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요약

구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.

초록

스플라이세오솜 또는 그 기질에 도입된 돌연변이는 스플라이세오솜 기능의 복잡성에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 질병과 관련이 있든 기능적으로 선택되었든, 이러한 돌연변이의 대부분은 모델 유기체 사카로마이세스 세레비시아에 (효모)에서 성장 분석을 사용하여 연구되었습니다. 접합 특이적 구리 성장 분석법 또는 ACT1-CUP1 분석은 표현형 수준에서 돌연변이에 대한 포괄적인 분석을 제공합니다. ACT1-CUP1 분석은 올바르게 접합될 때 구리 내성을 부여하는 리포터를 활용합니다. 따라서, 구리의 존재하에서, 효모 생존율의 변화는 스 플라이 싱을 통한 mRNA 생산의 변화와 관련이있다. 전형적인 실험에서, 효모 스플라이세오솜은 스플라이싱에 대한 상승적 또는 반대적 영향을 검출하기 위해 상이한 비합의 스플라이싱 리포터 및 관심 있는 스플라이싱 인자 돌연변이에 도전한다. 여기에서는 동판 준비, 효모 세포 도금 및 데이터 평가에 대한 전체 설명이 제공됩니다. ACT1-CUP1 리포터의 다양성을 강조하는 다양한 무료 실험이 설명됩니다. ACT1-CUP1 분석은 돌연변이 효과의 직접적인 판독과 현장에서의 지속적인 사용으로 인한 비교 가능성 덕분에 접합 도구 상자에서 편리한 도구입니다.

서문

스플라이세오솜은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA)1,2에서 비코딩 영역인 인트론의 제거를 촉매하는 대형 생물학적 기계입니다. 거의 100 개의 단백질 중 1 개와 5 개의 비 코딩 RNA에서 단일 점 돌연변이의 효과를 특성화하는 것은 단백질 또는 RNA를 분리 할 때 종종 모호합니다. 돌연변이된 구성 요소의 기능 변화는 완전히 기능하는 스플라이세오솜의 맥락에서 생체 내에서 가장 잘 평가될 수 있습니다.

여기에 설명된 구리 성장 분석은 사카로마이세스 세레비시아에 또는 신진 효모의 접합 효율에 대한 빠른 척도입니다. C.F. Lesser와 C. Guthrie가 개발하고 1993년에 발표한 이 분석은 간단한 모델 유기체로 작업하는 용이성과 세포생존율의 간단한 판독을 결합합니다3. 생존력은 이들 세포의 스플라이세오좀이 리포터 전사체를 얼마나 잘 인식하고 접합할 수 있는지와 상관관계가 있다.

이 구리 성장 분석은 더 일반적으로 ACT1-CUP1 분석이라고 합니다. ACT1-CUP1이라는 이름은 접합 효율의 리포터를 만들기 위해 융합된 두 유전자에서 유래했습니다. ACT1은 효모의 액틴 유전자로 발현이 높고 효율적으로 접합된 인트론 4,5를 가지고 있습니다. Cup1p는 규칙적인 세포 기능 6,7,8에 대한 간섭을 방지하기 위해 세포에서 구리를 격리하는 구리 킬레이터입니다. ACT1-CUP1 리포터는 ACT1 인트론의 pre-mRNA 스플라이싱이 발생하는 경우에만 CUP1이 적절한 판독 프레임에 있도록 이러한 유전자를 순서대로 포함합니다(그림 1). 생성 된 융합 단백질은 액틴의 처음 21 개 아미노산과 구리가 풍부한 환경에서 효모 생존력을 증가시키는 전장 Cup1p 단백질을 함유한다3. 따라서 리포터의 접합량이 증가하면 Cup1p 농도가 높아지고 구리 저항이 높아집니다(그림 1). 다른 리포터 유전자와 비교하여 CUP1은 낮은 수준에서도 세포 생존율에 영향을 미치고 민감도 범위가 넓으며 스플라이싱 돌연변이 3,6,7을 직접 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 CUP1은 표준 효모 성장에 필수적이지 않으므로 이 분석을 설정하는 동안 세포 항상성이 영향을 받지 않습니다. 결실 또는 온도 성장 분석을 보완하는 ACT1-CUP1은 최적의 효모 성장 조건에서 접합에 미치는 영향에 대한 정보를 제공합니다.

스플라이세오솜은 3개의 인트론 서열, 즉 5' 스플라이스 부위(5' SS), 분기 부위(BS) 및 3' 스플라이스 부위(3' SS)를 통해 기판을 인식합니다. 이러한 사이트에서 합의되지 않은 시퀀스를 포함하는 수많은 ACT1-CUP1 리포터가 생성되었습니다. 가장 일반적인 ACT1-CUP1 리포터의 선택은 그림 1 및 표 1에 나와 있습니다. 스플라이세오솜이 스플라이싱 주기의 다른 지점에서 각 스플라이스 부위와 고유하게 상호 작용하기 때문에 스플라이세오솜의 견고성은 비합의 리포터가 사용되는 단계에 따라 다른 단계에서 테스트할 수 있습니다. 합의되지 않은 기자는 인트론 내의 돌연변이된 위치와 그것이 돌연변이된 베이스에 따라 명명됩니다. 예를 들어, A3c는 5' SS, 구체적으로 컨센서스 아데노신에서 시토신으로의 위치 3에 돌연변이를 갖는 리포터이다. 이 리포터는 5' SS 선택 및 사용에 영향을 미치는 스플라이세오솜 돌연변이와 강하게 상호작용할 것이다. 초기 연구에서 Lesser와 Guthrie는 어떤 5' SS 돌연변이가 접합3을 억제하는지 결정했습니다. 같은 해 말, 세 개의 스플 라이스 사이트 모두에서 합의되지 않은 기자들이 ATPase Prp16p9의 돌연변이 억제 스크린에서 Burgess와 Guthrie에 의해 출판되었습니다. 합의를 비합의 보고자와 비교하는 ACT1-CUP1 분석은 효모 스플라이세오솜의 견고성과 선택성을 이해하고 다른 진핵생물의 스플라이세오솜의 기능을 추론하는 데 중요한 열쇠였습니다.

합의되지 않은 ACT1-CUP1 리포터가 스플라이세오솜을 추가 섭동에 민감하게 반응함에 따라 단일 스플라이싱 인자 돌연변이의 영향은 리포터를 통해 긍정적이거나 부정적인 영향을 미치는 것으로 특성화할 수 있습니다. 이것은 다양한 방식으로 연구 질문을 접합하는 데 적용되었습니다. 첫째, ACT1-CUP1 분석은 스플라이싱 인자의 돌연변이에 대한 유전자 스크리닝으로 사용될 수 있고 사용되어 왔다. 예를 들어, 가장 큰 스플라이싱 단백질인 Prp8p는 스플라이세오솜의 RNA 코어가 스플라이싱 반응을 촉매하는 플랫폼 역할을 합니다. 이는 부분적으로 Prp8p 돌연변이체가 상이한 ACT1-CUP1 리포터 10,11,12,13,14,15,16,17의 스플라이싱을 개선하거나 감소시키는 방법을 통해 추론되었다. 스플라이세오솜의 다른 단백질 성분은 또한 Hsh155p, Cwc2p, Cef1p 및 Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25를 포함하는 ACT1-CUP1을 사용하여 조사되었다. Prp16p 및 스플라이세오솜 전이와 관련된 4개의 다른 ATPase에 대한 에너지 역치도 이 분석 9,26,27,28,29,30으로 연구되었습니다. 소형 핵 RNA (snRNA)는 또한 ACT1-CUP1을 사용하여 광범위하게 연구되어 이들이 조정하는 pre-mRNA 서열과 snRNA가 3,31,32,33,34,35,36,37을 접합하는 동안 겪는 2 차 구조의 변화를 식별합니다.

ACT1-CUP1 분석에는 CUP1 유전자의 모든 사본이 녹아웃된 효모 균주가 필요합니다. CUP1은 높은 카피 번호 6,38을 가질 수 있으므로 전체 녹아웃 변형을 준비하려면 여러 라운드 또는 광범위한 스크리닝이 필요할 수 있습니다. 결과적으로 cup1Δ 효모 균주는 종종 기자와 마찬가지로 실험실 간에 공유되었습니다.

스플라이싱 인자의 돌연변이가 플라스미드 사본에서 평가되는 경우 이 인자에 대한 야생형 유전자를 녹아웃해야 합니다. 또한, 효모 배경은 적어도 두 개의 플라스미드를 선택할 수 있어야 하는데, 하나는 역사적으로 류신 영양소 선택 플라스미드에 ACT1-CUP1 리포터를 포함하고, 다른 하나는 연구될 스플라이싱 기계에서 돌연변이 또는 섭동을 포함합니다(그림 2). 일반적으로 단일 분석에서 각각 쿼리 접합 섭동(QSP)과 다른 리포터를 운반하는 여러 효모 균주가 질의가 접합에 미치는 영향을 테스트합니다.

ACT1-CUP1 분석의 독립 변수를 통해 연구자는 QSP의 심각도를 평가할 수 있습니다. 이러한 독립 변수는 구리의 농도와 여러 비합의 접합 보고자의 선택입니다. 첫째, 효모 균주가 다양한 구리 농도를 포함하는 플레이트에서 성장함에 따라(그림 2), 분석 설정에는 사용된 농도의 구배를 선택하는 것이 포함됩니다. 연구는 코스 구리 농도 구배를 활용하여 생존력의 초기 판독값을 얻은 다음 미세한 구배로 분석을 반복하여 미묘한 생존력 차이를 식별할 수 있습니다. 두 번째 변수는 테스트할 수 있는 광범위한 ACT1-CUP1 리포터입니다(그림 1 및 표 1). QSP가 비합의 리포터 대 야생형의 존재 하에 효모 생존율에 다르게 영향을 미치는 경우, QSP가 인트론의 해당 영역을 인식하거나 처리하는 동안 중요한 스플라이세오솜의 단계 또는 스플라이세오솜의 영역에 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있습니다.

효모 도구 상자는 광범위하며 ACT1-CUP1 분석은 접합 연구의 필수적인 부분입니다. ACT1-CUP1 분석은 종종 QSP의 영향에 대한 보다 심층적인 유전적, 구조적 및/또는 생화학적 분석과 함께 수행됩니다. 이러한 보다 상세한 연구는 일반적으로 더 긴 절차 및/또는 더 높은 가격표를 가지고 있기 때문에 빈번한 접근 방식은 먼저 ACT1-CUP1을 가진 흥미로운 돌연변이를 스크리닝하는 것입니다.

여기에는 동판 준비를 포함한 ACT1-CUP1 분석 프로토콜이 제공됩니다. 이 분석은 연구자에게 접합에 대한 QSP의 영향과 섭동의 영향을 가장 많이 받는 인트로닉 영역에 대한 초기 답변을 제공합니다.

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프로토콜

1. 효모 균주 건설

  1. 배경에 leu2 및 cup1Δ가 포함된 S. 세레비시아에 균주를 생성하거나 얻습니다. 이러한 배경을 생성하려면 리튬 아세테이트와 단일 가닥 DNA39를 사용하는 잘 확립된 효모 방법을 사용하십시오.
    참고: 반수체 효모 균주는 CUP1 6,38의 사본 1개, 2개 또는 그 이상을 포함할 수 있습니다. CUP1 유전자 위치의 측면에 녹아웃 프라이머를 설계할 때 선택한 효모 균주에 대한 게놈 정보를 참조하십시오.
  2. 효모 형질전환을 수행하여 게놈 혼입 또는 플라스미드를 통해 QSP를 통합합니다. 이전 연구40,41,42에 설명된 것과 같은 잘 확립된 프로토콜을 사용하십시오.
  3. 단계 1.2에서 생성된 균주로 효모 형질전환을 수행합니다. 원하는 ACT1-CUP1 리포터 플라스미드를 추가한다.
    참고: 세포는 이 형질전환 후 ACT1-CUP1 리포터 플라스미드의 머무름을 보장하기 위해 류신 드롭아웃(-Leu) 플레이트 및 배지에서 유지되어야 합니다.
  4. 1.2단계를 수행합니다. 및 1.3. 각 QSP 및 각각의 ACT1-CUP1 리포터에 대해 시험될 플라스미드를 포함하여, 대조군 균주를 포함한다.

2. 동판 준비

  1. 검사할 리포터에 적합한 구리 농도 범위를 선택합니다(자주 사용하는 리포터의 치사율은 표 1 참조).
    참고: 포괄적인 구리 농도 범위의 예는 0 mM, 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM 및 2.5 mMCu2+.
  2. 0.22 μm PES (폴리 에테르 술폰) 멸균 필터를 통해 1 M CuSO4 및 멸균 필터의 저장 용액을 만든다.
  3. 원하는 구리 플레이트 당, 멸균수에서CuSO4 스톡의 2 mL 희석액을 준비한다.
    알림: 0 mM Cu 2 +를 갖는 플레이트는 항상 기준으로 분석되고 이미징 될 것이므로 도금 단계의 시작과 끝에 하나씩 두 개의 0 mM Cu2 + 플레이트를 만드는 것이 좋습니다 (단계 3.4).
    1. 플레이트 부피의 40mL에서 원하는 최종 구리 농도에 대한 재고량을 계산합니다(보충 표 1).
    2. 계산된 양의 멸균수 및 1 MCuSO4 스톡을 멸균된 2 mL 튜브에 첨가한다.
  4. ACT1-CUP1 분석을 위한 붓는 플레이트.
    참고: 아래 프로토콜의 대안은 처음에 배지와 한천을 큰 용기에 결합하고 오토클레이빙 후 분취량을 더 작은 용기에 결합하여 각 플레이트에 대해 다른 구리 농도를 달성하는 것입니다. 어떤 방법을 사용하든 각각 다른 구리 농도를 가지고 있음에도 불구하고 모든 플레이트 간에 매체 농도가 일관되도록 하는 것이 중요합니다.
    1. 부을 각 빈 접시에 포함될 최종 구리 농도를 표시합니다. 테스트 할 구리 농도 당 적어도 하나의 정사각형 플레이트를 준비하십시오.
    2. 테스트할 구리 농도당 100mL 병에 라벨을 붙입니다.
    3. 각 병에 790mg의 한천 (2 % w / v 한천)과 교반 막대를 첨가하십시오.
    4. 큰 비커에서 부을 모든 동판에 대해 -Leu 성장 배지를 결합합니다. 만들 플레이트당 효모 질소 염기(YNB) 265mg과 탈락 믹스 64mg에서 류신(및 세포에서 QSP 플라스미드를 유지하는 데 필요할 수 있는 기타 영양소)을 뺀 34mL의 탈이온수에 녹입니다.
    5. 34mL의 -Leu 성장 배지 용액을 각각 준비된 100mL 병에 넣고 알루미늄 호일로 캡을 씌운다. 의도한 구리 농도로 호일에 라벨을 붙입니다.
    6. 오토클레이브는 오토클레이브에 권장되는 액체 사이클을 사용하여 한천을 살균하고 용해합니다.
    7. 가능한 한 빨리 각 병에 4mL의 20% w/v 포도당(멸균 여과)을 추가합니다.
    8. 라벨을 일치시키고 CuSO4 의 2mL 희석액을 의도 한 병에 첨가하십시오.
      알림: 각각 농도가 다른 수십 개의 동판을 동시에 만들 수 있으므로 모든 병, 튜브 및 플레이트에 의도한 구리 농도로 명확하게 라벨을 붙이면 접시를 붓는 동안 혼동을 방지할 수 있습니다.
    9. 교반 플레이트를 사용하여 ~30초 동안 혼합하고 거품을 피하면서 라벨이 부착된 플레이트에 35mL를 붓거나 피펫합니다. 보관하거나 사용하기 전에 식히십시오.
      참고: 종종, 플레이트는 분석 1일 또는 2일 전에 만들어지고 사용 몇 시간 전까지 4°C에서 보관됩니다. 플레이트는 도금이 시작되기 전에 실온 (RT)에 있어야합니다 (단계 3.4).

3. ACT1-CUP1 분석

  1. -Leu 플레이트에 원하는 균주를 제거합니다.
    알림: 냉동 재고로 작업하는 경우 도금 전에 셀이 보관에서 충분히 되살아나도록 주의해야 합니다. 이에 대한 권장 절차는 극저온 주식에서 줄무늬를 만들어 30 ° C에서 3-5 일 동안 자라게하는 것입니다. 그런 다음 작은 견본을 고정하고 30 ° C에서 2-3 일 더 자라게합니다.
  2. 10mL의 배지에서 하룻밤 배양액을 성장시킵니다.
    1. 단계 2.4.2에 기재된 것과 동일한 비율을 사용하여 -Leu 성장 배지를 준비한다. 배지 10mL당 효모 질소 염기(YNB) 66mg과 류신을 뺀 드롭아웃 혼합물 16mg을 탈이온수 9mL에 추가합니다. 0.22μm PES 멸균 필터를 통과합니다.
    2. 효모 균주당 9mL의 -Leu 성장 배지와 1mL의 20% w/v 포도당(멸균 여과)을 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
    3. 멸균 스틱 또는 피펫 팁을 사용하여 효모의 작은(~1mm 원형) 견본을 수집하고 배지를 접종합니다.
    4. 모든 밤새 배양물을 180 rpm 및 30°C에서 흔들어준다.
      알림: 가능한 경우 셰이커 대신 회전 장치를 사용할 수 있습니다.
  3. 균주를OD600 0.5 ± 0.05 in 10% 글리세롤로 희석한다.
    1. 균주당 900μL의 물이 포함된 큐벳에 100μL의 배양액을 추가합니다.
    2. 분광 광도계로 OD600 을 측정합니다.
    3. 2mL의 최종 부피에서 0.5의 OD600 에 필요한 희석을 계산합니다.
    4. 각 균주를OD600 0.5 in 10% 글리세롤(멸균)로 희석한다.
    5. OD600을 재측정하여 셀 밀도가 원하는 범위인 0.5 ± 0.05 내에 있는지 확인합니다.
  4. 구리판에 변형을 도금하십시오.
    참고: 5-10 μL 부피의 수동 피펫팅, 반복 또는 다중 채널 피펫터 사용 또는 핀 리플리케이터를 사용한 스탬핑 등 다양한 방법을 사용하여 균주를 도금할 수 있습니다. 이 마지막 방법은 아래에 설명되어 있지만 방법에 관계없이 대부분의 단계는 유사합니다.
    1. 멸균 작업 장소와 불이 켜진 분젠 버너를 설치하십시오.
    2. 48핀 리플리케이터의 경우, 희석된 각 균주 200μL를 96웰 플레이트의 개별 웰에 피펫팅합니다. 6 x 8 그리드의 빈 공간을 200 μL의 10 % 글리세롤 (멸균)로 채 웁니다.
      참고: 9개의 효모 균주에 대한 도금 방식의 예는 보충 표 2에 있습니다.
    3. 복제기를 95%(v/v) 에탄올과 화염이 담긴 얕은 접시에 담가 살균합니다. 열에 셀에 충격을 주지 않도록 화염이 꺼진 후 최소 2분 동안 식히십시오.
    4. 버너 근처에 4 개의 판을 놓고 뚜껑을 제거하십시오.
    5. 복제기를 96웰 플레이트에 담그고 한 번의 빠른 동작으로 들어 올립니다.
    6. 접시에 부드럽게 놓고 좋은 이동을 용이하게 하기 위해 앞뒤로 가볍게 흔듭니다.
    7. 한 번의 빠른 동작으로 들어 올려 96웰 플레이트에 정확히 같은 방향으로 놓습니다.
    8. 최대 3개의 다른 플레이트에 대해 반복합니다. 복제기를 에탄올에 담그고 불타서 살균하고 4 개의 플레이트마다 냉각을 기다리는 과정을 반복하십시오.
    9. 플레이트를 도금한 후 측면으로 부드럽게 움직이되 여전히 화염의 살균 우산 내에서 움직입니다.
      알림: 효모 희석과 화염 근처에서 도금하는 것이 좋습니다. 플레이트는 건조 중에 쉽게 오염될 수 있습니다.
    10. 뚜껑을 덮기 전에 접시를 완전히 말리십시오(보통 3-5분).
    11. 플레이트를 30°C에서 3일 동안 인큐베이션한다.

4. 자료 수집 및 분석

  1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 육안으로 검사하십시오.
  2. 사용 가능한 카메라 또는 기타 디지털 이미징 시스템으로 플레이트의 이미지를 기록합니다.
  3. 각 균주에 대한 기록(또는 점수)이 관찰되는 마지막 구리 농도 가시적 성장이 관찰된다.
    알림: 세포는 접합할 수 있고 해당 농도까지 생존 상태를 유지할 수 있습니다. 일관성을 위해 항상 눈으로 또는 플레이트 이미지에서 동일한 방법을 사용하여 마지막 실행 가능한 구리 농도를 채점하십시오. 매우 작은 식민지는 때때로 눈으로 볼 수 있지만 이미지에는 보이지 않습니다. 직접 육안 검사 또는 이미지 기록 간의 차이는 작으며 일반적으로 그라디언트의 한 단계입니다. 식민지의 이미지는 출판물에 자주 사용되므로 이미지로 점수를 매기는 것이 좋습니다.
  4. 동일한 균주에 대한 여러 ACT1-CUP1 분석의 데이터를 결합하여 QSP가 접합에 미치는 영향에 대한 결론을 도출합니다.
    참고: 간행물 수치는 일반적으로 0mM Cu2+ 농도, 마지막 실행 가능한 구리 농도 및 콜로니가 죽은 후속 농도에서 효모 콜로니의 이미지를 보여줍니다. 데이터는 반복실험 간 표준 편차에 대한 오차 막대가 있는 막대 그래프로 표시될 수도 있습니다. 데이터는 정규화 할 필요는 없지만 WT 스 플라이 싱 인자 대조군의 생존력을 1로 설정하고 도입 된 돌연변이의 효과를 비교함으로써 정규화 할 수 있습니다.

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결과

ACT1-CUP1과 같은 성장 분석에는 여러 콜로니에 대한 시각적 비교 평가가 필요합니다. 여기서, 각각의 균주를 밤새 포화 상태로 성장시키고, 0.5의OD600 으로 희석하고, 0 mM 내지 1.1 mMCuSO4 의 구리 농도 범위를 함유하는 20개의 플레이트에 도말하였다(도 3). 이 범위는 아래에 사용 및 설명된 QSP 및 ACT1-CUP1 보고자의 영향을 완전히 평가할 수 있으므로 프로토콜에 나?...

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토론

ACT1-CUP1은 성장 분석법이며, 관찰된 성장 차이가 접합 결함에만 기인할 수 있도록 주의해야 합니다. 모든 균주는 유사한 길이와 유형의 성장 및 저장 조건을 갖는 것을 포함하여 도금 전에 유사한 방식으로 취급되어야 합니다. 온도에 민감한 균주를 사용하는 경우 ACT1-CUP1 분석은 해당 균주가 야생형과 비슷하게 자라는 조건에서만 수행해야 합니다. 이와 관련하여, QSP 성분의 경우, 결과의 해석을 ?...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

그림 3-5 생성에 효모 균주와 장비를 사용한 위스콘신-매디슨 대학의 Aaron Hoskins와 Hoskins 실험실 구성원에게 감사드립니다. 원고에 대한 통찰력 있는 의견을 주신 Harpreet Kaur와 Xingyang Fu에게 감사드립니다. 이 논문을 작성, 편집 및 촬영하는 동안 Northwest University의 지원적인 학생, 교직원 및 교수진에게 감사드립니다. 이 방법을 촬영하는 데 도움을 준 Isabelle Marasigan에게 감사드립니다.

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자료

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참고문헌

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