      ملاحظة: يوصى بعمل تخفيفات الخميرة والطلاء بالقرب من اللهب. يمكن أن تتلوث الألواح بسهولة أثناء التجفيف.
    10. اترك الأطباق تجف تماما قبل وضع الأغطية ، عادة 3-5 دقائق.
    11. احتضان الأطباق لمدة 3 أيام عند 30 درجة مئوية.

4. جمع البيانات وتحليلها

  1. قم بإزالة الألواح من الحاضنة وافحصها بصريا.
  2. سجل صور اللوحات باستخدام كاميرا متاحة أو نظام تصوير رقمي آخر.
  3. سجل (أو يسجل) لكل سلالة لوحظ آخر نمو مرئي لتركيز النحاس.
    ملاحظة: الخلايا قادرة على لصق وتبقى قابلة للحياة حتى هذا التركيز. من أجل الاتساق ، استخدم دائما نفس الطريقة ، إما بالعين أو من صور اللوحة ، لتسجيل آخر تركيز نحاسي قابل للتطبيق. المستعمرات الصغيرة جدا مرئية في بعض الأحيان بالعين ولكن ليس على الصورة. الفرق بين الفحص البصري المباشر أو التسجيل من الصور صغير ، وعادة ما يكون خطوة في التدرج. نظرا لأن صور المستعمرات غالبا ما تستخدم في المنشورات ، يوصى بالتسجيل بواسطة الصور.
  4. اجمع البيانات من مقايسات ACT1-CUP1 المتعددة لنفس السلالة لاستخلاص استنتاجات حول كيفية تأثير QSP على الربط.
    ملاحظة: تظهر أرقام النشر عادة صورا لمستعمرات الخميرة بتركيز 0 mM Cu2+ ، وآخر تركيز نحاسي قابل للحياة ، والتركيز اللاحق حيث ماتت المستعمرة. يمكن أيضا عرض البيانات كرسم بياني شريطي مع أشرطة خطأ للانحراف المعياري بين النسخ المتماثلة. لا تحتاج البيانات إلى التطبيع ولكن يمكن أن تكون عن طريق تحديد صلاحية التحكم في عامل الربط WT إلى 1 ومقارنة تأثير الطفرة (الطفرات) المقدمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تتطلب فحوصات النمو ، مثل ACT1-CUP1 ، تقييما بصريا ومقارنا لمستعمرات متعددة. هنا ، نمت كل سلالة إلى التشبع بين عشية وضحاها ، وتم تخفيفها إلى OD600 من 0.5 ، ومطلية على 20 لوحة تحتوي على مجموعة من تركيزات النحاس من 0 mM إلى 1.1 mM CuSO4 (الشكل 3). هذا النطاق أصغر من النطاق المدرج في ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ACT1-CUP1 هو اختبار نمو ، ويجب توخي الحذر للتأكد من أن اختلافات النمو الملحوظة لا يمكن أن تعزى إلا إلى عيوب الربط. يجب التعامل مع جميع السلالات بطريقة مماثلة قبل الطلاء ، بما في ذلك وجود نفس الطول والنوع من ظروف النمو والتخزين. في حالة استخدام سلالات حساسة لدرجة الحرارة ، يجب إجراء فحوصات ACT1-CUP1 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

Acknowledgements

شكرا لآرون هوسكينز وأعضاء مختبر هوسكينز في جامعة ويسكونسن ماديسون لاستخدام سلالات الخميرة والمعدات في توليد الأشكال 3-5. شكرا لهاربريت كور وشينغيانغ فو على تعليقاتهما الثاقبة على المخطوطة. شكرا للطلاب والموظفين وأعضاء هيئة التدريس الداعمين في جامعة نورث ويست أثناء كتابة هذه الورقة وتحريرها وتصويرها. شكرا لإيزابيل ماراسيغان للمساعدة في تصوير هذه الطريقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-129Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-138Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubesFisher Scientific07-201-332Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplateFisher Scientific07-200-760Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanolFisher Scientific22-032-600Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm)CellTreat Scientific Products229707Or comparable item from a different manufacturer.
AgarFisher ScientificBP1423-500Any molecular grade agar will work.
AutoclaveTuttnauer3870EAOr comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burnerHumboldtPN6200.1Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density MeterVWR490005-906Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate PentahydrateFisher ScientificLC134051Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging systemCytiva29399481ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu)USBiological Life SciencesD9525Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-GlucoseFisher ScientificAAA1682836Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying softwareCytiva29-0006-05ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held cameraNikonD3500Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging deviceCytiva29238583Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clampFisher Scientific05-769-7QOr comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clampFisher Scientific12-000-101Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir barsFisher Scientific14-513-51Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicatorVP ScientificVP 407AH
Semi-micro disposable cuvettesVWR97000-590Or comparable item from a different manufacturer.
ShakerJEIO TechIST-3075Or comparable item from a different manufacturer.
SpectrophotometerBiowave80-3000-45Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square platesVWR102091-156Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plateFisher Scientific11-520-16SOr comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen baseUSBiological Life SciencesY2025Or comparable item from a different manufacturer.

References

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315(2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816(2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184 mRNA Saccharomyces cerevisiae spliceosome ACT1 CUP1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved