Les tests ACT1-CUP1 déterminent les sensibilités spécifiques au substrat des mutants splicéosomaux chez la levure bourgeonnante

Résumé

Le test ACT1-CUP1, un test de croissance du cuivre, fournit une lecture rapide de l’épissage de l’ARN messager précurseur (pré-ARNm) et de l’impact des facteurs d’épissage mutant sur la fonction splicéosomale. Cette étude fournit un protocole et met en évidence la personnalisation possible pour répondre à la question d’épissage d’intérêt.

Résumé

Les mutations introduites dans le splicéosome ou son substrat ont contribué de manière significative à notre compréhension des subtilités de la fonction splicéosomale. Qu’elles soient liées à la maladie ou fonctionnellement sélectionnées, bon nombre de ces mutations ont été étudiées à l’aide de tests de croissance chez l’organisme modèle Saccharomyces cerevisiae (levure). Le test de croissance du cuivre spécifique à l’épissage, ou test ACT1-CUP1, fournit une analyse complète de la mutation au niveau phénotypique. Le test ACT1-CUP1 utilise des rapporteurs qui confèrent une tolérance au cuivre lorsqu’ils sont correctement épissés. Ainsi, en présence de cuivre, les changements dans la viabilité de la levure sont en corrélation avec les changements dans la production d’ARNm par épissage. Dans une expérience typique, le splicéosome de levure est mis au défi avec différents rapporteurs d’épissage non consensuels et la mutation du facteur d’épissage d’intérêt pour détecter tout impact synergique ou antithétique sur l’épissage. Ici, une description complète de la préparation des plaques de cuivre, du placage des cellules de levure et de l’évaluation des données est donnée. Une sélection d’expériences complémentaires est décrite, soulignant la polyvalence des rapporteurs ACT1-CUP1. Le test ACT1-CUP1 est un outil pratique dans la boîte à outils d’épissage grâce à la lecture directe des effets mutationnels et aux possibilités comparatives de l’utilisation continue sur le terrain.

Introduction

Le spliceosome est une grande machine biologique qui catalyse l’élimination des introns, régions non codantes dans l’ARN messager précurseur (pré-ARNm)^1,2. Caractériser l’effet d’un mutant ponctuel unique dans 1 des près de 100 protéines et 5 ARN non codants est souvent ambigu lors de l’étude de la protéine ou de l’ARN isolément. Le changement dans la fonction du composant muté peut être mieux évalué in vivo dans le contexte du spliceosome complet et fonctionnel.

Le test de croissance du cuivre décrit ici est une mesure rapide de l’efficacité de l’épissage chez Saccharomyces cerevisiae ou levure bourgeonnante. Développé par C.F. Lesser et C. Guthrie et publié en 1993, ce test combine la facilité de travail avec un organisme modèle simple et la lecture directe de la viabilité cellulaire³. La viabilité est en corrélation avec la façon dont les splicéosomes dans ces cellules peuvent reconnaître et épisser la transcription du rapporteur.

Ce test de croissance du cuivre est plus communément appelé le test ACT1-CUP1. Le nom ACT1-CUP1 provient des deux gènes fusionnés pour créer un rapporteur d’efficacité d’épissage. ACT1 est le gène de l’actine de la levure, qui est fortement exprimé et a un intron efficacement épissé ^4,5. Cup1p est un chélateur du cuivre qui séquestre le cuivre dans la cellule pour éviter les interférences avec les fonctions cellulaires régulières ^6,7,8. Le rapporteur ACT1-CUP1 contient ces gènes dans l’ordre de telle sorte que CUP1 est dans le cadre de lecture approprié seulement si l’épissage pré-ARNm de l’intron d’ACT1 se produit (Figure 1). La protéine de fusion résultante contient les 21 premiers acides aminés de l’actine et la protéine Cup1p pleine longueur, ce qui augmente la viabilité de la levure dans un environnement riche en cuivre³. Ainsi, une augmentation de la quantité d’épissage du rapporteur entraîne une concentration plus élevée de Cup1p et une résistance au cuivre plus élevée (Figure 1). En comparaison avec d’autres gènes rapporteurs, CUP1 a un impact sur la viabilité cellulaire même à de faibles niveaux, a une large plage de sensibilité et peut être utilisé pour sélectionner directement pour l’épissage des mutations ^3,6,7. De plus, CUP1 n’est pas essentiel pour la croissance standard des levures, et donc l’homéostasie cellulaire n’est pas affectée lors de la configuration de ce test. Complémentaire aux tests de délétion ou de croissance en température, ACT1-CUP1 fournit des informations sur les effets sur l’épissage dans des conditions de croissance de levure par ailleurs optimales.

Le splicéosome reconnaît son substrat à travers trois séquences introniques, à savoir le site d’épissure 5' (5' SS), le site ramifié (BS) et le site d’épissure 3' (3' SS). De nombreux rapporteurs ACT1-CUP1 ont été générés contenant des séquences non consensuelles sur ces sites. Une sélection des rapporteurs ACT1-CUP1 les plus courants est présentée à la figure 1 et au tableau 1. Comme le splicéosome interagit avec chaque site d’épissure de manière unique à différents moments du cycle d’épissage, la robustesse du splicéosome peut être testée à différentes étapes en fonction du rapporteur non consensuel utilisé. Les rapporteurs non consensuels sont nommés pour la position mutée dans l’intron et la base sur laquelle il a été muté. Par exemple, A3c est un rapporteur avec une mutation au niveau du 5' SS, en particulier la position 3 de l’adénosine consensuelle à une cytosine. Ce rapporteur interagira fortement avec les mutations des splicéosomes qui ont un impact sur la sélection et l’utilisation du 5' SS. Dans leur étude initiale, Lesser et Guthrie ont déterminé quelles mutations 5' SS inhibaient l’épissage³. Plus tard la même année, des rapporteurs non consensuels sur les trois sites d’épissage ont été publiés par Burgess et Guthrie dans un écran suppresseur de mutations dans l’ATPase Prp16p⁹. En comparant les rapporteurs de consensus à ceux qui ne le font pas, le test ACT1-CUP1 a été une clé importante pour comprendre la robustesse et la sélectivité du splicéosome de levure et pour déduire la fonction des splicéosomes d’autres eucaryotes.

Comme les rapporteurs ACT1-CUP1 non consensuels sensibilisent le spliceosome à une perturbation supplémentaire, l’impact d’une mutation du facteur d’épissage unique peut être caractérisé par les rapporteurs qu’elle impacte positivement ou négativement. Cela a été appliqué à l’épissage des questions de recherche de diverses façons. Tout d’abord, le test ACT1-CUP1 peut et a été utilisé comme criblage génétique des mutations dans les facteurs d’épissage. Par exemple, Prp8p, la plus grande protéine d’épissage, sert de plate-forme sur laquelle le noyau d’ARN du spliceosome catalyse la réaction d’épissage. Cela a été déduit, en partie, de la façon dont les mutants Prp8p ont amélioré ou réduit l’épissage de différents rapporteurs ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. D’autres composants protéiques du spliceosome ont également été étudiés à l’aide d’ACT1-CUP1, notamment Hsh155p, Cwc2p, Cef1p et Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Les seuils énergétiques de Prp16p et de quatre autres ATPases impliquées dans la transition splicéosomale ont également été étudiés avec ce test 9,26,27,28,29,30. Les petits ARN nucléaires (ARNsn) ont également été largement étudiés en utilisant ACT1-CUP1 pour identifier les séquences pré-ARNm qu’ils coordonnent et les changements dans la structure secondaire que les ARNn subissent pendant l’épissage 3,31,32,33,34,35,36,37.

Le test ACT1-CUP1 nécessite une souche de levure où toutes les copies du gène CUP1 ont été éliminées. Comme CUP1 peut avoir un numéro d’exemplaire élevé ^6,38, la préparation d’une souche knock-out complète peut nécessiter plusieurs tours ou un dépistage approfondi. En conséquence, les souches de levure cup1Δ ont souvent été partagées entre les laboratoires, tout comme les journalistes.

Si une ou plusieurs mutations d’un facteur d’épissage sont évaluées à partir d’une copie plasmidique, le gène de type sauvage de ce facteur doit être éliminé. De plus, le fond de levure devrait permettre la sélection d’au moins deux plasmides, l’un contenant un rapporteur ACT1-CUP1, historiquement sur un plasmide de sélection de nutriments leucine, et l’autre contenant une mutation ou une perturbation dans la machinerie d’épissage qui sera étudiée (Figure 2). Habituellement, dans un seul essai, plusieurs souches de levure, chacune portant la perturbation d’épissage de requête (QSP) et un rapporteur différent, testeront l’impact de la requête sur l’épissage.

Les variables indépendantes du test ACT1-CUP1 permettent à un chercheur d’évaluer la gravité d’un QSP. Ces variables indépendantes sont la concentration de cuivre et la sélection de plusieurs rapporteurs d’épissage non consensuels. Tout d’abord, comme les souches de levure sont cultivées sur des plaques contenant une gamme de concentrations de cuivre (Figure 2), la mise en place du test comprend la sélection du gradient de concentrations utilisé. Les études peuvent utiliser un gradient de concentration de cuivre pour obtenir une lecture initiale de la viabilité, puis répéter l’essai avec un gradient plus fin pour identifier les différences subtiles de viabilité. La deuxième variable est la large gamme de rapporteurs ACT1-CUP1 qu’il est possible de tester (Figure 1 et Tableau 1). Si le QSP a un impact différent sur la viabilité de la levure en présence d’un rapporteur non consensuel par rapport à un type sauvage, on peut conclure que le QSP affecte une étape de l’épissage ou une région du spliceosome importante lors de la reconnaissance ou du traitement de cette région de l’intron.

La boîte à outils de levure est vaste et le test ACT1-CUP1 fait partie intégrante de la recherche sur l’épissage. Le test ACT1-CUP1 est souvent réalisé parallèlement à une analyse génétique, structurelle et/ou biochimique plus approfondie sur l’impact d’un QSP. Comme ces études plus détaillées ont généralement une procédure plus longue et / ou un prix plus élevé, une approche fréquente consiste à rechercher d’abord des mutants intéressants avec ACT1-CUP1.

Fourni ici est un protocole de dosage ACT1-CUP1, y compris la préparation sur plaque de cuivre. Ce test fournit aux chercheurs une réponse initiale à l’effet d’un QSP sur l’épissage et quelles régions introniques sont les plus touchées par la perturbation.

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Protocole

1. Construction de souches de levure

1. Générer ou obtenir une souche de S. cerevisiae dont le fond comprend leu2 et cup1Δ. Pour générer ce fond, utilisez la méthode de levure bien établie qui utilise de l’acétate de lithium et de l’ADN simple brin³⁹.
   NOTE: Les souches de levure haploïdes peuvent contenir une, deux ou plusieurs copies de CUP1 ^6,38. Se référer à l’information génomique pour la souche de levure sélectionnée lors de la conception d’amorces knock-out pour flanquer l’emplacement du gène CUP1.
2. Effectuer une transformation de levure pour incorporer le QSP soit par incorporation génomique, soit sur un plasmide. Utilisez un protocole bien établi tel que ceux décrits dans les recherches précédentes^40,41,42.
3. Effectuer une transformation de levure avec la ou les souches résultantes de l’étape 1.2. pour ajouter le plasmide rapporteur ACT1-CUP1 souhaité.
   NOTE: Les cellules doivent être maintenues sur des plaques et des milieux de goutte de leucine (-Leu) pour assurer la rétention des plasmides rapporteurs ACT1-CUP1 après cette transformation.
4. Effectuez les étapes 1.2. et 1.3. pour chaque QSP et chaque plasmide rapporteur ACT1-CUP1 à tester, y compris les souches témoins.

2. Préparation de la plaque de cuivre

1. Choisissez une plage de concentration de cuivre qui convient aux déclarants à tester (voir le tableau 1 pour connaître la létalité des déclarants fréquemment utilisés).
   NOTA: Un exemple d’une plage complète de concentration de cuivre est 30 concentrations différentes de cuivre de 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM et 2,5 mM Cu²⁺.
2. Fabriquer une solution mère de 1 M CuSO₄ et filtrer stérile à travers un filtre stérile PES (polyéthersulfone) de 0,22 μm.
3. Par plaque de cuivre désirée, préparer une dilution de 2 mL du stock de CuSO₄ dans de l’eau stérile.
   NOTE: Comme la plaque avec 0 mM Cu 2+ sera toujours analysée et imagée comme référence, il est recommandé de faire deux plaques 0 mM Cu²⁺, une au début et une à la fin de l’étape de placage (étape 3.4.).
   1. Calculer la quantité de stock pour la concentration finale de cuivre désirée dans 40 mL du volume de la plaque (tableau supplémentaire 1).
   2. Ajouter la quantité calculée d’eau stérile et 1 M de CuSO₄ dans un tube stérile de 2 mL.
4. Verser les plaques pour le test ACT1-CUP1.
   NOTA : Une solution de rechange au protocole ci-dessous consiste à combiner d’abord le milieu et la gélose dans un grand récipient et l’aliquote après autoclavage dans des contenants plus petits pour obtenir des concentrations de cuivre différentes pour chaque plaque. Quelle que soit la méthode choisie, il est important de s’assurer que la concentration du milieu est cohérente entre toutes les plaques, même si chacune a une concentration de cuivre différente.
   1. Étiquetez chaque plaque vide à verser avec la concentration finale de cuivre qu’elle contiendra. Préparer au moins une plaque carrée par concentration de cuivre à tester.
   2. Étiqueter une bouteille de 100 ml par concentration de cuivre à analyser.
   3. À chaque flacon, ajouter 790 mg de gélose (gélose 2 % p/v) et une barre à mélanger.
   4. Dans un grand bécher, mélanger le milieu de croissance -Leu pour toutes les plaques de cuivre à couler. Par plaque à préparer, dissoudre 265 mg de levure azotée base (YNB) et 64 mg de mélange de goutte moins la leucine (et tout autre nutriment qui peut être nécessaire pour maintenir le plasmide QSP dans les cellules) dans 34 mL d’eau désionisée.
   5. Ajouter 34 mL de la solution de milieu de croissance -Leu à chaque bouteille préparée de 100 ml et bouchon avec du papier d’aluminium. Étiqueter la feuille avec la concentration de cuivre prévue.
   6. Autoclave pour stériliser et dissoudre la gélose en utilisant le cycle liquide recommandé pour l’autoclave.
   7. Le plus rapidement possible, ajoutez 4 mL de glucose à 20 % p/v (filtré stérile) dans chaque flacon.
   8. Faire correspondre les étiquettes et ajouter les dilutions de 2 mL de CuSO₄ dans le flacon prévu.
      REMARQUE: Comme des dizaines de plaques de cuivre peuvent être fabriquées en même temps, chacune avec une concentration différente, étiqueter clairement toutes les bouteilles, tubes et plaques avec la concentration de cuivre prévue évitera toute confusion lors du coulage de la plaque.
   9. Utilisez une plaque d’agitation pour mélanger pendant ~30 s et versez ou pipetez 35 ml dans la plaque étiquetée, en évitant les bulles. Laisser refroidir avant de stocker ou d’utiliser.
      NOTE: Fréquemment, les plaques sont fabriquées 1 jour ou 2 jours avant le test et stockées à 4 ° C jusqu’à quelques heures avant utilisation. Les plaques doivent être à température ambiante (RT) avant le début du placage (étape 3.4.).

3. Test ACT1-CUP1

1. Étaler les souches souhaitées sur des plaques -Leu.
   REMARQUE: Si vous travaillez à partir de stocks cryogéniques, il faut veiller à ce que les cellules soient suffisamment revitalisées avant le placage. Une procédure recommandée pour cela est de strier à partir du stock cryogénique et de le laisser croître pendant 3-5 jours à 30 ° C. Ensuite, reprenez un petit échantillon et laissez-le pousser pendant encore 2-3 jours à 30 ° C.
2. Cultiver des cultures pendant la nuit dans 10 ml de média.
   1. Préparer les milieux de croissance -Leu en utilisant les mêmes ratios que ceux décrits à l’étape 2.4.2. Par 10 mL de milieu, ajouter 66 mg d’azote base de levure (YNB) et 16 mg de mélange d’abandon moins leucine à 9 mL d’eau désionisée. Passez à travers un filtre stérile PES de 0,22 μm.
   2. Par souche de levure, ajouter 9 mL de milieu de croissance -Leu et 1 mL de glucose à 20 % p/v (filtré stérile) dans un tube conique stérile de 50 mL.
   3. À l’aide d’un bâtonnet stérile ou d’un embout de pipette, recueillir un petit échantillon de levure (~1 mm rond) et inoculer le média.
   4. Secouer toutes les cultures pendant la nuit à 180 tr/min et 30 °C.
      REMARQUE: Si disponible, les rotateurs peuvent être utilisés à la place d’un agitateur.
3. Diluer les souches à une DO₆₀₀ 0,5 ± 0,05 dans 10% de glycérol.
   1. Par souche, ajouter 100 μL de culture dans une cuvette contenant 900 μL d’eau.
   2. Mesurez le OD₆₀₀ avec un spectrophotomètre.
   3. Calculer la dilution requise à une DO₆₀₀ de 0,5 dans un volume final de 2 mL.
   4. Diluer chaque souche à OD₆₀₀ 0,5 dans 10% de glycérol (stérile).
   5. Remesurez le OD₆₀₀ pour confirmer que la densité de la cellule se situe dans la plage souhaitée de 0,5 ± 0,05.
4. Plaquez les contraintes sur les plaques de cuivre.
   REMARQUE: Une variété de méthodes peuvent être utilisées pour plaquer les déformations, y compris le pipetage manuel de volumes de 5 à 10 μL, l’utilisation d’un pipetor à répétition ou multicanal, ou l’estampage avec un réplicateur de broches. Cette dernière méthode est décrite ci-dessous, bien que la plupart des étapes soient similaires quelle que soit la méthode.
   1. Installez un lieu de travail stérile et un brûleur Bunsen allumé.
   2. Pour un réplicateur à 48 broches, pipeter 200 μL de chaque souche diluée dans un puits séparé d’une plaque de 96 puits. Remplissez les espaces vides de la grille 6 x 8 avec 200 μL de glycérol à 10% (stérile).
      NOTA : Un exemple de schéma de placage pour neuf souches de levure se trouve dans le tableau supplémentaire 2.
   3. Trempez le réplicateur dans une boîte peu profonde d’éthanol à 95 % (v/v) et à la flamme pour stériliser. Laissez refroidir pendant au moins 2 minutes après l’extinction de la flamme pour éviter que la chaleur ne choque les cellules.
   4. Placez quatre plaques près du brûleur et retirez les couvercles.
   5. Trempez le réplicateur dans la plaque de 96 puits et soulevez-le d’un mouvement rapide.
   6. Placer doucement sur la plaque et balancer légèrement d’avant en arrière pour faciliter un bon transfert.
   7. Soulevez en un mouvement rapide et placez exactement dans la même orientation dans la plaque de 96 puits.
   8. Répétez l’opération jusqu’à trois autres plaques. Répétez le processus consistant à tremper le réplicateur dans de l’éthanol, à le brûler pour stériliser et à attendre de refroidir toutes les quatre plaques.
   9. Une fois qu’une plaque a été plaquée, déplacez-vous d’un mouvement doux sur le côté, mais toujours dans le parapluie de stérilisation de la flamme.
      NOTE: Il est recommandé de faire les dilutions de levure et le placage près d’une flamme. Les plaques peuvent facilement être contaminées pendant le séchage.
   10. Laissez les assiettes sécher complètement avant de placer les couvercles, généralement 3-5 min.
   11. Incuber les assiettes pendant 3 jours à 30 °C.

4. Collecte et analyse des données

1. Retirez les plaques de l’incubateur et inspectez-les visuellement.
2. Enregistrez les images des plaques avec un appareil photo disponible ou un autre système d’imagerie numérique.
3. Enregistrer (ou score) pour chaque souche la dernière concentration de cuivre croissance visible est observée.
   REMARQUE: Les cellules sont capables de s’épisser et de rester viables jusqu’à cette concentration. Pour plus de cohérence, utilisez toujours la même méthode, à l’œil nu ou à partir des images sur plaque, pour obtenir la dernière concentration de cuivre viable. De très petites colonies sont parfois visibles à l’œil nu mais pas sur l’image. La différence entre l’inspection visuelle directe ou l’enregistrement à partir d’images est faible, généralement une étape dans le gradient. Comme les images des colonies sont souvent utilisées dans les publications, il est recommandé de noter les images.
4. Combinez les données de plusieurs tests ACT1-CUP1 pour la même souche afin de tirer des conclusions sur la façon dont le QSP affecte l’épissage.
   NOTE: Les chiffres de publication montrent habituellement des images des colonies de levure à une concentration de 0 mM Cu²⁺ , la dernière concentration de cuivre viable et la concentration subséquente où la colonie est morte. Les données peuvent également être affichées sous forme de graphique à barres avec des barres d’erreur pour l’écart type entre les réplications. Les données n’ont pas besoin d’être normalisées, mais peuvent l’être en réglant la viabilité du contrôle du facteur d’épissage WT à 1 et en comparant l’effet de la ou des mutations introduites.

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Résultats

Les tests de croissance, comme ACT1-CUP1, nécessitent l’évaluation visuelle et comparative de plusieurs colonies. Ici, chaque souche a été cultivée jusqu’à saturation pendant une nuit, diluée à une DO₆₀₀ de 0,5 et plaquée sur 20 plaques contenant une gamme de concentrations de cuivre de 0 mM à 1,1 mM CuSO₄ (figure 3). Cette fourchette est inférieure à celle indiquée dans le protocole, car elle a permis l’évaluation complète de l’impact des rapport...

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Discussion

ACT1-CUP1 est un test de croissance, et il faut veiller à ce que les différences de croissance observées ne puissent être attribuées qu’à des défauts d’épissage. Toutes les souches doivent être manipulées de la même manière avant le placage, y compris avec une longueur et un type de croissance et des conditions d’entreposage similaires. Si vous utilisez des souches sensibles à la température, les dosages ACT1-CUP1 ne doivent être effectués que dans des conditions où ces souches se développent de m...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-138	Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	07-201-332	Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate	Fisher Scientific	07-200-760	Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol	Fisher Scientific	22-032-600	Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm)	CellTreat Scientific Products	229707	Or comparable item from a different manufacturer.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Any molecular grade agar will work.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner	Humboldt	PN6200.1	Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter	VWR	490005-906	Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate	Fisher Scientific	LC134051	Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera	Nikon	D3500	Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp	Fisher Scientific	05-769-7Q	Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp	Fisher Scientific	12-000-101	Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-51	Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator	VP Scientific	VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes	VWR	97000-590	Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker	JEIO Tech	IST-3075	Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer	Biowave	80-3000-45	Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates	VWR	102091-156	Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate	Fisher Scientific	11-520-16S	Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base	USBiological Life Sciences	Y2025	Or comparable item from a different manufacturer.