Ensaios de ACT1-CUP1 determinam as sensibilidades específicas do substrato de mutantes spliceossomais em leveduras em brotamento

Resumo

O ensaio ACT1-CUP1, um ensaio de crescimento de cobre, fornece uma leitura rápida do splicing de RNA mensageiro precursor (pré-mRNA) e do impacto que os fatores de splicing mutantes têm na função spliceossomal. Este estudo fornece um protocolo e destaca a personalização possível para abordar a questão do splicing de interesse.

Resumo

Mutações introduzidas no spliceossomo ou em seu substrato contribuíram significativamente para a nossa compreensão dos meandros da função spliceossomal. Sejam relacionadas à doença ou funcionalmente selecionadas, muitas dessas mutações foram estudadas usando ensaios de crescimento no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae (levedura). O ensaio de crescimento de cobre específico de splicing, ou ensaio ACT1-CUP1, fornece uma análise abrangente da mutação no nível fenotípico. O ensaio ACT1-CUP1 utiliza repórteres que conferem tolerância ao cobre quando emendados corretamente. Assim, na presença de cobre, as mudanças na viabilidade da levedura se correlacionam com mudanças na produção de mRNA através do splicing. Em um experimento típico, o spliceossomo de levedura é desafiado com diferentes repórteres de emenda não consensuais e a mutação do fator de emenda de interesse para detectar qualquer impacto sinérgico ou antitético no splicing. Aqui uma descrição completa da preparação da placa de cobre, chapeamento de células de levedura e avaliação de dados são dadas. Uma seleção de experimentos complementares é descrita, destacando a versatilidade dos repórteres ACT1-CUP1. O ensaio ACT1-CUP1 é uma ferramenta útil na caixa de ferramentas de splicing graças à leitura direta do(s) efeito(s) mutacional(is) e às possibilidades comparativas do uso contínuo no campo.

Introdução

O spliceossomo é uma grande máquina biológica que catalisa a remoção de íntrons, regiões não codificantes, no RNA mensageiro precursor (pré-mRNA)^1,2. Caracterizar o efeito de um único mutante pontual em 1 das quase 100 proteínas e 5 RNAs não codificantes é muitas vezes ambíguo ao estudar a proteína ou RNA isoladamente. A mudança na função do componente mutado pode ser melhor avaliada in vivo no contexto do spliceossomo completo e funcional.

O ensaio de crescimento de cobre descrito aqui é um indicador rápido da eficiência de splicing em Saccharomyces cerevisiae ou levedura em brotamento. Desenvolvido por C.F. Lesser e C. Guthrie e publicado em 1993, este ensaio combina a facilidade de trabalhar com um organismo modelo simples e a leitura direta da viabilidade celular³. A viabilidade se correlaciona com o quão bem os spliceossomos nessas células podem reconhecer e emendar o transcrito do repórter.

Este ensaio de crescimento de cobre é mais comumente chamado de ensaio ACT1-CUP1. O nome ACT1-CUP1 origina-se dos dois genes fundidos para criar um repórter de eficiência de splicing. ACT1 é o gene da actina da levedura, que é altamente expresso e tem um íntron eficientemente emendado ^4,5. Cup1p é um quelante de cobre que sequestra o cobre na célula para evitar interferências com as funções celulares regulares ^6,7,8. O relator ACT1-CUP1 contém esses genes em sequência tal que CUP1 está no quadro de leitura adequado somente se ocorrer splicing pré-mRNA do íntron de ACT1 (Figura 1). A proteína de fusão resultante contém os primeiros 21 aminoácidos da actina e a proteína Cup1p de comprimento total, o que aumenta a viabilidade da levedura em um ambiente rico em cobre³. Assim, um aumento na quantidade de splicing do repórter resulta em uma maior concentração de Cup1p e uma maior resistência ao cobre (Figura 1). Em comparação com outros genes repórteres, o CUP1 afeta a viabilidade celular mesmo em níveis baixos, tem uma ampla faixa de sensibilidade e pode ser usado para selecionar diretamente mutações^de splicing ^3,6,7. Além disso, a CUP1 não é essencial para o crescimento padrão de leveduras e, portanto, a homeostase celular não é afetada durante a configuração deste ensaio. Complementar aos ensaios de exclusão ou crescimento de temperatura, o ACT1-CUP1 fornece informações sobre os efeitos no splicing sob condições ideais de crescimento de leveduras.

O spliceossomo reconhece seu substrato através de três sequências intrônicas, a saber, o local de emenda de 5' (5' SS), o local de ramificação (BS) e o local de emenda de 3' (3' SS). Numerosos repórteres ACT1-CUP1 foram gerados contendo sequências não consensuais nesses locais. Uma seleção dos repórteres ACT1-CUP1 mais comuns é mostrada na Figura 1 e na Tabela 1. Como o spliceossomo interage com cada local de emenda exclusivamente em diferentes pontos do ciclo de emenda, a robustez do spliceossomo pode ser testada em diferentes etapas com base nas quais o repórter não consensual é usado. Repórteres não consensuais são nomeados para a posição mutada dentro do íntron e a base para a qual ele foi mutado. Por exemplo, A3c é um repórter com uma mutação no SS 5', especificamente a posição 3 da adenosina de consenso para uma citosina. Este repórter irá interagir fortemente com mutações de spliceossomas que afetam a seleção e o uso de SS de 5'. Em seu estudo inicial, Lesser e Guthrie determinaram quais mutações de 5' SS inibiram o splicing³. Mais tarde, no mesmo ano, repórteres não consensuais em todos os três locais de emenda foram publicados por Burgess e Guthrie em uma tela supressora de mutações na ATPase Prp16p⁹. Comparando o consenso com os repórteres não consensuais, o ensaio ACT1-CUP1 tem sido uma chave importante para a compreensão da robustez e seletividade do spliceossomo de levedura e para inferir a função dos spliceossomos de outros eucariotos.

À medida que os repórteres ACT1-CUP1 não consensuais sensibilizam o spliceossomo para uma perturbação adicional, o impacto de uma única mutação do fator de splicing pode ser caracterizado através dos repórteres que impacta positiva ou negativamente. Isso tem sido aplicado ao splicing de perguntas de pesquisa de várias maneiras. Primeiro, o ensaio ACT1-CUP1 pode e tem sido usado como uma triagem genética para mutações em fatores de splicing. Por exemplo, Prp8p, a maior proteína de splicing, serve como uma plataforma sobre a qual o núcleo de RNA do spliceossomo catalisa a reação de splicing. Isso foi deduzido, em parte, através de como os mutantes Prp8p melhoraram ou reduziram o splicing de diferentes repórteres ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Outros componentes proteicos do spliceossomo também foram investigados usando ACT1-CUP1, incluindo Hsh155p, Cwc2p, Cef1p e Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Os limiares energéticos para Prp16p e outras quatro ATPases envolvidas na transição spliceossômica também foram estudados com este ensaio 9,26,27,28,29,30. Os pequenos RNAs nucleares (snRNAs) também têm sido extensivamente estudados utilizando ACT1-CUP1 para identificar as sequências de pré-mRNA que coordenam e as mudanças na estrutura secundária que os snRNAs sofrem durante o splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.

O ensaio ACT1-CUP1 requer uma cepa de levedura onde todas as cópias do gene CUP1 foram eliminadas. Como o CUP1 pode ter um número de cópia alto ^6,38, a preparação de uma cepa completa de nocaute pode exigir várias rodadas ou triagem extensiva. Como resultado, as cepas de levedura cup1Δ têm sido frequentemente compartilhadas entre laboratórios, assim como os repórteres.

Se a(s) mutação(ões) em um fator de splicing estiver sendo avaliada a partir de uma cópia plasmídica, o gene do tipo selvagem para esse fator deve ser eliminado. Além disso, o fundo de levedura deve permitir a seleção de pelo menos dois plasmídeos, um contendo um repórter ACT1-CUP1, historicamente em um plasmídeo de seleção de nutrientes de leucina, e outro contendo uma mutação ou perturbação na maquinaria de splicing que será estudada (Figura 2). Normalmente, em um único ensaio, várias cepas de levedura, cada uma carregando a perturbação de emenda de consulta (QSP) e um repórter diferente, testarão o impacto da consulta no splicing.

As variáveis independentes no ensaio ACT1-CUP1 permitem ao pesquisador avaliar a gravidade de um QSP. Essas variáveis independentes são a concentração de cobre e a seleção de múltiplos repórteres de splicing não consensuais. Em primeiro lugar, uma vez que as estirpes de levedura são cultivadas em placas contendo uma gama de concentrações de cobre (Figura 2), a configuração do ensaio inclui a selecção do gradiente de concentrações utilizadas. Os estudos podem utilizar um gradiente de concentração de cobre de curso para obter uma leitura inicial da viabilidade e, em seguida, repetir o ensaio com um gradiente mais fino para identificar diferenças sutis de viabilidade. A segunda variável é a ampla gama de repórteres ACT1-CUP1 possíveis de testar (Figura 1 e Tabela 1). Se o QSP impacta a viabilidade da levedura de forma diferente na presença de um repórter não consensual versus do tipo selvagem, pode-se concluir que o QSP afeta uma etapa no splicing ou uma região do spliceossomo importante durante o reconhecimento ou processamento dessa região do intron.

A caixa de ferramentas de levedura é extensa e o ensaio ACT1-CUP1 é parte integrante da pesquisa de emenda. O ensaio ACT1-CUP1 é frequentemente realizado juntamente com uma análise genética, estrutural e/ou bioquímica mais aprofundada sobre o impacto de um QSP. Como esses estudos mais detalhados geralmente têm um procedimento mais demorado e / ou preço mais alto, uma abordagem frequente é a triagem de mutantes interessantes com ACT1-CUP1 primeiro.

Fornecido aqui é um protocolo de ensaio ACT1-CUP1, incluindo a preparação da placa de cobre. Este ensaio fornece aos pesquisadores uma resposta inicial para o efeito de um QSP no splicing e quais regiões intrônicas são mais afetadas pela perturbação.

Protocolo

1. Construção da cepa de levedura

1. Gerar ou obter uma cepa de S. cerevisiae cujo fundo inclua leu2 e cup1Δ. Para gerar esse pano de fundo, use o método de levedura bem estabelecido que emprega acetato de lítio e DNA de fita simples³⁹.
   NOTA: As estirpes de levedura haploide podem conter uma, duas ou mais cópias de CUP1 ^6,38. Consulte as informações genômicas para a cepa de levedura selecionada ao projetar primers knock-out para flanquear a(s) localização(ões) do gene CUP1.
2. Realizar uma transformação de levedura para incorporar o QSP através da incorporação genômica ou em um plasmídeo. Utilizar um protocolo bem estabelecido, como os descritos em pesquisas anteriores^40,41,42.
3. Efectuar uma transformação de levedura com a(s) estirpe(ns) resultante(s) do passo 1.2. para adicionar o plasmídeo do relator ACT1-CUP1 desejado.
   NOTA: As células devem ser mantidas em placas e meios de gota de leucina (-Leu) para garantir a retenção dos plasmídeos repórteres ACT1-CUP1 após essa transformação.
4. Execute as etapas 1.2. e 1.3. para cada QSP e cada plasmídeo reportador ACT1-CUP1 a ensaiar, incluindo estirpes de controlo.

2. Preparação da placa de cobre

1. Selecione uma faixa de concentração de cobre que se adapte aos repórteres a serem testados (consulte a Tabela 1 para a letalidade dos repórteres usados com frequência).
   NOTA: Um exemplo de uma faixa abrangente de concentração de cobre são 30 concentrações diferentes de cobre de 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM e 2,5 mM²⁺.
2. Faça uma solução-mãe de 1 M CuSO₄ e filtro estéril através de um filtro estéril PES (polietersulfona) de 0,22 μm.
3. Por placa de cobre desejada, prepare uma diluição de 2 mL do estoque de CuSO₄ em água estéril.
   NOTA: Como a placa com 0 mM 2+ será sempre analisada e fotografada como referência, recomenda-se fazer duas placas 0 mM²⁺, uma no início e outra no final da etapa de chapeamento (etapa 3.4.).
   1. Calcular a quantidade de estoque para a concentração final desejada de cobre em 40 mL do volume da placa (Tabela Suplementar 1).
   2. Adicione a quantidade calculada de água estéril e 1 M CuSO₄ a um tubo estéril de 2 mL.
4. Despeje placas para o ensaio ACT1-CUP1.
   NOTA: Uma alternativa ao protocolo abaixo é combinar inicialmente o meio e o ágar em um recipiente grande e alíquota após a autoclave em recipientes menores para atingir diferentes concentrações de cobre para cada placa. Qualquer que seja o método adotado, é importante garantir que a concentração do meio seja consistente entre todas as placas, apesar de cada uma ter uma concentração de cobre diferente.
   1. Rotule cada placa vazia a ser derramada com a concentração final de cobre que ela conterá. Preparar pelo menos uma placa quadrada por concentração de cobre a ensaiar.
   2. Rotule um frasco de 100 mL por concentração de cobre a ser testado.
   3. A cada frasco, adicione 790 mg de ágar (2% p/v de ágar) e uma barra de agitação.
   4. Em um copo grande, combine o meio de crescimento -Leu para que todas as placas de cobre sejam derramadas. Por placa a ser feita, dissolver 265 mg de levedura à base de nitrogênio (YNB) e 64 mg de mistura drop-out menos leucina (e quaisquer outros nutrientes que possam ser necessários para manter o plasmídeo QSP nas células) em 34 mL de água deionizada.
   5. Adicione 34 mL da solução de meio de crescimento -Leu a cada frasco preparado de 100 mL e cubra com papel alumínio. Rotule a folha com a concentração de cobre pretendida.
   6. Autoclave para esterilizar e dissolver o ágar usando o ciclo líquido recomendado para a autoclave.
   7. O mais rapidamente possível, adicione 4 mL de glicose a 20% p/v (filtrada estéril) a cada frasco.
   8. Combine os rótulos e adicione as diluições de 2 ml de CuSO₄ ao frasco pretendido.
      NOTA: Como dezenas de placas de cobre podem ser feitas ao mesmo tempo, cada uma com uma concentração diferente, rotular todas as garrafas, tubos e placas claramente com a concentração de cobre pretendida evitará confusão durante o derramamento da placa.
   9. Use uma placa de agitação para misturar por ~ 30 s e despeje ou pipete 35 mL na placa rotulada, evitando bolhas. Deixe esfriar antes de armazenar ou usar.
      NOTA: Frequentemente, as placas são feitas com 1 dia ou 2 dias de antecedência do ensaio e armazenadas a 4 °C até algumas horas antes da utilização. As placas devem estar à temperatura ambiente (RT) antes do início do chapeamento (etapa 3.4.).

3. Ensaio ACT1-CUP1

1. Retire as cepas desejadas nas placas -Leu.
   NOTA: Se trabalhar a partir de existências criogênicas, deve-se tomar cuidado para garantir que as células sejam suficientemente revividas do armazenamento antes do revestimento. Um procedimento recomendado para isso é riscar do estoque criogênico e permitir que ele cresça por 3-5 dias a 30 °C. Em seguida, restreak uma pequena amostra e deixá-lo crescer por mais 2-3 dias a 30 ° C.
2. Cultivar culturas noturnas em 10 mL de meio.
   1. Preparar o meio de crescimento -Leu utilizando os mesmos rácios descritos no passo 2.4.2. Por 10 mL de meio, adicione 66 mg de levedura à base de nitrogênio (YNB) e 16 mg de mistura drop-out menos leucina a 9 mL de água deionizada. Passe por um filtro estéril PES de 0,22 μm.
   2. Por cepa de levedura, adicione 9 mL de meio de crescimento -Leu e 1 mL de glicose a 20% p/v (filtrada estéril) a um tubo cônico estéril de 50 mL.
   3. Usando uma vara estéril ou ponta de pipeta, reúna uma pequena amostra (~ 1 mm redonda) de levedura e inocular o meio.
   4. Agitar todas as culturas durante a noite a 180 rpm e 30 °C.
      NOTA: Se disponível, os rotadores podem ser usados em vez de um agitador.
3. Diluir as cepas para um OD₆₀₀ 0,5 ± 0,05 em glicerol a 10%.
   1. Por estirpe, adicionar 100 μL de cultura a uma cubeta contendo 900 μL de água.
   2. Meça o OD₆₀₀ com um espectrofotômetro.
   3. Calcular a diluição necessária a uma DO₆₀₀ de 0,5 num volume final de 2 ml.
   4. Diluir cada cepa para OD₆₀₀ 0,5 em 10% de glicerol (estéril).
   5. Remeça o OD₆₀₀ para confirmar que a densidade da célula está dentro da faixa desejada de 0,5 ± 0,05.
4. Chapear as tensões nas placas de cobre.
   NOTA: Uma variedade de métodos pode ser usada para chapear as cepas, incluindo pipetagem manual de volumes de 5-10 μL, usando um pipetador repetido ou multicanal ou carimbando com um replicador de pinos. Este último método é descrito abaixo, embora a maioria das etapas seja semelhante, independentemente do método.
   1. Configure um local de trabalho estéril e um queimador Bunsen iluminado.
   2. Para um replicador de 48 pinos, pipete 200 μL de cada cepa diluída em um poço separado de uma placa de 96 poços. Preencha os espaços vazios na grade 6 x 8 com 200 μL de glicerol a 10% (estéril).
      NOTA: Um exemplo de um esquema de chapeamento para nove cepas de levedura está na Tabela Suplementar 2.
   3. Mergulhe o replicador em um prato raso de 95% (v/v) de etanol e chamas para esterilizar. Deixe esfriar por pelo menos 2 minutos após a chama se extinguir para evitar o choque térmico das células.
   4. Coloque quatro placas perto do queimador e retire as tampas.
   5. Mergulhe o replicador na placa de 96 poços e levante-o em um movimento rápido.
   6. Coloque suavemente sobre o prato e agite levemente para frente e para trás para facilitar uma boa transferência.
   7. Levante em um movimento rápido e coloque exatamente na mesma orientação na placa de 96 poços.
   8. Repita para até três outras placas. Repita o processo de mergulhar o replicador em etanol, inflamando para esterilizar e esperando para resfriar a cada quatro placas.
   9. Depois que uma placa tiver sido chapeada, mova-se com um movimento suave para o lado, mas ainda dentro do guarda-chuva de esterilização da chama.
      NOTA: Recomenda-se fazer as diluições de levedura e chapeamento perto de uma chama. As placas podem facilmente ficar contaminadas durante a secagem.
   10. Deixe as placas secarem completamente antes de colocar as tampas, geralmente 3-5 min.
   11. Incubar as placas durante 3 dias a 30 °C.

4. Coleta e análise dos dados

1. Remova as placas da incubadora e inspecione-as visualmente.
2. Grave as imagens das placas com uma câmera disponível ou outro sistema de imagem digital.
3. Registre (ou pontuação) para cada cepa a última concentração de cobre visível é observada.
   NOTA: As células são capazes de emendar e permanecer viáveis até essa concentração. Para maior consistência, use sempre o mesmo método, seja a olho ou a partir das imagens da placa, para pontuar a última concentração viável de cobre. Colônias muito pequenas às vezes são visíveis pelo olho, mas não na imagem. A diferença entre inspeção visual direta ou gravação de imagens é pequena, geralmente um passo no gradiente. Como as imagens das colônias são frequentemente usadas em publicações, recomenda-se a pontuação pelas imagens.
4. Combine dados de vários ensaios ACT1-CUP1 para a mesma cepa para tirar conclusões sobre como o QSP afeta o splicing.
   NOTA: Os números de publicação costumam mostrar imagens das colônias de leveduras na concentração de 0 mM²⁺ , a última concentração viável de cobre e a concentração subsequente onde a colônia morreu. Os dados também podem ser exibidos como um gráfico de barras com barras de erro para o desvio padrão entre as replicações. Os dados não precisam ser normalizados, mas podem ser definidos pela viabilidade do controle do fator de splicing WT como 1 e comparando o efeito da(s) mutação(ões) introduzida(s).

Resultados

Ensaios de crescimento, como ACT1-CUP1, requerem a avaliação visual e comparativa de múltiplas colônias. Aqui, cada cepa foi cultivada até a saturação durante a noite, diluída para uma OD₆₀₀ de 0,5 e banhada em 20 placas contendo uma faixa de concentrações de cobre de 0 mM a 1,1 mM CuSO₄ (Figura 3). Esse intervalo é menor do que o listado no protocolo, pois permitiu a avaliação completa do impacto dos QSPs e dos repórteres ACT1-CUP1 usados e descritos abai...

Discussão

ACT1-CUP1 é um ensaio de crescimento, e deve-se tomar cuidado para garantir que as diferenças de crescimento observadas só possam ser atribuídas a defeitos de splicing. Todas as cepas devem ser manuseadas de forma semelhante antes do revestimento, incluindo um comprimento e tipo semelhantes de condições de crescimento e armazenamento. Se utilizarem estirpes sensíveis à temperatura, os ensaios ACT1-CUP1 só devem ser realizados em condições em que essas estirpes cresçam de forma comparável à do tipo selvagem....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-138	Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	07-201-332	Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate	Fisher Scientific	07-200-760	Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol	Fisher Scientific	22-032-600	Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm)	CellTreat Scientific Products	229707	Or comparable item from a different manufacturer.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Any molecular grade agar will work.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner	Humboldt	PN6200.1	Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter	VWR	490005-906	Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate	Fisher Scientific	LC134051	Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera	Nikon	D3500	Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp	Fisher Scientific	05-769-7Q	Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp	Fisher Scientific	12-000-101	Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-51	Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator	VP Scientific	VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes	VWR	97000-590	Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker	JEIO Tech	IST-3075	Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer	Biowave	80-3000-45	Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates	VWR	102091-156	Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate	Fisher Scientific	11-520-16S	Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base	USBiological Life Sciences	Y2025	Or comparable item from a different manufacturer.